Cresterea,multiplicare si supravietuirea microorganismelor

1.Cresterea si multiplicarea microorganismelor Cresterea si multiplicarea microorganismeloreste rezultatul metabolismului de biosinteza prin care se formeaza noi constituienti celulari.Obtinerea de produsi utili prin cultivarea microorganismelor pe diverse sustraturi,ca agenti biotehnonologici,este posibila numai in conditii bine cunoscute si astfel dirijate incat randamentul sa fie maxim. Cresterea,in sens biologic,reprezinta marirea graduala si coordonata a metabolismului de biosinteza si adaugarea de constituienti celulari noi.In cazul microorganismelor unicelulare (bacterii,levuri,alge,protozoare) cresterea se realizeaza prin depunerea de substanta noua in sensul tuturor celor trei dimensiuni (lungime,latime si grosime). La microorganismele multicelulare cresterea se realizeaza la fiecare celula in parte,iar adaugarea de noi constituienti celulari apare la tot sistemul biologic. Aceasta crestere este determinata genetic,in conditiile normale si se realizeaza pana la maturitatea deplina si echilibrata a sistemului biologic.La microorganismele unicelulare s-a constatat ca are loc o crestere inegala a suprafetei (la patrat) comparativ cu volumul (la cub).In cazul in care dezechilibrul dintre suprafata celulara si volumul acesteia este maxim,apare momentul critc in care cresterea inceteaza si are loc apoi diviziunea celulara.Prin diviziune se restabileste raportul,in limitele echilibrate,intre suprafata si volum.In urma diviziunii are loc multiplicarea microorganismelor si restabilirea echilibrului normal(suprafata/volum) Multiplicarea se realizeaza prin diviziune directa (diviziune simpla sau binara),prin inmugurirea,prin fragmentarea sau prin formarea unui tip special de spori de propagare (dispersie).Prin multiplicare sporeste numarul de microorganisme.Multiplicarea prin diviziune simpla este raspandita la bacterii,alge,protozoare si la unele ciuperci (fungi). Prin diviziune binara sau sciziparitatea celulara matura se separa in doua celule identice.La microorganismele unicelulare cilindrice sau spiralate diviziunea are loc intr-un plan transversal,perpendicular pe axul mare al celulei (numai la unii spirili se produce longitutidan).Celulele sferice sau ovoide se divid dupa 1,2 sau 3 planuri perpendiculare,succesive,fapt care determina si gruparea celulelor. In perioada dintre doua diviziuni consecutive (ciclul celular) toti constituientii celulari,inclusiv AND,se dubleaza.Cele doua mase nucleare se separa una de alta,iar cele doua jumatati ale celulei mama sunt impartite printr-un sept transversal in doua celule noi,care apoi se despart una de cealalta.Aceasta diviziune se realizeaza printr-o succesiune complexa de etape si este un proces cu preci-

zie reglat si coordonat genetic.In procesul de diviziune intervin numeroase gene,care coordoneaza,atat succesiunea,cat si durata etapelor. In prima etapa a diviziunii celula se pregateste printr-o usoara alungire.In etapa urmatoare are loc replicarea materialului nuclear si sinteza proteinelor (structurale si enzimatice) solicitate de aceasta diviziune. In ultima etapa (cea de diviziune propriu-zisa),care debuteaza cu migrarea (deplasarea) spre extremitatile celulei,a celor doua mase nucleare.In partea mediana a celulei membrana celulara formeaza o proeminenta spre interior (din doua parti opuse).Treptat aceasta invaginare creeaza un perete transversal.In aceasta perioada de formare,sptul trasversal se deplaseaza centripet,de la periferie spre centrul celulei si in final apare septul complet cu o grosime mai mare decat a peretelui celular.In final septul transversal,se cliveaza si dintr-o celula mama se formeaza doua noi celule surori identice.Pren formarea celulelor noi surori celula initiala dispare.Celulele formate se pot separa definitiv,devenind solitare sau raman alaturate formand formele de grupare cunoscute.Replicarea materialului nuclear determina ritmul de diviziune,care este corelat cu conditiile de mediu si de nutritie.In conditiile normale,aceasta durata se determina cu precizie si la parametrii constanti ea este aceeasi.Ea are importanta deosebita in cultivarea microorganismelor pe medii de cultura in laborator sau in procesele biotehnologice de obtinere a unor metaboliti utili.Diviziunea directa poate suferi si modificari datorita aparitiei unor mutante,cu formarea asimetrica a septului transversal.In cazul in care septul se formeaza in apropierea unei extremitati a celulei mame,prin diviziune,se vor rezulta doua celule inegale.Cele mai mici,vor forma asa numitele celule miniaturale (minicelulare). Pentru cultivarea microorganismelor pe medii de cultura este foarte importanta dinamica multimplicarii celulare si stabilirea duratei de generatie (dedublarea).Durata de generatie este perioada de timp necesara ca o celula sa se divida si implicit sa duca la dublarea populatiei din care face parte.In cultivarea microorganismelor pe medii de cultura,in vase de cultura obisnuite,se urmareste curbarea de crestere a acestora.Prin aceasta curba de crestere,se determina evolutia populatiei microbiene,in conditii de laborator,in culturi asincrone (discontinui).Recipientii de cultura au un anumit volum de mediu de cultura si pe aceasta se vor cultiba microorganismele.Pe parcusul cresterii si dezvoltarii microorganismelor apar o serie de modificari si anume: mediul sufera modificari in compozitia chimica,in pH si in el se acumuleaza metaboliti; numarul microorganismelor viabile este diferit (la inceput mai multe cu cresterea pregresiva si apoi scade prin imbatranire si moarte); ritmul de diviziune este inegal: mare la inceput (cultura tanara) si apoi, scade progresiv; celulele au varste diferite; apare o limitare a numarului de generatii.

Curba de crestere a microorganismelor,pe un mediu de cultura asincron,cuprinde mai multe etape : 1. Etapa de intarziere (lag,de latenta,sau de crestere zero) este perioada de timp de la depunerea celulelor pe mediu de cultura si pana cand acestea incep sa se multiplice.Microorganismul e adapteaza (se obisnuieste) cu noile conditii si apoi incepe sa se divida.Are loc o adaptare enzimatica cu noile conditii si dupa aceea microorganismul incepe sa activeze.La sfarsi-tul acestei etape celulare cresc foarte mult ca marime si au un continut marit in proteine,ARN,fosfor si mai ales enzime. 2. Etapa de crestere exponentiala (de crestere logaritmica sau etapa log.) este etapa de multiplicare cu viteza progresiva marita si intensa,cu durata de generatie minima si constanta.Celulele microorganismului manifesta caractere morfologice,biochimice si fiziologice constante si caracteristice. Celulele au cea mai intensa,productiva si eficienta activitate metabolica. Acum se pot determina toate constantele biotehnologice ale microorga-nismului respectiv si apoi sa fie retinut cel mai productiv.In aceasta etapa, se constata si sensibilitatile microorganismului respectiv la actiunea unor antibiotice,substante antimicrobiene,ultraviolete,etc.Durata acestei etape este insa limitata de rezervele de nutrienti din mediul de cultura si de su-portabilitatea microorganismului la proprii metaboliti.Spre sfarsitul acestei etape apar incetiniri in ritmul de muliplicare. 3. Etapa stationara (de echilibru) marcheaza un echilibru in populatia mi-croorganismului respectiv prin faptul ca diviziunea celulra care are loc, poate compensa numarul celulelor care mor.Aflata in echilibru stationar, populatia microbiana,isi incetineste activitatea metabolica si progresiva scade numarul celulelor viabile. 4. Etapa de declin si moarte celulara (de declin logaritmic) se caracteri-zeaza printr-o scadere treptata a celulelor viabile si apoi moartea celule-lor.Durata acestei etape este diferita de la microorganism la altul.Prin epu-izarea nutrientilor,din mediul de cultura si prin acumularea de metaboliti are loc o moarte accentuata,scade densitatea celulelor,iar in final mor toate celulele.Duratele etapelor sunt diferite in functie e microorganisme. Pe parcursul acestor etape au loc modificari morfologice,structurale,bio-chimice,biologice si fiziologice ale celulelor microorganismului respectiv. Celulele aflate in etapa de crestere exponentiala sunt numai celule tinere, cu activitati metabolice intense si specifice si ele pot fi folosite ca inocul si in biotehnologii.Celulele aflate in etapa de stationare sunt,in general, celule mature cu caracterere tipice morfologice si ele sunt folosite pentru determinarea genurilor si speciilor microbiene,pentru preparate micro-scopice si pentru studii de ultrastrctura.Celulele microorganismelor din etapa de declin au caractere alterate,doar cele care formeaza spori sau chisti pot si folosite prentru studiul acestora (in populatia microbiologica predomina formele de

rezistenta).Pentru recoltarea si determinarea me-tabolitilor primari,produsi de un microorganism se va apela la etapa de crestere exponentiala (aminoacizi,acizi organici,vitamine,enzime),iar pentru metabolitii secundari la etapa stationara(antibiotice,steroizi). Supravietuirea microorganismelor corespunde cu mintinerea viabilitatii acestora,in toate conditiile. Pentru supravietuirea microorganismelor adopta o serie de strategii si anume: recurgerea la inactivitate temporara; cresterea foarte lenta,cu utilizarea unor cantitati minime de nutrienti; trecerea in stare de latenta (organe de rezistenta,spori,chisti etc). Microorganismele din mediile naturale (in special din sol) isi mentin viabilitatea printr-o serie de strategii de supravietuire.La unele microorganisme,este prezenta o stare de hipobioza,in cursul careia,ele supravietuiesc chiar in lipsa unor nutrienti si a conditiilor favorabile. Starea de hipobioza este de doua feluri si anume : 1. Latenta in cursul careia activitatea biologica este foarte redusa,la limita energiei de supravietuire (de mentinere); 2. Criptobioza in care activitatea biologica este aproape absenta,dar se mentine viabilitatea componentelor celulare.Se intalneste la formele de rezistenta (spori,chisti,clamidospori). In activiatatea bacteriilor (in mediile naturale) apare asa numitele ultramicrobacterii in conditii prelungite de limitare a nutrientilor.Asemenea ultramicrobacterii au fost semnalate la genurile :Spirillum,Mucothrix,Flavobacterium, Vibrio si Cytophaga.Prezenta acestor ultramicrobacterii reprezinta o strategie prmordiala in evolutia mecanismelor de supravietuire a acestora in natura,cand mediile sunt sarace in nutrienti.

2.Influenta conditiilor de mediu asupra microorganismelor Activitatea biologica a microorganismelor se desfasoara normal in conditii de mediu adecvate,in raport cu necesitatile lor.Influenta factorilor de mediu (fizici si chimici) este variabila in functie de durata si intensitatea actiunii lor. 1. Influenta temperaturii se manifesta asupra tuturor proceselor biologice ale microorganismelor (cresterea,multiplicarea,supravietuirea si viabilita-tea),atat cantitativ,cat si calitativ.Referitor la temperatura si

influenta ei asuora cresterii,multiplicarii,supravietuirii si viabilitatii microorganisme-lor,se disting doua zone si anume: Zona temperaturilor vitale (de dezvoltare), Zona temperaturilor letale (mortale). Zona temperaturilor vitale (de dezvoltare) reprezinta ansamblul valorilor termice in care este posibila activitatea biologica,concretizata prin temperaturile minime,optime si maxime de dezvoltare pentru fiecare microorganism.Diferenta dintre temperatura medie si cea maxima este mare (6C si respectiv 50C),la asa numitele microorganisme euriterme si relativ mica (35C si respectiv 40C)la cele numite stenoterme. Temperatura minima de dezvoltare este cea mai scazuta valoare termiva la care microorganismele se mai pot multiplica.La acesta temperatura metabolismul este scazut,cu un ritm de crestere si multiplicare mult incetinit (durata mare) Limita inferioara a temperaturilor minime,este variabila in functie de compozitia constituientilor celulari si de caracteristicile genetice ale microorganismului.La unele specii cu un continut bogat de zaharuri,lipide si proteine,poate ajunge la -18C. Temperatura optima de dezvoltare este valoare de temperatura,care determina cel mai intens ritm al procesului metabolic sau biologic,al micoorganismului respectiv.Pentru cresterea si dezvoltarea microorganismelor I culturi,pe medii de cultura sau in procesele biotehnologice,are o importanta deosebita. Temperatura maxima de dezvoltare,reprezinta valoare de temperatura,cea mai ridicata la care activitatea biologica (cresterea,multiplicarea,viabilitate) mai este inca posibila pentru un anumit microorganism. In functie de temperaturile lor,de dezvoltare (minime,optima si maxima) microorganismele se grupeaza astfel : criofile (psichrofile), mezofile, termofile, hipertermofile. In tabelul 1 sunt prezentate valorile temperaturilor de dezvolatre la aceste grupe de microorganisme.

Temperaturile de dezvoltare ale diferitelor grupe de microorganisme Nr. crt. grupul temperaturile de dezvolatre C minima optima maxima

1. 2. 3. 4. 5.

Criofile obligate Criofile facultative Mezofile Termofile Hipertermofile

-5 - +5 -5 - +5 10 15 40 45 50 82

15 - 18 25 30 30 40 55 75 80 105

30 35 30 -35 35 47 60 80 85 110

Microorganismele psichrofile (criofile),se dezvolta si la temperaturi negative, uneori in zapada,gheata sau solul inghetat.Sunt reprezentate prin bacterii,levuri si unele alge.Unele sunt criofile obligate,iar altele sunt criofile facultative.Dintre microorganismele criofile mai importante sunt: Achromobacter gracilis,Bacillus insolitus,B. psychrophillus,Cytophaga psychrophila,Flavobacterium sp. Pseudomonas sp.,Vibrio marinos,Candida gelidis,Chlamydinas nivalis,Flagillaria sublinearis. Microorganismele mezofile au temperatura optima de dezvoltare de 25-40C si nu se dezvolta sub 10C,datorita unor blocaje in sinteza unor proteine enzimatice. Microorganismele termofile sunt prezente la suprafata solurilor insorite,in produsele insilozate,in platformele de dejectii animale si de compostare si in unele ape termale.Se clasifica astfel : termotolerante se dezvolta la temperatura camerei,si la 45 50C.Unele sunt termodure T.opt.=25 - 37C,dar supravietuiesc si la +70C. termofile obligate (adevarate).Sunt stenoterme cu T.opt. 6570C. termofile facultative se dezvolta la temperaturi maxime de 50C - 65C,dar pot creste si la temperatura camerei.Sunt euriterme (se dezvolta la limitele mari de temperatura 3050C). termofile extreme (caldoactive) cresc la T.min.=40,T.opt. = 65C,T.max. >70C. Prezinta importanta speciile genurilor Bacillus,Thermoactinomyces,Flexibacter,Oscillatoria,Mastigocladus,etc. Microorganismele hipertermofile se dezvolta bine,la temperaturi cuprinse intre 80 110C (unele nu cresc sub +60C,iar altele sub +80C).Sunt reprezentate de bacterii din genurile Thermotoga,Thermosipho,Fervidabacterium,si numeroase gnuri de archaebacterii (Archaea).
2. Influenta apei asupra microorganismelor.Disponibilitatea

apei,pentru activitatea lor,este exprimata prin valorileactivitatii apei

(Wa=water activity).Majoritatea microorganismelor,necesita pentru un metabolism activ,valori ale Wa 0,96.La valori ale Wa. De 0,60 0,65 ,metabolismul unor microorganisme inceteaza.In tebelele 2 si 3 sunt prezentate valorile activitatii apei (Wa.) la care pot creste diverse microorganisme.

Valorile activitatii apei necesare dezvoltarii bacteriilor Nr.crt. Denumirea microorganismelor Wa. Bacterii 1. Bacillus cereus 0,99 2. Bacillus subtillus 0,95 3. Enterobacter aerogenes 0,97 4. Halobacterium sp. 0,75 5. Lactobacillus viridescens 0,94 6. Micrococcus sp. 0,83 7. Pseudomonas fluorescens 0,94 8. Salmonella typhimurium 0,92 9. Sarcina sp. 0,92 10. Staphylocuccum albus 0,88 11. Staphylococcum aureus 0,86

Valorile activitatii apei necesare dezvoltarii ciupercilor Nr.crt. Denumirea microorganismelor Fungi Wa. (levuri si mucegaiuri) 1. Candida utilis 0,94 2. Endomyces vernalis 0,88 3. Saccharomyces cerevisiae 0,92 4. Saccharomyces rouxii 0,85 5. Torula utilis 0,94 6. Alternaria citri 0,84 7. Aspergillus niger 0,84 8. Aspergillus ruber 0,70 9. Botrytis cinerea 0,93 10 Xeromyces bisporus 0,60 Apa are o mare importanta si in asigurarea presiunii normale in celule.In medii hiperatomice celulele microorganismelor neadaptate pot suferi fenomene de plasmoliza,iar in cele hipotone fenomene de plasmoptizie.

In functie de comportarea microoorganismelor fata de presiunea osmotica a mediilor ele sunt de mai multe categorii si anume : a) Microorganisme intolerante care nu suporta variatii mari de presiune osmotice a mediilor in care traiesc,suferind fie plasmolize,fie plasmoptizii; b) Microorganismele osmotolerante (facultativ osmofile) se dezvolta bine la valori mari ale activitatii apei,dar si la valori mici ale acesteia (Wa.); c) Microorganismele osmofile prezinta cresteri si dezvoltari optime la presiuni osmotice ridicate,realizate prin concentratii mari de saruri in mediu (halofile) sau de zaharuri (glucide) in cazul celor zaharofile. Mocroorganismele halofile sunt de 3 categorii si anume: a) nehalofile (halofobe), b) halofile moderate, c) halofile extreme. Cele halofile moderate se dezvolta la concentratii mici de saruri (Na,K,Mg, Ca,SO4-2CO3-2).Se intalnesc in apele sarate sau in solurile saraturate. Microorganismele halofile extreme sunt cele care se dezvolta numai la concentratii foarte mari de saruri si chiar pe cristalele de sare . Microorganismele zaharofile au o importanta deosebita in fermentatia alcoolica si in biodegradarea unor substraturi bogate in zaharuri (nectar,siropuri,dulceturi). Mai importante sunt levurile osmofile (Saccharomyces mellis,S.rosei,S.rouxii Zygosaccharomyces nadsonii,Z. nectarophilius Z. priorianus).Rol importanta in reglarea presiunii osmotice au porinele,Na+,K+,Mg2+,glicocolul,betaina,prolinbetaina si colina. La microorganismele care se dezvolta in mediile lichide,importanta deosebita are si presiune hidrostatica.Din acest punct de vedere,pot fi mai multe categorii de microorganisme si anume : 1. Barofile rezista la presiuni hiddrostatice ridicate (uneori la 400500atm.) 2. Barofobe nu rezista la preiuni ridicate; 3. Barotolerante suporta unele presiuni.Sunt importante si in cadrul fermentatiei alcoolice unde se prepara unele bauturi cu presiuni mari (vinuri spumante,sampanie); 4. Barodure rezista la presiuni foarte mari; 5. Euribare se pot dezvolta la diferente mari de presiune (intre 1-600 atm); 6. Stenobare suporta numai diferente mici de presiune hodrostatica.

Aceste aspecte sunt importante de cunoscut,pentru micoorganismele folosite in biotehnologii de obtinere a diverselor produse utile,in medii lichide (fermentatii,enzime,vitamine,proteine,insecticide biologice si biogaz).

3. Influenta pH-ului asupra microorganismelor Cele mai multe microorganisme se dezvolta bine la valori ale pH-ului cu-prinse intre 5,0 9,00.Si in cadrul acestui parametru,exista praguri minime,op-time si maxime. Acele microorganisme care au valorile pH-ului optim,in jur de 7,0 sunt neutrofile. Mocroorganismele acidofile,sunt acelea care se dezvolta la valori scazute ale pH-ului (in zona acida).Astefel Acidianus infernus,are un pH optim de 1,0,Saccharomyces guttutata (pH optim 1,0 2,0),iar alga Cyanidium caldarum,are pH optim 2,0.Multe microorganisme acidofite sunt importante prin aceea ca asigura (mai ales in sol) dizolvarea unor roci (fosfati) sau determina fenomene accentuate de coroziune (sol,ape,mlastini sau chiar atmosfera). Microorganismele alcalinofile,sunt cele care se dezvolta bine la valori ridicate ale pH-lui (in zona alcalina).Astfel Bacillus circulans si Streptococcus faecalis cresc bine la pH=10,0 11,0 ,iar Plectonema nostocorum la pH=13,0.In solurile cu saruri de Ca,Mg,Fe,se dezvolta bine o serie de microorganisme alcalifile din genurile :Actinobacillus,Bacillus,Caulobacter,Clostridium,Enterobacterium,Escherichia,Erwinia,Flavobacterium,Hafnia,Pseudomonas,Serratia,Vibrio.Multe microorganisme alcalifile au un continut ridicat de amilaze si proteinaze,fapt pentru care sunt folosite in amestec cu detergentii si in tabacarie (prelucrarea pieilor).

4. Compozitia amestecului de gaze (O2,N2,CO2,SO2,H2S,CH4) are o

importanta deosebita pentru cresterea,multiplicarea,supravietuirea si viabiliatatea micoor-ganismelor.Aceste aspect are semnificatii deosebite pentru microorganismele din sol.In anumite perioade (de seceta sau uscaciune),prin particulele din sol este foarte mult aer (in amestec),fapt care determina cresterea abundenta a microorganismelor aerobe.In perioadele de ploi,sau chiar inundatii,solul are spatiile um-plute partial sau chiar total cu apa,fapt ce determina crearea unor conditii favora-bile pentru cresterea si multiplicarea microorganismelor microaerofile si anaero-be.

In biotehnologii de obtinere a alcoolului,vitaminelor,entimelor,antibioticelor si a biogazului,au importanta continutul in CO2,SO2,H2S si CH4.