MULTIPLICAREA BACTERIILOR

DINAMICA MULTIPLICRII BACTERIILOR N CULTURI

Se cunosc relativ puine date legate de dinamica multiplicrii populaiilor bacteriene n natur. Multiplicarea n condiii experimentale (de laborator sau industriale) este destul de bine cunoscut.

Exist dou tipuri principale de culturi bacteriene: 1. culturile discontinue (n mediu de cultur nerennoit); se pot realiza n dou variante: asincrone i sincrone 2. culturile continue n mediu de cultur rennoit continuu.

CULTURILE DISCONTINUE ASINCRONE

Creterea bacteriilor este limitat la un volum fix de mediu care nu este rennoit. De cele mai multe ori compoziia mediului este modificat de acumularea produilor de metabolism, putnd deveni la un moment dat necorespunztor pentru cretere. Acest gen de cultivare este folosit curent n laborator, avnd ns o serie de dezavantaje.

Curba de cretere (evoluia) unei populaii bacteriene

Curba de cretere prezint patru faze principale: faza de lag faza de cretere exponenial (logaritmic), faza staionar faza de declin.

faza staionar log. nr celule

faza de declin

faza de log

faza de lag

timp (ore)

Curba de cretere a unei populaii bacteriene

Faza de lag (engl. to lag = a ntrzia)

Numit i faz de laten sau de cretere zero reprezint perioada de timp n care bacteriile introduse ntr-un mediu de cultur se acomodeaz noilor condiii, au o activitate metabolic intens (n special sintez de enzime) i ncep s se multiplice. n cursul acestei faze, numrul bacteriilor din inocul rmne constant, cultura nefiind vizibil macroscopic. Faza de laten este facultativ, apariia ei depinznd de doi factori principali: vrsta bacteriilor inoculate i adaptarea enzimatic a acestora.

Vrsta bacteriilor inoculate n cazul nsmnrii celulelor tinere, de cteva ore, ntr-un mediu nou, faza de lag este extrem de scurt. n cazul culturilor btrne, la care creterea a ncetat de mult, este necesar un timp mai lung pentru ca celulele din inocul s-i refac sistemele enzimatice i metaboliii necesari creterii.

Adaptarea enzimatic a bacteriilor inoculate

n cazul nsmnrii celulelor tinere, aflate n faza de cretere exponenial (logaritmic), ntr-un mediu de cultur nou, cu o compoziie identic cu cel n care au fost cultivate bacteriile din inocul, ele se multiplic spontan, durata fazei de laten fiind foarte scurt. Perioada de lag este prelungit n cazul transferului unor celule cultivate dintr-un mediu bogat ntr-un mediu srac n nutrieni, deoarece celulele trebuie s-i formeze ntregul set de enzime, necesar sintezei tuturor metaboliilor eseniali.

Dac noul mediu de cultur are o compoziie chimic total diferit de cea a mediului din care provin bacteriile nsmnate, faza de lag este foarte lung deoarece majoritatea celulelor nu se pot multiplica pentru c nu gsesc factorii de cretere indispensabili. Perioada de lag este necesar i n cazul celulelor lezate de efectul unor ageni chimici (radiaii, cldura) sau chimici, datorit timpului necesar reparaiei celulare. La sfritul acestei faze, celulele bacteriene cresc foarte mult ca mrime (unele i pot dubla sau tripla dimensiunea) i au un coninut mrit n proteine, ARN i fosfor.

Faza de cretere exponenial (logaritmic) = faz de log

Se caracterizeaz prin multiplicarea continu a bacteriilor. Rata de cretere la nceput se mrete progresiv, devenind maxim i constant ( = max.), iar durata generaiei atinge un minimum constant. Mortalitatea celular este nul, numrul total de celule este egal cu numrul de celule viabile.

n faza de log celulele au cea mai intens activitate metabolic, aceasta reprezentnd perioada de vrf a activitii i eficienei n practica industrial. S-a constatat o sensibilitate mrit a celulelor aflate n faza de cretere exponenial la aciunea agenilor fizici i chimici. De exemplu, radiaiile i numeroase substane antimicrobiene (penicilina) i exercit efectul, interfernd cu una din etapele importante ale procesului de cretere, fiind mai nocive pentru celulele aflate n aceast faz.

Durata fazei exponeniale (cteva ore) este limitat, datorit factorilor limitani care apar n mediul de cultur. n culturile discontinue, la care sursa de C, N, energie scade sub nivelul care asigur creterea maxim sau este pe cale de a fi epuizat, se nregistreaz o perioad de ncetinire a ritmului de cretere. n cazul culturilor continue este posibil meninerea unei populaii n faza exponenial de cretere, indefinit.

Faza staionar
Ca urmare a diminurii substanelor nutritive i a acumulrii produilor toxici de metabolism n mediu, rata de cretere a celulelor scade progresiv pn cnd nceteaz complet. Celula intr n faza staionar, n cursul creia numrul celulelor viabile este maxim, rmnnd constant o perioad de timp. Exist un echilibru ntre numrul celulelor moarte i cel al celulelor rezultate din diviziune.

Multiplicarea bacteriilor n faza staionar nu nceteaz, limitndu-se doar la nlocuirea celulelor moarte, ceea ce nseamn c rata de cretere devine din nou nul. n cursul fazei staionare celulele bacteriene sunt considerate mature, citoplasma mai puin omogen datorit apariiei de incluziuni i acumulrii de substane de rezerv, afinitate normal pentru colorani, prezena sporilor la speciile sporogene. n final numrul celulelor viabile scade progresiv i ncepe declinul culturii.

Faza de declin
ncheie evoluia unei culturi bacteriene realizat n sistem discontinuu. Multiplicarea bacteriilor nceteaz ( < 0) iar rata de mortalitate este constant. Sporadic, celulele rmase vii se mai pot multiplica pe baza substanelor nutritive rezultate din autoliz. Celulele n faza de declin au o morfologie alterat, conin cantiti mari de substane de rezerv. Cultura sfrete prin moartea tuturor celulelor i autosterilizarea ei.

CULTURI SINCRONE
Nu toate celulele unei culturi bacteriene se divid n acelai timp (sincron), astfel nct se ajunge la o populaie heterogen, format din indivizi care nu au aceeai vrst. Pentru o serie de studii morfologice, fiziologice, biochimice i genetice este important s se lucreze pe celule de aceeai vrst s-au realizat culturi speciale, cu cretere i multiplicare sincron a indivizilor populaiei respective.

Sunt cunoscute dou categorii de culturi cu cretere sincron: culturi sincrone toate bacteriile se divid n acelai timp, deoarece iniial au fost selecionate celule de vrste i dimensiuni asemntoare. culturi sincronizate celulele au fost aduse n acelai stadiu de diviziune prin diferite tratamente fizice sau chimice.

Principalul mijloc de obinere a culturilor sincronizate este supunerea populaiilor bacteriene la schimbri ciclice de temperatur. Dac o populaie de Salmonella typhimurium aflat n multiplicare este supus alternativ la temperatura optim de dezvoltare (370 C) i apoi la o temperatur mai sczut (250 C), ntreaga populaie se va divide sincron n timpul scurtei incubri (8 minute) la 370 C. n timpul incubrii (28 minute) la 250 C populaia rmne constant deoarece multiplicarea nu are loc la aceast temperatur.

numr de celule

Curba creterii sincronizate la Salmonella typhimurium

timp (ore)

CULTURI CONTINUE
Procesele de biosintez, industriale sau de laborator, necesit existena bacteriilor n faza exponenial de cretere. Acest lucru nu poate fi realizat timp ndelungat ntr-un volum fix de mediu nerennoit, n care faza exponenial are un numr limitat de generaii, iar condiiile de mediu (concentraia substanelor nutritive sau a O2) devin limitante. n aceste condiii, prelungirea fazei exponeniale se poate realiza numai dac mediul de cultur este rennoit continuu, simultan cu eliminarea produilor de metabolism.

Aparatele n care se realizeaz astfel de culturi se numesc chemostate = sisteme de cultivare deschise, n flux continuu, n care mediul proaspt este adugat n mod continuu, n timp ce o cantitate egal, reprezentnd surplusul de microorganisme i de mediu este ndeprtat. Spre deosebire de cultura static, n care concentraia substratului scade pe msur ce microorganismele se multiplic, n chemostat adugarea mediului proaspt n mod continuu menine concentraia substratului i rata de cretere.

filtru de aer robinet evacuare rezervor de mediu steril

Reprezentarea schematic a unui chemostat

port inoculare

vas de cultur robinet admisie

agitator magnetic vas colector al culturii

Principalul avantaj al culturii continue este posibilitatea de a varia rata de cretere prin modificarea ratei de aprovizionare cu substane nutritive proaspete. n chemostat densitatea populaiei bacteriene i rata de cretere pot fi controlate prin intermediul a doi factori de reglare: rata diluiei i concentraia unui nutrient limitant. Chemostatul asigur n mod continuu o cultur care crete indefinit, cu o vitez constant, n condiii constante, furniznd celule cu proprieti uniforme i activiti fiziologice optime.

Culturile continue se folosesc n practica industrial pentru:

- obinerea biomasei microbiene bogate n

nutrieni; - extragerea unor principii active de la diferite specii de microorganisme (vitamine, enzime etc.).

Condiii pentru creterea bacteriilor

Creterea bacteriilor este influenat de factori: chimici sursele de C, N, P, O, factori de cretere. fizici temperatur, pH, presiune osmotic

Temperatura
Cea mai mare parte a microorganismelor au o dezvoltare optim la temperaturi situate n jurul valorii de 370 C.

Exist ns i bacterii care se pot dezvolta la temperaturi extreme, la care nu pot supravieui majoritatea eucariotelor.

Fiecare specie bacterian se dezvolt la temperaturi minime, optime i maxime particulare. Temperatura minim de cretere cea mai mic temperatur la care are loc creterea. Temperatura optim de cretere temperatura la care bacteriile cresc cel mai bine. Temperatura maxim de cretere temperatura cea mai nalt la care este posibil creterea.

n funcie de domeniul preferat de temperatur, microorganismele pot fi clasificate n trei grupuri:

1. psihrofile: 10 + 200 C 2. mezofile: 10 - 500 C 3. termofile: 40 - 700 C Cea mai mare parte a microorganismelor se dezvolt ntr-un domeniu relativ restrns de temperatur (300 C ntre minim i maxim).

Microorganismele psihrofile
Au fost iniial considerate organismele capabile s se dezvolte la 00 C. Se pot clasifica n dou grupe:

1. Psihrofile propriu-zise
Se dezvolt la 00 C dar au o temperatur optim la 150 C. Sunt sensibile la temperaturi mai mari, majoritatea nedezvoltndu-se la temperatura camerei (250 C).

Cel mai frecvent se dezvolt n abisurile oceanelor sau n anumite regiuni polare. Determin probleme la pstrarea alimentelor la rece.

2. Psihrotrofe
Se dezvolt la 00 C dar au o temperatur optim mai mare, de obicei 20 - 300 C. Nu pot crete la temperaturi mai mari de 400 C. Sunt mai frecvente dect psihrofilele. Deoarece se dezvolt foarte bine la temperatura de refrigerare a alimentelor determin deteriorarea acestora pe timpul conservrii la rece.

Microorganismele mezofile
Sunt cele mai comune microorganisme. Au o temperatur optim de cretere cuprins ntre 25 400 C. Cele adaptate s se dezvolte n corpul animalelor au temperatura optim de cretere egal cu cea a gazdei bacteriile patogene se dezvolt optim la 370 C.

Microorganismele termofile
Sunt capabile s se dezvolte la temperaturi ridicate, majoritatea avnd optimul de dezvoltare la 50 - 600 C (peste temperatura apei fierbini de la robinet). Se dezvolt n apele termale. Nu se pot dezvolta la temperaturi mai mici de 450 C.

Endosporii formai de bacteriile termofile sunt foarte rezisteni la temperaturi ridicate pot supravieui la tratamentele termice practicate n industria alimentar pentru obinerea conservelor. Nu determin degradarea alimentelor. Se gsesc n composturile organice unde temperatura poate ajunge rapid la 50 - 600 C.

Unele arhebacterii au o temperatur optim de cretere de 800 C sau mai mare. Aceste bacterii au fost denumite hipertermofile sau uneori termofile extreme. Majoritatea bacteriilor de acest tip triesc n izvoarele cu ap fierbinte asociate cu activitatea vulcanic. Sulful joac un rol important n metabolismul acestor bacterii.

Recordul de temperatur pentru creterea bacteriilor este de 1100 C, n apropierea vulcanilor submarini (presiunea apei n adncurile oceanelor mpiedic fierberea apei chiar la temperaturi de peste 1000 C).

pH-ul
Majoritatea bacteriilor se dezvolt optim la un pH apropiat de valorile neutre, ntre 6,5 7,5. Foarte puine bacterii cresc n medii acide, cu un pH < 4. Ele se numesc bacterii acidofile, avnd o toleran remarcabil la aciditate.

Ex. Thiobacillus ferrooxidans este o bacterie chemoautotrof care se dezvolt n apele de drenaj ale minelor de crbuni. Oxideaz sulfaii feric i feros pn la H2SO4, supravieuind la pH = 1

Cultivate n condiii de laborator, bacteriile produc acizi care modific pH-ul mediului de cultur, afectnd astfel propria lor dezvoltare. Pentru a neutraliza acizii i a menine pH-ul optim se adaug un tampon chimic n compoziia mediului de cultur (peptone, aminoacizi, fosfai).

Presiunea osmotic
Microorganismele i obin hrana n soluie din mediul nconjurtor, necesitnd din acest motiv ap pentru dezvoltare. Presiunea osmotic ridicat are ca efect scoaterea apei din celul.

Cnd microorganismele se gsesc n medii hipertonice (cu o concentraie mai mare de substane dizolvate comparativ cu interiorul celulei) apare fenomenul de plasmoliz pierderea apei moartea celular.

Ca urmare a plasmolizei membrana plasmatic se ndeprteaz de peretele celular, creterea fiind n acest mod inhibat. Acest fenomen prezint o importan practic n conservarea alimentelor: petele srat, mierea, laptele condensat ndulcit fiind pstrate n acest mod. Concentraii ridicate de sruri sau glucide n mediul extracelular pot inhiba creterea i dezvoltarea bacteriilor.

Exist ns i excepii: bacteriile halofile extreme care se dezvolt n medii cu concentraii ridicate de sruri absolut necesare creterii lor. n acest caz se poate utiliza termenul de halofile obligatorii. Astfel de organisme care se gsesc de pild n apele saline ale Mrii Moarte, necesit pentru dezvoltare concentraii de sare de aproximativ 30 %.

Vibrio vulnificus bacterie moderat halofil

Cele mai comune sunt bacteriile facultativ halofile care nu necesit prezena srurilor n mediu, dar se pot dezvolta pn la concentraii de 2 % care inhib n mod obinuit dezvoltarea majoritii bacteriilor.
Halobacterium

Cteva specii de bacterii halofile facultative se pot totui dezvolta la concentraii de 15 % sruri n mediu.