1 CULTIVAREA VIRUSURILOR

1.1 CULTIVAREA VIRUSURILOR PE CULTURI CELULARE

Datorită faptului că sunt particule acelulare, fără echipament enzimatic

propriu, prin urmare inerte metabolic şi parazite absolute, virusurile nu pot
fi cultivate, în condiţii de laborator, pe medii acelulare, lichide sau solide.
Cultivarea acestora se poate realiza doar în sisteme biologice vii, ca şi
în cazul protozoarelor parazite şi a unui număr restrâns de bacterii obligato-
riu intracelulare (ex.: genurile Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma).
Sistemele biologice folosite până în prezent în microbiologie, în ordinea
descrescătoare a frecvenţei de utilizare, sunt:
 culturile celulare;
 ouăle embrionate;
 animalele de laborator.
Culturile celulare reprezintă sistemul biologic cel mai frecvent utilizat în
practică, în următoarele scopuri:
 diagnosticul de laborator al virozelor;
 prepararea unor vaccinuri virale;
 cercetarea ştiinţifică în scopul cunoaşterii biologiei moleculare a vi-
rusurilor.
Culturile celulare sunt explante "in vitro” de celule dispersate, obţinute
din ţesuturi, cu ajutorul unor enzime proteolitice, şi plasate într-un mediu
nutritiv. Prin urmare, sunt constituite din:
 celule vii – pot proveni din ţesuturi embrionare, adulte sau maligne,
umane sau animale;
 medii nutritive - sunt soluţii apoase care conţin diferite substanţe
nutritive (aminoacizi esenţiali, vitamine, glucoză, săruri minerale, etc.),
un sistem tampon cu pH de 7,4, un indicator de pH (de obicei roşu
fenol), ser fetal de bou 5-10 % care favorizează dezvoltarea celulelor
şi substanţe antibiotice şi antifungice, pentru a evita suprainfecţia cu
bacterii sau fungi.
 Pentru obţinerea celulelor vii, ţesutul respectiv este recoltat în condiţii
de asepsie, spălat, secţionat, tripsinizat (tripsină 0,25 %) şi supus agitaţiei
mecanice pentru ruperea legăturilor intracelulare.
Suspensia de celule obţinută este introdusă într-un mediu nutritiv de
creştere, aflat în plăci sau flacoane speciale (ex.: plăcile Kolle, flacoane Roux)
ce se incubează în termostat, la 37oC. Celulele aderă la sticlă, se multiplică,
confluează şi formează un monostrat (se dispun într-un singur strat) în 7-10
zile. Cultura este examinată în fiecare zi, cu ajutorul unui microscop special,
ranversat.
Culturile celulare pot fi:
 culturi primare;
 culturi de celule diploide;
 linii celulare continue.
Culturile primare:
 sunt formate din celule animale sau umane adulte, prelevate dintr-
un ţesut sau organ viu şi cultivate "in vitro" până ajung la confluenţă
formând un monostrat;
 de regulă, celulele mai păstrează cariotipul şi unele caracteristici ale
ţesuturilor din care au provenit;
 după aspect, celulele pot fi:
 fibroblast-like: alungite, paralele, orientate regulat;
 epitelial-like: poligonale, grupate în placarde;
 din acestea pot fi desprinse celule, cu tripsină 0,25 %, obţinându-se
suspensii celulare care pot fi subcultivate de încă 5-6 ori, în alte re-
cipiente, apoi mor, datorită fenomenului de senescenţă;
 exemple: culturi din ţesut renal de maimuţă sau de iepure.
Culturile de celule diploide:
 sunt alcătuite din celule care provin din ţesut embrionar;
 celulele păstrează aspectul şi cariotipul diploid al celor de origine;
 se pot face 50-60 de subcultivări, apoi celulele degenerează şi mor;
 exemple: plamân embrionar uman, tegument de nou-născut uman.
Liniile celulare continue:
 sunt alcătuite din celule maligne sau diploide care se pot multiplica
nelimitat deoarece au pierdut inhibiţia de contact;

2
  celulele nu se aseamănă cu cele din care provin iar cariotipul lor este
poliploid;
 datorită instabilităţii genomului, utilizările acestora sunt limitate (nu
se folosesc la prepararea vaccinurilor);
 exemple: Hela (carcinom de col uterin), Hep 2 (carcinom laringian) sau
Vero (rinichi de maimuţă).
În scopul cultivării unui virus, se selectează cultura cea mai sensibilă la
specia suspectată. Se folosesc numai culturi celulare preparate recent.
Înainte de inocularea produsului, se verifică starea culturii şi existenţa
monostratului prin examinare la microscopul ranversat.
Inocularea parcurge următoarele etape:
 se îndepărtează mediul nutritiv de creştere;
 se prelucrează produsul de inoculat prin omogenizare, centrifugare
sau adăugare de antibiotice, în condiţii de asepsie;
 se inoculează 0,1-0,3 ml de produs în fiecare recipient, cu o pipetă
sau seringă sterilă;
 se folosesc câte 4 recipiente pentru fiecare probă;
 se păstrează drept martor o cultură neinoculată;
 se adaugă un mediu de întreţinere peste celulele inoculate;
 culturile se introduc în termostat, la 33-37oC (în funcţie de virus);
 se practică periodic realimentarea cu mediu de cultură;
 se examinează cultura inoculată la microscopul ranversat, cel puţin o
dată pe zi.
Într-o cultură celulară inoculată cu un produs (prelevat de la bolnav,
lichide din ouă embrionate sau de la animale de laborator infectate), pot fi
observate următoarele efecte ale replicării virale:
1. Efectul citopatogen (E.C.P.)
 constă în totalitatea modificărilor, evidenţiabile prin microscopie, pe
care le poate suferi o cultură celulară, ca urmare a dezvoltării şi a
multiplicării în interiorul acesteia a unui virus aparţinând anumitor
specii virale;
 modificările celulare se datorează, pe de o parte replicării virale iar
pe de altă parte, pierderii funcţiilor normale şi alterării structurii
celulei-gazdă;

3
  efectul citopatogen poate fi de 3 tipuri:
 litic – celulele se balonizează, devin refringente, se desprind de pe
suport şi se lizează (ex.: virusurile herpetice şi poliomielitice);
 sinciţial – sub acţiunea unor proteine de fuziune celulară, dispar
membranele rezultând mase citoplasmatice gigante, cu mulţi nuclei,
numite sinciţii (ex.: paramyxovirusurile);
 citotoxic – când cantitatea de virus din celule este foarte crescută,
se produce o degenerescenţă rapidă şi desprinderea de pe suport a
acestora (ex.: la orice virus);
 de asemenea, cultura poate fi afectată în diferite grade:
  25 % din monostrat;
   50 % din monostrat;
    75 % din monostrat;
     100 % din monostrat;
 este semnificativă şi viteza de propagare a modificărilor celulare în
monostrat (poate fi diferită în cazul unor virusuri distincte, dar cu
efect similar).
2. Hemadsorbţia
 constă în adsorbirea eritrocitelor pe suprafaţa celulelor care au
multiplicat virusuri;
 se poate evidenţia prin adăugarea unei suspensii proaspete de hematii
în cultura celulară inoculată cu anumite specii virale, urmată apoi
de agitarea puternică a acesteia (hematiile se fixează pe celule şi
nu se mai desprind);
 pentru că la 37oC hematiile se lizează, se lucrează la temperaturi
coborâte (4-22oC);
 proprietatea este caracteristică virusurilor care au pe suprafaţa lor
proteine specifice numite hemaglutinine (ex.: virusurile gripale).
3. Incluziile virale
 sunt conglomerate formate prin acumularea unor cantităţi foarte
mari de material viral în celulele infectate;
 se pot localiza în citoplasma celulei (ex.: virusul rabic – constituie
elemente patognomonice pentru rabie = corpusculii Babeş-Negri),

4
 în nucleu (ex.: virusul herpetic) sau în ambele compartimente (ex.:
virusul rujeolos);
 sunt vizibile prin microscopie optică.
4. Fenomenul de interferenţa
 este important în cazul virusurilor care nu determină efecte vizibile
ale replicării lor;
 constă în incapacitatea celulei infectate cu un anumit virus (fără
efecte evidente, a cărei prezenţă este sugerată indirect) de a mai
replica un al doilea virus (adăugat în laborator şi cunoscut ca fiind
cu certitudine citopatogen).
5. Transformarea celulară
 este un efect specific virusurilor oncogene;
 constă în multiplicarea dezordonată a celulelor din cultură care
conduce la pluristratificări.
6. Alterări cromozomiale
 ca urmare a replicării unor virusuri în cultura de celule pot apare
anomalii cromozomiale, mitoze aberante sau rupturi de cromatide.

1.2 CULTIVAREA VIRUSURILOR PE OUĂ EMBRIONATE

Ouăle embrionate se utilizează în prezent numai pentru virusuri care

cultivă preferenţial pe acest sistem biologic (virusurile gripale şi paragripale)
sau care produc leziuni caracteristice (poxvirusurile).
De obicei, se folosesc ouă cu coaja albă, produse de găini din rasa Lang-
horn care sunt obţinute de la loturi de păsări S.P.F. (specific pathogen free =
lipsite de germeni), pentru a nu conţine contaminanţi (mycoplasme, virusul
bolii Newcastle). Mai rar, se folosesc ouă de raţă sau de prepeliţă.
Pentru o dezvoltare embrionară normală, ouăle fertilizate sunt incubate
la 37oC şi umiditate 70-80 %. Acestea trebuie întoarse cu 180o, de 2-3 ori pe
zi, pentru a împiedica adeziunea membranelor embrionare la coajă.
După 4-5 zile de incubaţie, ouăle se mirează (examinare la ovoscop)
pentru a vedea dacă embrionul s-a dezvoltat. Pentru cultivarea virusurilor se
folosesc ouă de 6-14 zile.

5
 Figura 18 - Mirarea oului la ovoscop

În primele 3 zile de incubare iau naştere cele 3 foiţe embrionare din care
se formează ulterior structurile oului embrionat.

1 - embrionul;
2 - cavitatea amniotică;
3 - cavitatea alantoidiană;
4 - sacul vitelin;
5 - camera de aer;
6 - membrana proprie;
7 - membrana chorioalantoidiană.

Figura 19 - Structura oului embrionat

În vederea inoculării, se parcurg următoarele etape:

 oul este examinat la ovoscop marcându-se, cu un creion, conturul
camerei de aer şi poziţia ochiului embrionului (se notează cu “X”);
 se dezinfectează coaja cu alcool şi tinctură de iod;
 se inoculează 0,2-0,5 ml de produs în fiecare ou;
 se folosesc 2-3 ouă pentru fiecare probă.
Calea de inoculare se alege în funcţie de virusul suspectat.
Tehnicile de lucru, corespunzătoare căilor de inoculare, sunt:

6
1. Inocularea pe membrana chorio-alantoidiană
 cu o preducea cu vârful prismatic se practică un orificiu în coaja
oului, pe faţa laterală, în dreptul embrionului şi altul în dreptul
camerei de aer;
 pe al doilea orificiu, se aplică o pară de cauciuc cu care se aspiră
creându-se astfel o falsă cameră de aer pe faţa laterală a oului;
 prin primul orificiu se pătrunde cu un ac montat la o seringă, se
străbate membrana proprie şi se depun 0,2-0,5 ml de inocul pe
membrana chorio-alantoidiană;
 după inoculare, orificiile se acoperă cu ceară topită.

Figura 20 - Inocularea pe membrana chorio-alantoidiană

2. Inocularea în sacul vitelin
 se realizează un orificiu în mijlocul camerei de aer;
 se pătrunde cu ajutorul unui ac lung de 4-5 cm, înclinat la 45, în
direcţie opusă celei în care se află embrionul;
 se introduc 0,2-0,5 ml de inocul în sacul vitelin;
 orificiul se acoperă cu ceară topită.

Figura 21 - Inocularea în sacul vitelin

3. Inocularea în cavitatea amniotică

7
  cu o preducea se practică o mică fereastră în coaja oului, la nivelul
camerei de aer;
 se îndepărtează cu o foarfecă sterilă membrana proprie a oului, pe
zona ferestrei;
 cu ajutorul unei pense sterile, în condiţii de asepsie riguroasă, se
prind membranele chorio-alantoidiană şi amniotică şi se ridică
puţin creând astfel un spaţiu pentru inoculare;
 inocularea se face îndreptând acul bont al seringii cu inocul înspre
embrion, până se observă o mişcare retractilă a acestuia;
 se depun 0,2-0,5 ml de inocul în cavitatea amniotică;
 se acoperă fereastra cu o lamelă care este apoi fixată prin picurarea
de ceară topită la nivelul marginilor.

Figura 22 - Inocularea în cavitatea amniotică

4. Inocularea în cavitatea alantoidiană

 se practică cu o preducea un orificiu la nivelul camerei de aer,
pentru ca inoculul să nu reflueze;
 apoi se efectuează un orificiu pe faţa laterală a oului;
 prin orificiul lateral se introduce acul montat la seringă, cu care se
străbat membrana proprie şi membrana chorio-alantoidiană;
 se descarcă 0,2-0,5 ml de inocul în cavitatea alantoidiană;
 în final, orificiile sunt acoperite cu ceară topită.

8
 Figura 23 - Inocularea în cavitatea alantoidiană

După inoculare, ouăle se incubează la 37oC, timp de 24-48 ore. Zilnic,

trebuie controlate la ovoscop. Dacă embrionul moare în primele 24 ore de
incubare, ouăle respective sunt îndepărtate pentru că moartea s-a datorat
altor cauze, nu replicării virale.
După terminarea perioadei de incubare, ouăle se refrigerează o noapte
la + 4C, apoi se fac recoltări de produse (lichid alantoidian, amniotic, sacul
vitelin, membrana chorio-alantoidiană).
Membrana chorioalantoidiană este recoltată într-un recipient cu apă sterilă
şi este examinată, cu ochiul liber sau cu lupa, pentru evidenţierea leziunilor
datorate replicării virale. Această examinare este importantă la poxvirusuri ce
determină apariţia unor zone mici de necroză (pocks-uri).
Efectele replicării virale pe ouă embrionate sunt:
 moartea embrionului (după mai mult de 24 ore);
 formarea de leziuni specifice pe anumite componente ale oului;
 acumularea de hemaglutinine în lichidul amniotic sau alantoidian.

1.3 CULTIVAREA VIRUSURILOR PE ANIMALE SENSIBILE

Cultivarea virusurilor în organismul anumitor animale de laborator este

limitată în prezent de practica culturilor celulare. Totuşi, acestea încă mai sunt
folosite în următoarele scopuri:
 izolarea virusurilor care nu cresc pe culturi celulare;
 studiul patologiei virozelor;
 cercetarea mecanismelor imunităţii antivirale;

9
  producerea de seruri specifice de referinţă;
 controlul vaccinurilor.
În mod obişnuit, se utilizează animale mici deoarece acestea cresc şi se
înmulţesc rapid, sunt uşor de întreţinut şi de manipulat şi sunt sensibile la
virusuri care determină boli umane.
Animalele cele mai frecvent folosite pentru cultivarea virusurilor sunt
iepurele, cobaiul, hamsterul, şobolanul, dihorul, maimuţa şi, cu precădere,
şoarecele alb. Folosirea unor animale mari (ovine, cabaline, caprine, bovine,
etc.) nu este accesibilă pentru diagnosticul curent deoarece pune o serie de
probleme economice, de aprovizionare, întreţinere, etc. Acestea sunt însă
utilizate pentru obţinerea serurilor imune terapeutice sau de diagnostic, a
sângelui integral, a plasmei sau a hematiilor. În aceleaşi scopuri se mai pot
utiliza păsări (găina sau porumbelul).
Animale cum sunt iepurele, şobolanul, cobaiul, etc. sunt ţinute în cuşti
speciale din diferite materiale (lemn, metal, ciment). Şoarecii sunt ţinuţi în
borcane de sticlă de formă cilindrică, cu diametrul şi înălţimea de 20-30 cm,
acoperite cu un capac din sârmă groasă, cu ochiurile plasei nu prea mari şi
având pe fundul lor talaş sau ovăz. Animalele mari stau în grajduri.
În vederea inoculării, se alege iniţial specia animalelor cu care se va
lucra, în funcţie de susceptibilitatea acestora la virusurile suspectate. Apoi,
animalele respective se grupează după rasă, vârstă, sex, greutate, elemente
esenţiale, în funcţie de care există diferenţe de sensibilitate faţă de virusuri.
Pentru obţinerea unor rezultate corecte se utilizează numai animale perfect
sănătoase, motiv pentru care acestea trebuie ţinute sub observaţie 5-10 zile
înainte de inoculare, consemnându-se zilnic, în caietul de laborator, date
referitoare la aspectul lor general, greutate sau temperatură. Optim este ca
animalele să aparţină aceleiaşi linii genetice.
Marcarea animalelor mici, în scopul identificării lor, se face cu coloranţi
de anilină (violet de genţiană, fuxină, etc.), în anumite puncte (pe cap, pe spate,
pe flancul drept sau stâng ori combinaţii). Procedeul se însoţeşte de aplicarea
unor etichete pe borcanele sau cuştile cu animale, pe care sunt menţionate
datele inoculărilor, prelevărilor de sânge sau sacrificării unor animale. În caie-
tul de lucru se notează date mai amănunţite ca dozele administrate, procentele
de letalitate sau alte observaţii. Pentru identificarea animalelor mari, se utili-
zează numere metalice.

10
 Contenţia (imobilizarea) animalelor se face cu mâna sau cu aparate
speciale, într-o poziţie adecvată manoperei care urmează să fie efectuată.
Pentru imobilizarea cu mâna a şoarecelui sau şobolanului, animalul e prins
de coadă cu mâna dreaptă şi de pielea cefei cu policele şi indexul mâinii
stângi şi este lăsat să se agaţe cu ghiarele de plasa de sârmă a capacului
prinzându-i-se coada între degetul mic şi inelarul mâinii stângi.
Anestezierea animalului permite suprimarea temporară a sensibilităţii
organismului acestuia sau a unei regiuni. Se utilizează substanţe anestezice
ca eterul, cloroformul, cloralhidratul, etc. De obicei, se foloseşte un tampon
de vată îmbibat cu anestezic care se introduce sub cristalizorul cu animalele.
După o perioadă de agitaţie, acestea adorm. Lucrul cu animalele anesteziate
este mult mai eficient permiţând efectuarea mai adecvată şi mai rapidă a
manevrelor de inoculare.
Calea de inoculare se alege în funcţie de tropismul virusului suspectat.
Unele reproduc căile de infectare ale omului, altele sunt complet artificiale.
Căile de inoculare folosite sunt:
 cutanată – inocularea se poate realiza în 2 moduri:
 epidermic – pe pielea depilată şi antiseptizată cu alcool şi tinctură
de iod, se întinde produsul pe o zonă, cu un tampon, fără a freca, şi
se lasă să se usuce;
 intradermic – se aplică produsul cu un tampon, după scarificarea
pielii (se practică zgârieturi superficiale, paralele), cu un bisturiu sau
vaccinostil, în zona respectivă;
 subcutanată – după depilarea şi antiseptizarea regiunii, se prinde te-
gumentul între police şi indexul mâinii stângi iar cu mâna dreaptă se
introduce acul, montat la seringă, la baza pliului format şi se inocu-
lează produsul;
 pe mucoase – se practică o scarificare, urmată de depunerea unei mici
cantităţi de inocul, cu o pipetă sterilă sau seringă, pe zona respectivă;
 intramusculară – se depilează şi se antiseptizează tegumentul în zona
respectivă şi se pătrunde intramuscular profund, cu un ac lung, montat
la seringă, inoculându-se produsul;
 intranazală – animalul, anesteziat în prealabil, este ţinut în poziţie
verticală şi se practică instilaţii nazale;

11
  intravenoasă – se antiseptizează tegumentul, se puncţionează vena
şi se inoculează produsul cu grijă, pentru a evita o embolie gazoasă
care determină moartea instantanee a animalului;
 intraperitoneală – se depilează şi se antiseptizează tegumentul, apoi
se prinde peretele abdominal între policele şi indexul mâinii stângi for-
mând un pliu la baza căruia se pătrunde cu acul, montat la seringă,
în cavitatea abdominală şi se inoculează produsul;
 intracerebrală – se străbate cutia craniană direct cu acul montat la
seringă sau după o trepanare anterioară şi se inoculează produsul;
 intratraheală – se antiseptizează tegumentul în regiunea anterioară
a gâtului, se incizează zona şi se puncţionează traheea, inoculându-
se produsul;
 digestivă – se practică după ce animalul a fost ţinut nemâncat 24 de
ore, prin incorporarea produsului în alimente sau prin introducerea
acestuia direct în stomac, printr-o sondă.
Animalele inoculate sunt izolate în borcane de sticlă, găleţi de plastic sau
cuşti şi observate sistematic de către un personal instruit pentru a detecta la
timp orice modificare survenită în starea lor.
În mod obişnuit, după inoculare există o perioadă de incubaţie, diferită
în funcţie de virus, specia de animal şi calea de inoculare folosită. Abia după
această perioadă apare o simptomatologie mai mult sau mai puţin specifică
care este urmată de moartea animalului sau, mai rar, de vindecarea sa.
În anumite situaţii, infecţia poate evolua inaparent, fără manifestări
clinice, dar apar modificări imunologice care pot fi evidenţiate prin tehnici de
laborator sugerând diagnosticul etiologic..
În organismele inoculate, virusurile pot fi puse în evidenţă în lichidele
biologice, ţesuturi sau organe. Din aceste produse se fac treceri pe diverse
sisteme biologice (alte animale, culturi de celule, ouă embrionate).
Dacă animalul nu prezintă semne de boală, se fac treceri la alte animale,
numite“pasaje oarbe". Se pot practica recoltări de produse de la animalele
inoculate (sânge, lichide de puncţie din cavităţi seroase, fragmente tisulare).
Autopsierea (necropsierea) animalelor se efectuează de către persoane
instruite care trebuie să utilizeze echipament de protecţie complet, format
din halat, şorţ, mască, ochelari şi mănuşi.

12
 Sacrificarea animalelor se face prin sângerare “la alb” (până se goleşte
complet patul vascular), embolie gazoasă sau asfixiere, după anestezie prea-
labilă cu eter. Se recomandă ca necropsia să se practice în starea de agonie,
pentru a evita liza cadaverică.
Cadavrul animalului se depune pe o tavă de autopsie cu marginile
ridicate pentru a împiedica răspândirea lichidelor infectate. Suporturile pe
care se lucrează se pot acoperi cu hârtie de filtru îmbibată în sublimat 1% 0
sau cloramină 5%.
Animalele sunt fixate pe spate, pe o placă de plută, cu labele depărtate,
prinse cu ace. Se secţionează pielea pe linia mediană, de la stern până la
pubis şi apoi până la rădăcina fiecărui membru. Se îndepărtează pielea de pe
abdomen şi torace, se deschide abdomenul prin secţionarea longitudinală a
peritoneului şi se recoltează lichid peritoneal şi fragmente de organe (rinichi,
ficat, splină, intestin).
Se deschide iniţial cutia toracică, prin secţionarea coastelor şi se recol-
tează, dacă este cazul, fragmente de organe (pleură, plămân, pericard, cord).
Se poate recolta sânge direct din ventriculul drept şi material nervos prin
deschiderea cutiei craniene.
Produsele recoltate sunt examinate prin tehnici specifice în scopul
izolării şi identificării agentului patogen.

Figura 24 - Necropsia şoarecelui

13
 Cadavrele animalelor se incinerează în crematoriu. Recipientele în care
se găsesc probele recoltate sunt manipulate şi transportate în condiţii de
securitate microbiologică. Dezavantajele cultivării virusurilor pe animale de
laborator sunt:
 costul crescut;
 eficienţa redusă;
 dificultăţi în izolarea virusurilor din acest sistem biologic;
 animalele pot fi purtătoare sănătoase de germeni.

14