Management de laborator

S3. Sistem de management al calitatii (raportare si validare rezultate) – doc RENAR

5.2.8 Art. 5.8 Raportare rezultate

Buletinul de analiză trebuie să evidențieze în mod clar numele organizației, laboratorul de analize medicale și
personalul responsabil cu validarea rezultatelor și verifcarea lor. În cazul organizațiilor multi-site, trebuie
evidențiat în mod clar laboratorul și adresa laboratorului unde s-au efectuat analizele medicale.
Simbolul acreditării și referirea la statutul de acreditat al unui organism de evaluare a conformității și la statutul
RENAR de semnatar al acordurilor de recunoaştere multilaterală se utilizează de către OEC conform RE-02.
Laboratorul trebuie să documenteze acolo unde este cazul modul de raportare intermediară a rezultatelor.

5.2.9 Art. 5.9 Eliberare rezultate

Laboratorul trebuie sa documenteze timpul de eliberare a rezultatelor pentru fiecare analiză acreditată, mai ales în
cazul probelor recoltate din puncte externe.

S4. Managementul datelor. Sistemul informatic al laboratorului. Etica şi confidenţialitatea în

laboratorul/compartimentul de microbiologie. –doc RENAR

5.2.10 Art. 5.10 Management informațional de laborator

Laboratoarele medicale care utilizează sisteme informatice trebuie să demonstreze echipei de evaluare RENAR
îndeplinirea cerințelor din capitolul 5.10 al standardului SR EN ISO 15189.
Echipa de evaluare RENAR va include un expert IT cel puțin o dată pe parcursul unui ciclu de acreditare sau cu o
altă frecvență, în funcție de istoricul evaluărilor anterioare, de complexitatea sistemului informatic, de modul de
dezvoltare și implementare al acestuia, de modificările apărute în cadrul OEC. De regulă, evaluarea sistemului
informatic cu expert IT are loc la acreditarea inițială sau la reînnoirea acreditării (în cazul în care în urma etapei de
analiză a documentelor și înregistrărilor nu se identifică probleme deosebite, evaluarea cu expert IT poate să se
realizeze în cadrul primei supravegheri).

În cazul in care la evaluare s-a constatat că laboratorul modifică rezultate, fără să prezinte dovezi obiective care să
justifice această acțiune, se aplică prevederile politicii RENAR P-21, iar la evaluarea următoare, de regulă, echipa
va fi însoțită de expertul IT.

S1. Normele de funcţionare a laboratoarelor/compartimentelor de microbiologie.

(document RENAR)

Laboratorul medical se organizează în conformitate cu prevederile Ordinului nr. 1301 din 20 iulie 2007
pentru aprobarea Normelor privind funcţionarea laboratoarelor de analize medicale
Organizaţia de care aparţine laboratorul, sau laboratorul în cazul în care este persoană juridică, trebuie
să demonstreze statutul juridic prin prezentarea datelor de identificare care să cuprindă cel puţin
următoarele:

 Nume complet, conform statutului de funcţionare

 Numele scurt sau iniţialele, unde este cazul
 Statutul juridic al laboratorului şi/sau al organizaţiei din care face parte (după caz)
 Număr de înregistrare la Registrul Comerţului/ Numărul codului unic de identificare (CUI) numărul
sentinţei judecătoreşti de aprobare a statutului pentru asociaţii, înregistrarea în registrul unic la
Autoritatea de Sănătate Publică (după caz) etc.
 Laboratorul trebuie să fie menţionat în autorizaţia de funcţionare – anexă la Certificatul de Înregistrare
la Registrul Comerţului
 Adresa sediului social
 Telefon/ fax/ e-mail/ web site
Dacă laboratorul are mai multe puncte de lucru și/sau puncte de recoltare, informațiile de mai sus trebuie furnizate
pentru toate locațiile care vor fi acoperite de acreditare. Punctele de recoltare proprii organizației trebuie să fie
înregistrate conform legislației în vigoare și trebuie să aibă autorizatie sanitară de functionare conform OMSP
1301/2007.

In cazul în care organizatia renunță sau înființează noi puncte de recoltare, OEC trebuie să informeze RENAR și să
depună o solicitare de actualizare a certificatului de acreditare, conform politicii P-24. (OEC – Organism de
evaluare a conformităţii. Laboratorul de analize medicale este un OEC.)

Mod de funcţionare şi domeniul tehnic de activitate

Documentele sistemului de management trebuie să descrie modul de funcţionare al laboratorului
solicitant de acreditare precizând următoarele elemente:
 tipurile de activităţi inclusiv alte activităţi în afara celor pentru care se solicită sau pentru care a fost
acordată acreditarea

 locaţiile unde se desfăşoară aceste activităţi trebuie prezentate suficient de detaliat pentru a oferi o
imagine clară a activităţilor prestate (dacă este cazul)
 domeniul tehnic al laboratorului trebuie descris sub aspectul
 metodelor şi procedurilor utilizate
 limitele performanţelor tehnice ale laboratorului (domeniu de măsurare, limita de detecţie, exactitate,
etc.)

(site legislatie.just.ro)

d) pentru laboratoarele de analize medicale cu compartiment de microbiologie, spațiu

destinat sterilizării, care trebuie să conțină minimum o autoclavă. Se recomandă
utilizarea a două autoclave situate în încăperi diferite, una destinată sterilizării
materialelor infectate și alta destinată sterilizării produselor și materialelor curate care
urmează a fi utilizate sterile.Când există o singură autoclavă, aceasta se va utiliza în
cicluri alternative, fără a se amesteca materialele infectate cu cele destinate a fi
utilizate sterile;

Pentru laboratoarele de analize medicale în care se desfășoară diagnosticul

bacteriologic al tuberculozei și al altor micobacterioze, prin examen microscopic și
cultură sau examen microscopic, cultură și antibiogramă, se vor asigura spații de lucru
separate, cu respectarea acelorași prevederi. În cazul recoltării sputei, este obligatorie
existența camerei de recoltare a acesteia.
Articolul 12

Laboratoarele de analize medicale care au în structură compartimente de bacteriologie,

micologie, parazitologie, virusologie, diagnostic molecular trebuie să aibă în dotare, în
mod obligatoriu, hotă de siguranță biologică de clasă corespunzătoare grupului de risc
microbiologic din care fac parte microorganismele manipulate, încadrate conform
Ghidului național de biosiguranță pentru laboratoare medicale.

Laboratorul de analize medicale cu compartimente de bacteriologie, micologie,

virusologie și parazitologie trebuie să dispună de instalații de alimentare cu gaz.
(9) Conductele vor fi amplasate în pereți sau casete închise, cu excepția conductelor de
alimentare cu gaz, sau, când acest lucru nu este posibil, pe pereții culoarelor.

(site colegiul medicilor Bucuresti)

DOTĂRILE MINIMALE
 Microbiologie: Hotă de siguranță biologică Lampă UV Balanță Termostat (cu temperatură reglabilă)
Microscop binocular
Lupă de laborator
Frigider Congelator (prevăzut cu încuietoare)
Baie de apă cu temperatură reglabilă pH-metru sau indicator pH
Bec de gaz
Etuvă
Autoclavă
Anse bacteriologice
Pipete automate
Termometre
Instalație de apă purificată*)
Sistem de etalonare a inoculului pentru antibiogramă.

D. Laboratoare de analize medicale care efectuează culturi pentru diagnosticul tuberculozei și/sau
micobacteriozelor:
Hotă de siguranță biologică și protecție suplimentară
Autoclavă de laborator verticală, cu accesorii (electric sau cu gaz) Balanță semianalitică (sensibilitate 1
mg)
Balanță pentru echilibrat tuburi de centrifugă
Dulapuri termostat sau cameră-termostat cu capacitate de 6-8 mc (20.000-30.000 culturi/an)
Centrifugă cu accesorii (reglare automată a vitezei, cronometru, dispozitiv de securitate împotriva
demarajului intempestiv și protecție pentru evitarea formării de aerosoli în laborator)
Instalație de apă purificată ( * )
Etuvă
Frigider-dulap pentru medii de cultură
Frigider pentru prelevate pH-metru
Sticlărie specifică de laborator
Anse bacteriologice
Bec de gaz
Ceas de laborator
Coșuri pentru păstrarea eprubetelor cu medii
Uscător pentru lame, cu termostat.
S2. Biosiguranţa şi biosecuritatea laboratorului de microbiologie. Rolul laboratorului de microbiologie în
situații de epidemii, urgențe internaționale. Rolul laboratorului în sistemul de alertă rapidă. (ghidulde
biosiguranta)

Din punctul de vedere al biosiguranţei, laboratoarele se clasifică astfel :

- de bază - Nivel de biosiguranţă 1
- de bază - Nivel de biosiguranţă 2
- securizat - Nivel de biosiguranţă 3
- înalt securizat - Nivel de biosiguranţă 4
Această clasificare are la bază un complex de caracteristici ce se referă la proiectarea şi construcţia
laboratorului, nivelul de securizare, dotarea cu echipamente, practicile şi procedurile operaţionale pe care
le implică manipularea microorganismelor din diferite grupuri de risc.

Conceptul de “biosiguranţă în laborator” se foloseşte pentru a descrie principiile de securizare,

tehnologiile şi regulile ce trebuie urmate pentru a preveni expunerea neintenţionată la agenţi patogeni şi
toxine sau eliberarea lor accidentală în mediu.

Conceptul de “biosecuritate în laborator” se referă la măsuri de securitate luate la nivel instituţional

şi personal cu scopul prevenirii diversiunilor/atentatelor sau a eliberării intenţionate de patogeni sau
toxine precum şi pentru prevenirea pierderii, furtului sau folosirii greşite a acestora.

Pentru fiecare sector din laborator trebuie elaborat şi aplicat un program specific de biosecuritate
în acord cu caracteristicile facilităţii respective, cu tipul de activitate desfăşurată şi cu condiţiile locale. În
consecinţă, măsurile de biosecuritate în laborator trebuie să fie reprezentative pentru variatele necesităţi
ale instituţiei şi ar fi de dorit să cuprindă şi contribuţii din partea directorului ştiinţific, a responsabilului
cu biosiguranţa, a personalului ştiinţific al laboratorului, a personalului de intreţinere, a personalului
responsabil cu tehnologia informaţiei şi a consilierilor juridici şi personalului de securitate, dacă este
cazul.

Măsurile de biosecuritate în laborator trebuie să se bazeze pe un program cuprinzător de

inventariere a agenţilor patogeni şi a toxinelor, incluzând o evidenţă la zi ce va cuprinde şi locul de
stocare, identificarea personalului ce are acces la acestea, descrierea utilizării lor, documentarea
transferului intern (în şi între diferitele sectoare ale laboratorului) şi extern, precum şi orice inactivare
şi/sau eliminare de materiale.

De asemenea, trebuie stabilit la nivel instituţional un protocol de biosecuritate în laborator pentru

identificarea, raportarea, investigarea şi remedierea breşelor din sistemul de biosecuritate al laboratorului,
incluzând şi eventualele neconcordanţe rezultate din activitatea de inventariere. Implicarea, rolurile şi
responsabilităţile autorităţilor de sănătate publică şi ale celor de securitate în cazul unei infracţiuni de
biosecuritate trebuie să fie clar definite.

Curs Bals - Masuri de biosiguranta si biosecuritate in laboratorul de microbiologie

1. Este strict interzis accesul persoanelor straine in laborator,
2. Toate prelevatele biologice trebuie considerate a fi cu potential infectios,
3. Este obligatorie purtarea echipamentului de protectie (echipamentul de laborator sa fie pastrat separat
de cel utilizat in exteriorul laboratorului),
4. Este necesara purtarea manusilor de latex, pentru anumite manevre, dar in nici un caz aproape de
flacara becului Bunsen,
5. Este Interzis a se manca, consuma bauturi sau a se fuma in incinta laboratorului (in orice incapere
din institutia medicala),
6. Nu se recomanda purtarea unghiilor false, lentilelor de contact de catre personalul care manipuleaza
tulpini bacteriene,
7. Interzisa pipetarea cu gura,
8. Nu se depun pe masa de lucru obiecte de uz personal (genti, serviete, caiete, haine etc), se
depoziteaza in vestiar,
9. Manipularea produsului patologic se face “la flacara” becului Bunsen: orice manevra implica
flambarea gatului recipientelor din sticla, atat la deschidere, cat si la inchidere, a pipetelor etc, si
sterilizarea prin incalzire la incandescenta (“la rosu”) a ansei bacteriologice (bucla si firul; portansa
se flambeaza pe 1/3 din lungimea sa),

10. Bucla ansei incarcata cu produs patologic sau cultura bacteriana, se introduce la “baza
flacarii”pentru a fi arsa, unde temperatura este mai scazuta (la varful flacarii exista riscul improscarii cu
bacterii inca nedistruse termic si contaminarea executantului si mediului),
11. In momentul manipularii ansei bacteriologice incarcate cu produs biologic sau cultura bacteriana nu
se fac gesture ample, necontrolate, nu se lasa ansa din mana atata timp cat este incarcata cu produs
contaminant,

12. Inainte de efectuarea unor tehnici de diagnostic bacteriologic, se pregateste protocolul de lucru, se
insusesc etapele, se pregateste tot materialul necesar, se controleaza mental evolutia pasilor, pentru a nu
exista niciun pericol de raspandire a germenilor sau a contaminarilor incrucisate,
13. Nu se alearga, nu se fac miscari bruste in laborator, pentru a nu creea curenti de aer ce ar putea
antrena bacterii cu transmitere aerogena, cu potential infectios,

14. Pipetele gradate, pipetele Pasteur, lamele, lamelele contaminate, dupa folosirea lor, se
imerseaza in solutii dezinfectante proaspete, in cilindrii sau cristalizoare, care sa le acopere in
proportie de peste ¾ din lungimea lor sau in intregime,

15. Toate obiectele contaminate, se introduc in saci autoclavabili, apoi in galeti cu capac (etichetate:
“Sticlarie” sau “Plastice”) si transportate in Compartimentul Sterilizare, pentru a fi autoclavate,
16. Obiectele ascutite, taietoare, intepatoare (ace de seringa, lame de bisturiu- unica folosinta) se
elimina fara a fi atinse, in recipiente de plastic galbene (etichetate corect, cu sigla de biosiguranta) inchise
etans si eliminate la Deseuri infectioase, pentru a fi incinerate,

17. Se respecta codul culorilor in laborator: culoarea galbena inseamna material infectios (saci
plietilena de diverse capacitati, cutii carton de transport deseuri infectioase, cutii plastic cu capac pentru
obiecte taietoare, intepatoare etc) si culoarea neagra care inseamna deseuri menajere, neinfectioase,

18. In cazul unei contaminari accidentale a unei suprafete de lucru cu produs infectios, se anunta
imediat persoana care raspunde de activitatea din laborator, se acopera suprafata cu tifon, panza, peste
care se toarna solutie dezinfectanta, proaspata, se mentine cel putin 30 min, dupa care se trece a curatarea
suprafetei respective,

19. Se recomanda manipularea cu maxima atentie a substantelor chimice caustice, toxice (acizi,
baze, aldehide, cetone, alcooli) folosind echipament adecvat: manusi, masti, ochelari de protectie
etc.
20. Manevrarea gazelor, a diferitelor aparate elctrice (autoclav, centrifuga, pompa de vid etc), a
sticlariei de laborator, pentru evitarea oricarui tip de accident de laborator: explozii, incendii,
traumatisme.

21. Spalarea cu apa calda si sapun lichid dezinfectant a mainilor, ori de cate ori se incheie o etapa
de lucru; se recomanda solutii protectoare ale pielii dupa spalare si stergere cu prosop de hartie de
unica folosinta.

Bacteriologie generală
S5. Structura bacteriei și funcții ale elementelor structurale, cu rol în patogenie. Caracteristici comparative
între celulele procariote şi eucariote.

- Tratat Mahon & Lehman

Bacteriile sunt organisme unicelulare care nu au o membrană nucleară

și nucleu adevărat. Ele sunt clasificate ca procariote (din greacă: pro - înainte, caryon - nucă, nucleu) și le

lipsește mitocondria, reticulul endoplasmatic (ER), sau corpul Golgi. Celula eucariotă (greacă eu -

adevarat, caryon – nuca, nucleu) are un nucleu definit , în care se găsește materialul genetic (ADN) al

organismului, protejat de citoplasmă și de o membrană care constituie învelișul celulei. Celula eucariotă

și celula procariotă diferă deoarece aceasta din urmă este mai primitivă și nu are un nucleu celular

definit, astfel încât materialul genetic este împrăștiat în citoplasmă.

Structura celulei procariote

Structura procariotă se caracterizează printr-o serie de particularități ce o deosebește de cea eucariotă,

principala diferență fiind lipsa nucleolilor și a anvelopei nucleare. De asemenea, îi lipsesc majoritatea

organitelor celulare. Singurele organite prezente în citoplasma celulelor procariote sunt ribozomii („granulele

lui Palade”), al căror număr este de 10 ori mai mare decât la eucariote.

ADN-ul procariot este de obicei reprezentat printr-o singură moleculă de ADN, circulară și puternic spiralizată

numită nucleoid (cromozom bacterian, genofor). Pe lângă ADN, procariotele mai conțin și ARN. Acesta se

găsește liber în citoplasmă sau în ribozomi. De asemenea, există și proteine de tipul histonelor.

Cercetările recente arată că în citoplasma procariotelor se găsește o proteină contractilă, prin polimerizarea

căreia rezultă o rețea contractilă, ca o formă rudimentară de citoschelet întâlnită la eucariote.

Învelișul celulei procariote
1) Capsulă gelatinoasă

 formează împreună cu mucusul (polizaharide) glicocalixul

 poate fi prezentă sau absentă
 rolul glicocalixului este de a ajuta la atașarea de substrat a bacteriilor; rol de protejare împotriva
răspunsului imun al gazdei; rol de protecție; rezistența la uscăciune).
2) Perete celular

 se află între capsulă și membrana celulară;

 este rigid;
 reduce varietatea de forme celulare;
 conține mureină, acid diaminopimelic și acizi teicoici;
 rol în protecție și transport de substanțe.
3) Membrana celulară (plasmalema)

 se află între peretele celular și citoplasmă;

 este componenta fundamentală a celulei;
 nu poate prezenta expansiuni spre exterior;
 este impermeabilă la macromolecule (excepție pentru unele enzime și pentru ADN);
 prezintă un pliu spre citoplasmă numit mezozom;
 rolul mezozomului: în respirația celulară, în fixarea nucleoidului;
 rolul membranei celulare: protecție și transport de substanțe

Structura internă a celulei procariote

1) Citoplasma

 conține nucleoidul, ribozomii, tilacoide, vezicule gazoase, substanțe de rezervă, incluziuni;

 din punct de vedere chimic, citoplasma este alcătuită din proteine, glucide, lipide; în măsură mai mică
mai conține și ribonucleoproteine, fosfolipide, ioni, metale grele (în special magneziu);
 la unele procariote, citoplasma mai conține și diferiți pigmenți cum ar fi: ficocianina (pigment albastru),
ficoeritrina (pigment roșu), clorofila (pigment verde);
 este un sistem coloidal;
 sistemul coloidal are două componente:
Mediu de dispersie: apa;
Faza dispersată: substanțe organice numite micele care participă la mișcarea browniană.
2) Nucleoidul

 se mai numește și genofor, ADN bacterian sau cromozom bacterian;

 este alcătuit dintr-o moleculă de ADN circular dublu catenar;
 este fixat cu ajutorul mezozomului;
 are rol în coordonarea metabolismului celular.
3) Ribozomii

 sunt organite celulare fără membrană;

 se află în citoplasmă;
 are rol în sinteza proteică.
4) Tilacoidele

 sunt prezente sau absente;

 conțin clorofilă;
 rol în fotosinteză.
Prelungirile celulei procariote
1) Flagelii:

 o celulă procariotă poate avea unul sau mai mulți flageli;

 sunt mai lungi decât cilii;
 au rol în locomoție;
2) Cilii:

 sunt mai numeroși la aceeași celulă;

 au rol în locomoție;
3) Pilii:

 au rol în reproducerea sexuată (schimb de material genetic);

4) Fimbriile:

 au rol în atașarea de substrat;

 rol în atașarea de alte celule și formarea de colonii.

Dimensiunea celulei
Procariote: celulele procariote au în mod normal un diametru de 0, 2 până la 2 um.

Eucariote: Aceste celule au în mod normal un diametru de 10 până la 100 um.

Tipul celulei
Procariote: procariotele sunt organisme unicelulare.

Eucariote: eucariotele sunt organisme multicelulare.

Nucleu
Procariote: procariotele nu au nucleu adevărat, nu au membrane nucleare sau nucleoli.

Eucariote: celulele eucariote constau dintr-un adevărat nucleu cu membrane nucleare

duble și nucleoli.

DNA
Procariote: procariotele au o moleculă de ADN unică, circulară în nucleoid, Le lipsește
histone sau exoni.

Eucariote: celulele eucariote au mai mulți cromozomi liniari în nucleu. Ele conțin istonii și
exoni.

Organele legate de membrană

Procariote: celulele procariote nu au organele legate de membrană.

Eucariote: Organele legate de membrană, cum ar fi mitocondrii, cloroplast, ER și vezicule

sunt prezente în eucariote.

flageli
Procariote: Flagelele sunt formate din două proteine din procariote.

Eucariote: Unele celule eucariote fără perete celular conțin flageluri.

Perete celular
Procariote: Pereții celulari procariotici sunt constituiți în cea mai mare parte din
peptidoglicani.

Eucariote: Pereții celulelor eucariote sunt formate din celuloză, chitină și pectină.

Membrană plasmatică
Procariote: carbohidrații și sterolii nu se găsesc în membrana plasmatică a procariotelor.

Eucariote: carbohidrații și sterolii servesc ca receptori pe membrana plasmatică a

eucariotei.

citoscheletului
Procariote: procariotele conțin un citoschelet primitiv fără flux citoplasmic.

Eucariote: eucariotele conțin un citoschelet complex cu flux citoplasmatic.

Diviziune celulara
Procariote: diviziunea celulară are loc prin fisiunea binară în procariote.

Eucariote: diviziunea celulară are loc prin mitoză în eucariote.

Reproducere sexuală
Procariote: reproducerea sexuală a procariote are loc prin conjugare.

Eucariote: reproducerea sexuală are loc prin producerea de gameți în eucariote

Caracteristici comparative între celulele procariote şi eucariote – Curs Idomir

1. Componente constante ale celulelor bacteriene

- citoplasma
- material nuclear (cromozom)
- ribozomi
- perete celular
- membrana citoplasmatica
- mezozomi
CITOPLASMA
• Bazofila – la MO
• 80% apa
• Sistem coloidal in stare de gel:
cu proteine,zaharuri, lipide, saruri anorganice

• Nu are curenti interni ca cel. eucariota

 mentine pozitia structurilor interne
• Contine: membrana citoplasmatica, ribozomi, mezozomi, incluzii citoplasmatice,

NUCLEOPLASMA
• ADN – bazofila mascata de bazofilia citoplasmei bogata in ARN
• Formata din cromozom unic, molecula ADN dublu catenar 1 – 2 mm suprahelicat in jurul unui miez de
ARN
• 6000 gene
• 2500 nucleotide / gena
• La MO – vizibila dupa hidroliza ARN – corpuscul oval
• La ME - ghem de fibre 2-6 nm
• Controleaza structura, cresterea si multiplicarea bacteriana
• NU EXISTA NUCLEOL si MEMBRANA NUCLEARA

RIBOZOMI
• “Corpusculii lui Palade”
• Sinteza proteica
• 10-20 nm
• 70S: subunitati 30 S si 50 S reunite in complex
stabilizat de Mg++ si poliamine
• Foarte numerosi 20000 / celula
• In ME – poliribozomi pe lant ARNm

INCLUZIUNI CITOPLASMATICE
• Se observa la MO
• Caractere taxonomice
• Rezerve de nutrienti
• Polimetafosfat – Corynebacterium – corpusculi Babes Ernst – incluzii de volutina
• Polizaharide: amidon (Clostridium, Neisseria) sau glicogen (Bacillus)
• Lipide – polimeri de beta-hidroxiacizi grasi cu lant scurt – Bacillus, Pseudomonas

MEMBRANA CITOPLASMATICA
• Rolul unei membrane biologice
• Lipsita de steroli
• Sediul citocromilor, enzimelor, componente lant respirator
• Excreta enzime hidrolitice
• Transport transmembranar: fosfotransferaza aport
monozaharide din exterior
• Receptori
• Sinteza fosfolipide
• Rol autoreplicare genom – situs membranar de contact
• Sinteza perete bacterian prin enzime transpeptidaze si
transglicozilaze (PBP)

MEZOZOMII
 Invaginari ale membranei citoplasmatice, in contact cu materialul nuclear
 Replicarea cromozomului si ulterior a bacteriei
  Initiere sept transvers
 Sediul unor enzime hidrolitice

PERETE BACTERIAN
• PEPTIDGLICAN – lipseste la archebacterii si la
Mollicutes (eubacterii)
• Macropolimer din dizaharide aminate
– NAG – N acetilglucozamina
– NAM – acid N-acetil muramic
– Structuri liniare (lanturi de glican) solidarizate intre ele
prin punti peptidice (esential D-ala-D-ala)
- Sinteza sub actiunea enzime de pe fata ext a membranei citoplasmatice cu rol de transpeptidaze si
transglicozilaze (generic numite PBP proteine de legare a penicilinelor) (Penicilina este analog structural
al D-ala-D-ala: se fixeaza pe aceste proteine si inhiba sinteza peptidoglicanului)

PERETE BACTERIAN la bacteriile Gram pozitive

Gros, omogen, retea tridimensionala
• Se asociaza cu :
- acizi teichoici (a.t.) 50% din greutatea uscata
- a.t. de perete
- a.t. de membrana
• Polimeri de ribitol sau glicerol fosfati
• Stabilizeaza peretele
• Leaga ionii de Mg si permite functionare enzimelor membranei celulare
• Antigene majore de Suprafata
- acizi teichuronici (contin acid uric si polizaharide neutre) – antigenici
- lipoglicani (glicolipide)

PERETE BACTERIAN la bacteriile Gram negative

Subtire
Structura neomogena retea bidimensionala laxa
15-20% din greutatea uscata
Asociate:
1 - Membrana externa
2 - Lipoproteine
3 – Lipopolizaharide

1. Membrana externa
• Intern fosfolipide
• Extern LPZ
• Proteine flotante – porine (Omp A,C,D,F)
proteine de transport si enzyme

2. Lipoproteine (LP)
• Leaga membrana externa de peptidoglican

3. LPZ

 Heteropolimer liniar pe suprafata membranei externe

• Structura:
– Lipid A - unitati dizaharidice fosoforilate glucozamina legate prin punti pirofosfat de beta acizi grasi
– Miez POLIZAHARIDIC – Ag R si activator al
Complementului
– Unitati zaharidice repetitive – Ag O (la exterior)

2. Componente variabile ale celulelor bacteriene

 Flageli
 Pili
 Endospori
 Capsula
 Plasmide

FLAGELI
• Rol in mobilitate
• FLAGELINA (Proteina) – antigenica (Ag H) – specificitate de tip
• Clasificare bacterii dupa numarul si dispunerea flagelilor
– Atriche – fara flageli
– Monotriche - 1 flagel
– Lophotriche – grupati la un capat
– Amphitriche - la ambele capete
– Peritriche - in jurul bacteriei
6 -20 μm
• Se obs miscarea pe mediu (vezi proteus, si MIU)
• Se obs la ME structura:
– Filament
– Carlig
– complex bazal (inele)
• La Gram (+) – inel M in membr citoplasmica si inel S supramembranar
• La Gram (-) – 4 inele M, S, P in str peptidoglican) si L (in membrana externa)
• Flux protoni intre inelele M si S rotatia carligului
• Exista variante (fibre axiale) la spirochete – in spatial periplasmic, in jurul protoplastului sau axistil

Pilii bacterieni
• Comuni (fimbrii): peritrichi – rol adezine /
receptori pt bacteriofagi
• Sexuali: nr. mic, la bact Gram –
rol in conjugarea bacteriana (transfer
material genetic)
• Organite mai scurte si mai groase decat flagelii, rigide, 75-100 Angstromi.
• Vizibile la ME
• Codificate plasmidic
• Contin Pilina (proteina)

ENDOSPORII BACTERIENI
• Forme de rezistenta – Bacillus, Clostridium
• Structuri codificate de gene represate in conditii vegetative
• Caracter taxonomic important
• Structura:
– protoplast deshidratat cu dipicolinat de calciu - termorezistenta
– Invelisuri:
• Perete sporal – peptidoglican
• Cortex – peptidoglican sensibil la enzime autolitice
• Tunica externa – proteica
• Tunica interna – proteica – cisteina si legaturi S- S – rezistenta la s. chimice si
radiatii
– Dispunere: central (B. anthracis), subterminal (B. cereus), terminal (bacilul tetanic)
– Dimensiuni: mai mari sau mai mici corpul bacterian
– Apa si nutrientii activeaza o enzima autolitica ce ataca cortexul

Capsula
 Se evidentiaza prin coloratii speciale (tus de China), dar si albastru de metilen si Gram
 De obicei polizaharidica, rar polipeptidica (Bacillus)
 Factor de virulenta
 Rezistenta la fagocitoza
 Antigenica
 Aderenta

S6. Morfologie bacteriană. Forma şi dispunerea bacteriilor. – Mahon si Lehman

Majoritatea bacteriilor variază în dimensiune de la 0,4 la 2 μm. Ele apar în trei forme de bază:

• Coci (sferici)

• Bacili (în formă de bastonas)

• Spirochete (spirală)
Bacteriile individuale pot forma grupări caracteristice. Cocii poate apărea individual, în perechi

(diplococi), în lanțuri (streptococi), sau în grupuri (stafilococi). Bacilii variază foarte mult ca mărime și

lungime de la cocobacili foarte scurti la tije lungi filamentoase.

Capetele pot fi pătrate sau rotunjite. Bacilii cu capete conice, ascuțite sunt numiți fusiformi; unii bacilii

sunt curbați. Când o specie diferă în mărime și formă în interiorul unei culturi pure, bacteriile sunt

pleomorfe. Bacilii pot sa apara ca tije simple sau în lanțuri sau se pot alinia una lângă alta (palisade).

Spirochetele variază în lungime și în număr de spire elicoidale (nu toate bacteriile elicoidale se numesc

spirochete).

-curs Idomir

• Dimensiuni:

- variabile cu:

- genul/specia;

- condiţiile de mediu;

- vârsta culturii.

- în medie au lungime 3-6 m şi grosime 0,5-1 m;

- excepţii: foarte mici (Francisella tularensis – 0,5/0,2 m) sau foarte mari (Caryophanon latum –

6-30 m/3 m).

• Forma:

Coci – bacterii cu formă rotundă:

- sferice (ex: stafilococii);

- ovalare (ex: streptococii);

- reniforme (ex: meningococi, gonococi);

- lanceolate (ex: pneumococi).

Bacili – bacterii cu formă de bastonaşe:

- cu extremităţi ascuţite (ex: fusobacterii);

- cu extremităţi măciucate (ex: bacilul difteric);

 - cu extremităţi rotunjite (ex: Enterobacteriaceae);

- cu extremităţi retezate (ex: bacilul antraxului).

Cocobacili – bacterii intermediare între coci şi bacili (ex: hemofilii);

Vibrioni – bacterii cilindrice, scurte, incurbate, ca o virgulă (ex: vibrionul holeric);

Bacterii spiralate – bacterii spiralate, flexibile (ex: spirochete) sau rigide (ex: spirili);

Actinomicete –filamente lungi, ramificate ce se fragmentează ulterior rezultând bacili de dimensiuni

variate (ex: actinomicete).

• Prezenţa capsulei: prezenţa capsulei reprezintă un caracter de virulenţă; există bacterii incapsulate

sau neincapsulate.

• Prezenţa sporilor: există bacterii sporulate sau nesporulate;

genuri sporulate: Clostridium, Bacillus.

• Modul de grupare: este determinat de modalitatea în care se realizează diviziunea:

- după planuri succesive de diviziune paralele (grupări in diplo – ex: meningococii, gonococii,

pneumococii, în lanţuri – ex: streptococii, în formă de L, V, N, M, palisade sau litere chinezeşti –

ex: bacilul difteric);

- după 2-3 planuri perpendiculare succesive (tetrade – ex: micrococii sau structuri cubice – ex:

Sarcina lutea);

- după planuri orientate diferit (grupuri neregulate de celule – ex: stafilococii).

• Tinctorialitate: coloraţia Gram – bacterii Gram + sau Gram –

• Localizare: extracelulare şi intracelulare.

- Curs Rafila

Dimensiuni ale bacteriilor

 Diametrul mediu - 0.5 - 2.0 μm

 (Hematia are 7.5 μm in diam.)

• Suprafata medie ~12 μm2

• Volumul mediu ~4 μm3

• Raportul Suprafata / Volum: 3:1

Dimensiuni / forma / grupare

Coci – 0,8 – 1 m

- rotunzi (sferici) - izolati - micrococii

- gramezi neregulate – Staphylococcus

- tetrade

- cate 8 – Sarcina

- in lanturi – streptococii

- ovalari - izolati, diplo, lanturi scurte - enterococi

- lanceolati - in diplo - Streptococcus pneumoniae

- reniformi - in diplo – Neisseria

Bacili – bastonase – 1,5 – 10 m lungime / 0,2-0,3 m grosime

extremitati : - rotunjite – enterobacterii

- taiate drept – Bacillus anthracis

- maciucate – bacilul difteric

- ascutite – Fusobacterium

grupare: - in diplo – Klebsiella pneumoniae

- in lanturi – Bacillus anthracis

- sub forma de litere chinezesti – Bacilul difteric

- in palisada - Bacilul difteric

Cocobacili – 1 – 1,5 m lungime / 0,4-0,8 m grosime

Ex. Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae

Vibrioni – incurbati – Vibrio cholerae

Spirili si spirochete

- corp lung, spire stranse sau laxe

- Borrelia, Treponema, Leptospira

Forme L – forma variabila, nu au perete celular (sferoplasti, protoplasti)

S 7. Creşterea şi nutriţia bacteriană: necesităţi nutritive, factorii care influenţează creşterea; medii de
cultură; creşterea bacteriană şi caracterele de cultură. Metabolismul bacterian: fermentaţia şi
respiraţia.

Metabolismul bacterian – curs Rafila

• Def. = totalitatea r. biochimice care au loc intr-o
celula bacteriana

Catabolism si Anabolism

• Functii indeplinite prin metabolism:

– Eliberare si stocare de energie
– Obtinerea subunitatilor necesare sintezei
componentilor celulari, pornind de la substantele
nutritive primare
– Activarea subunitatilor monomere folosite pentru
sinteza constituentilor celulari macromoleculari,
cf. informatiei genetice a celulei

– Formarea si degradarea biomoleculelor

necesare diferitelor functii celulare
– Rol cheie – ATP (conserva energia) eliberaza
pt biosinteze, transport transmembranar,
motilitate
– 45% din E se pierde Q
Particularitati metabolism bacterian

• Unicelular

• Necompartimentat (lipsa organite)

• Plasticitate: adaptare la diferite tipuri de substante nutritive

• Flexibilitate: utilizarea aceluiasi substrat in mai multe cai distincte, dar
intricate

• Eficienta maxima

Cerinte nutritive ale bacteriilor

1.Factori fizici-min/optim/Max

• pH neutru; rar acid (Helycobacter, fungi/exceptie Candida - neutru) sau alcalin (Vibrio)

• Temperatura:

– majoritatea patogenilor mezofili/conservare: inghetare, liofilizare

– Listeria psichrofila; Pseudomonas se multiplica la minus 18 oC in zaharuri

concentrate

– Termofile – Taq polimeraza PCR

• Presiunea osmotica (izo, hiper, hipotonic)

– Influentata mai ales de concentratia zaharurilor siNaCl – stafilococi halotoleranti;

Vibrio parahaemolyticus halofil; E. coli enterohemoragic sorbitol
Cerinte nutritive ale bacteriilor

2. Factori chimici

• Sursa de carbon:

– Heterotrofe (carbon organic),

– Auxotrofe, autotrofe (CO2)

– Mixotrofe: ambele

– Prototrofe:cer compusi complecsi (vit., aa), fastidiosi

– Paratrofe:traiesc strict intracelular: Rickettsii, Chlamydii

• Azot: nitrati, nitriti; N2 daca sunt fixatoare

• Oxigen

– Aerobi stricti

– Microaerofili
 – Facultativ anaerobi

– Anaerobi stricti

• S, P

• Minerale: Fe (competitie cu gazda/siderofori), Na, Cl, Mg, K, Ca etc.

Tipuri de cai metabolice

• Cale catabolica: degradare compusi din mediu + energie – 3 etape:

– Degradare compusi in molecule constitutive (aa, zaharuri etc.)

– Molecule simple degradare incompleta la CO2 si H2O

+ intermediari ai caii metabolice centrale
– Degradare completa la Co2 si H2O a bacteriilor aerobe si reactii de fermentatie
cu obtinere de alcool, acid lactic, butiric etc. la anaerobi
• Cale anabolica:

– Intermediari sinteza blocuri de contructie, monomeri; intermediari:

glucozo-6-P, pentozo-P, tetrozofosfati, triozofosfati, 3-fosfoglicerat, serina
– Monomeri polimeri (proteine, ac. nucleici – pe matrice; lipide,
carbohidrati – enzimatic)
– Autoasamblare

• Cale amfibolica: in acelasi timp eliberare de energie si sinteza

• Cale anaplerotica: aprovizionarea permanenta cu metaboliti deficienti

Metabolismul glucidic

• Calea Embden Meyerhoff – anaeroba; suita r.: glucoza 2 piruvati +

2ATP

• Calea hexozomonofosfatului: hexoza pentoza; ac. nucleici, aa aromatici,

vitamine

• Calea Entner- Doudouroff – furnizeaza rezervede precursori, vitamine pt. sinteza ADN
si ARN

• Calea fosfocetolazei

• Ciclul acizilor tricarboxilici: Acetil-Coa CO2 + H2O – la nivelul

membranei citoplasmatice

Metabolismul – soarta compusilor simpli

 • Aa: Transaminare, dezaminare ciclul Krebs

• Bazele purinice si pirimidinice:endo siexonucleaza – utilizate ca sursa de C; sinteza

atom cu atom

• Lipide: glicerol+acizi grasi (lipaze) ciclul Krebs

Sinteza ac. grasi: AcCoa carboxilaza si acid gras sintetaza

Cresterea

• Formare de noi constituenti celulari

• Sinteza specifica pornind de la substante nutritive simple a unor compusi noi, care
sunt ulterior asamblati formand copii fidele ale constituentilor celulari

• Depinde de:

– Informatia genetica

– Substantele din mediu (natura, concentratie)

• Continua pana intr-un moment critic (raport volum/suprafata), cand cresterea se

intrerupe si apare multiplicarea

Multiplicarea

• Diviziune directa - coordonata de ADN

– Scindare celula mama in 2 celule fiice

– Prin invaginare membrana sau formare septtransversal

– Bacili, spirili: plan transversal

– Unii spirili: longitudinal

– Coci: planuri perpendiculare succesive (1,2,3)

• Inmugurire: bacterii fotosintetice

• Fragmentare: bacterii filamentoase

• Segmentare - Tip special de spori: Streptomyces

Fiziologia bacteriană
1. COMPOZITIA CHIMICA A BACTERIILOR

Compozitia chimica a bacteriilor este asemanatoare tuturor organismelor vii. Ea cuprinde în jur de 20 de
elemente ale sistemului periodic, care se pot împarti în trei grupe:
• elementele de baza, H, C, N, O, P si Sulf, care intra în compozitia substantelor cu rol primordial
structural si energetic a oricarei celule vii (proteine, lipide si zaharide),
• elemente în concentratie sub 1% si mai ales sub forma ionizata cum sunt K+, Na+, Mg2+, Cl-, Ca2+ etc.
cu rol functional în procesele de activare a unor enzime (Mg), în permeabilitatea sistemului membranar al celulei
bacteriene (Ca), în vâscozitatea citoplasmei etc.
• oligoelementele, cum sunt Mn2+, Fe2+, Fe3+, Co2+, Cu2+, MoO42+, SeO32-, WO42- etc., ce se gasesc în
celula bacteriana în cantitati foarte reduse, sub 0,001%, si care intra în structura unor coenzime absolut necesare
desfasurarii metabolismului,

• continutul în apa al bacteriilor se situeaza în medie la 85% din masa celulara. Apa este faza în care se
solubilizeaza, sunt transportati electrolitii si substantele neelectrolitice si mediul în care se petrec toate reactiile
metabolice. Ea participa la multe din aceste reactii (hidroliza, reactii anabolice etc.) si formeaza împreuna cu
substantele anorganice si macormoleculele organice continute o unitate fizico-chimica si biologica.

2. NUTRIȚIA BACTERIANĂ

Nutritia bacteriana reprezinta totalitatea proceselor prin care bacteriile îsi procura din mediul înconjurator
substantele necesare supravietuirii, cresterii si înmultirii , iar respiratia bacteriana modalitatea de a-si produce
energia necesara activitatii metabolice.

Sursa de energie. În functie de sursa de energie pe care o folosesc, bacteriile se împart în:
• fotosintetizante, care utilizeaza energia luminoasa pentru sinteza compusilor proprii si
• chimiosintetizante, care îsi procura energia prin reactii de oxido-reducere a unor substante. Bacteriile
care oxideaza substantele anorganice se numesc lithotrofe, iar cele care oxideaza substante organice
chemoorganotrofe.

Sursa de carbon. Dupa sursa de carbon, bacteriile se clasifica în:

• autotrofe, care sintetizeaza compusi organici pornind de la substante anorganice, sursa de carbon fiind
CO2,
• mixotrofe, care folosesc ca sursa de carbon atât substante organice cât si CO 2,
• heterotrofe, care utilizeaza ca sursa de carbon numai substante organice.
Sursa de azot a bacteriilor de interes medical o constituie în general aminoacizii, dar unele bacterii utilizeaza si
sarurile de amoniu (Escherichia coli, Salmonella etc.).
Necesarul de oxigen pentru dezvoltarea bacteriilor este variabil si va fi discutat în cadrul reactiilor de
energogeneza.

2.1. Necesitatile nutritive ale bacteriilor de interes medical

Bacteriile de interes medical sunt, cu foarte putine exceptii, chimiosintetizante heterotrofe. Ele au nevoie
pentru multiplicare de substante organice, diversi ioni, oligoelemente si factori de crestere (vitaminele B1, B2, acid
pantotenic, biotina, lactoflavina acid folic etc.).

Necesarul de substante organice este foarte diferit de la o specie bacteriana la alta. Astfel, de pilda,
Escherichia coli cultiva foarte bine pe medii care au în compozitie o singura sursa organica de carbon (glucoza,
acetat sau succinat), o sursa de azot [(NH 4)2SO4)], ioni esentiali dezvoltarii (K+, Mg2+ etc.) si oligoelemente
(Cl-, Co, Cu, Mo, Ni, Se, Zn etc.). Alte bacterii au nevoie de substante organice ca aminoacizi, purine, pirimidine,
vitamine, factori de crestere etc. pe care nu le pot sintetiza, deoarece sunt adaptate la habitatul lor natural
(organismul uman sau animal), care le asigura aceste substante.

Cu cât necesitatile nutritive bacteriilor sunt mai mari cu atât dependenta lor fata de o gazda naturala creste.
Astfel, o categorie aparte în cadrul bacteriilor heterotrofe sunt bacteriile paratrofe. Ele sunt lipsite de unele enzime
(genul Rickettsia) sau nu sunt capabile de energogeneza (genul Chlamydia) si nu se pot înmulti decât în celule vii,
având deci un habitat natural obligator intracelular.

Necesitatile nutritive difera chiar si în cadrul aceleiasi specii. Astfel, prin mutatii sau alte mecansime ale
variabilitatii genetice, unele tulpini pierd proprietatea de a sintetiza un compus necesar dezvoltarii, înmultirea
depinzând de prezenta acestuia în mediu. Astfel de tulpini se numesc auxotrofe, iar tulpinile originale din care au
provenit se numesc prototrofe. De exemplu, tulpinile prototrofe de E. coli, principalul agent etiologic al infectiilor
urinare, sunt capabile sa sintetizeze timidina necesara replicarii ADN. S-a observat, însa, la bolnavii cu infectii
urinare care au fost tratati timp îndelungat cu biseptol, aparitia unor tulpini auxotrofe care pierd proprietatea de a
sintetiza timidina. Deci, urocultura, pe mediile uzuale, lipsite de timidina, va fi constant fals sterila, tulpina
auxotrofa prezenta în urina neputându-se dezvolta în lipsa acestui nucleotid.

3. METABOLISMUL BACTERIAN

Metabolismul bacterian cuprinde totalitatea reactiilor biochimice care au loc în celula bacteriana, precum si
cele care sunt determinate de microorganism în mediul înconjurator. Ele au ca scop final cresterea si multiplicarea
bacteriei si se împart în:
• reactii catabolice, prin care se fragmenteaza substratul nutritiv în unitati componente cu eliberare de
energie,
• reactii metabolice intermediare, prin care energia rezultata din primele reactii este înmagazinata în
compusi macroergici si
• reactiile anabolice, prin care celula bacteriana îsi sintetizeza substantele proprii, cu consum energetic.
Toate aceste reactii sunt catalizate de enzime a caror activitate este controlata genetic astfel încât intensitatea
lor sa fie cât mai eficient adaptata conditiilor în care bacteria creste si se înmulteste.

3.1. Reactiile catabolice

Bacteriile heterotrofe catabolizeaza substante organice din mediul înconjurator printr-o succesiune de reactii
enzimatice, care parcurg în principiu 4 faze:
• descompunerea extracelulara a substantelor organice în unitati mai mici sub actiunea unor exoenzime. La
bacteriile care au ca habitat omul, macromoleculele din mediul ambiant sunt reprezentate de proteine, acizi
nucleici, colagen, mucopolizaharide, lipide etc. Pentru scindarea acestor substante bacteriile invazive secreta
exoenzime hidrolitice, care pot fi în acelasi timp si factori de patogenitate.

• absorbtia substantelor din mediul extern se face prin 3 mecanisme:

- pasiv în functie de diferenta de concentratie a unei substante în interiorul si exteriorul celulei ca, de
exemplu, în cazul glicerolului;
- activ prin fosforilarea, cu consum energetic, a substantei ce urmeaza a fi absorbita ca, de pilda, glucoza
care se absoarbe numai sub forma de glucozo-6-fosfat;
- activ cu consum energetic prin legarea substantelor de proteinele de transport numite permeaze. Printr-un
astfel de mecanism se absorb substantele pe care celula bacteriana le depoziteaza în concentratii foarte
mari fata de concentratia din mediu. Astfel daca celula bacteriana este lipsita de permeaza pentru lactoza,
aceasta nu poate fi absorbita nici daca bacteria, complet lipsita de lactoza, se afla într-o solutie cu continut
foarte mare de lactoza.
O mentiune speciala o merita transportul transmembranar de fier, necesar bacteriilor în multiplicare. În
tesuturile organismului fierul nu se gaseste în stare libera ci legat de proteine, cum sunt transferina si siderofilina.
Bacteriile au dezvoltat mecanisme ingenioase de absorbtie a fierului prin secretia sideroforilor, substante
chelatoare de fier care scot fierul din combinatiile sale facându-l absorbabil.
 • pregatirea substantelor pentru oxidare prin reactii de decarboxilare, dezaminare, fosforilare etc. si
• oxidarea substantelor cu eliberare de energie sau respiratia bacteriana. Oxidarea se defineste ca o
pierdere de electroni sau de ioni de hidrogen. Substanta care se va oxida este donorul, iar cea care se reduce,
acceptorul de hidrogen. Deci, în urma oxidarii va rezulta o substanta oxidata, o substanta redusa si o anumita
cantitate de energie libera. Substanta energogenetica de baza este la multe bacterii glucoza, monozaharid ce poate
fi metabolizat pe mai multe cai în functie de performantele oxidative ale bacteriilor.

La bacterii deosebim în functie de acceptorul final de hidrogen, 3 tipuri de oxidatie: respiratia, în care
acceptorul final de hidrogen este oxigenul atmosferic, fermentatia, în care acceptorul final de hidrogen este o
substanta organica, si respiratia anaeroba, în care acceptorul final de hidrogen este oxigenul prezent într-o sare
anorganica (nitrat sau sulfat) care se va reduce. Subliniem ca termenul de respiratie anaeroba pe care îl folosim
pentru a desemna bacteriile strict anaerobe se refera de fapt la fermentatie în absenta oxigenului.

Respiratia este legata de sistemul membranar al bacteriilor (membrana citoplasmatica, mezozomi).

Cantitatea de energie eliberata prin respiratie este mai mare decât cea eliberata prin fermentatie, deoarece oxidarii
de substrat îi urmeaza oxidatia de transfer, în care electronii sunt transportati pe lantul respirator (citocromi,
flavoproteine, ubichinone) pâna la acceptorul final de hidrogen (oxigenul atmosferic) si fosforilarea oxidativa.
Astfel, la degradarea completa a unei molecule de glucoza bacteriile obtin 38 de molecule de ATP. Exista si
posibilitatea degradarii incomplete datorita lipsei unor enzime oxidative, cantitatea de energie fiind mai mica.

Fermentatia foloseste compusi organici ca donori si acceptori de electroni si se produce pe urmatoarele cai
metabolice:
• glicoliza pe calea Emden Meyerhof care transforma o molecula de glucoza în 2 molecule de acid piruvic,
energia rezultata fiind înmagazinata în 2 molecule de ATP,
• fermentatia secundara a piruvatului care poate fi lactica, alcoolica, propionica, butirica, mixta (lactica,
formica) în functie de produsii de metabolism rezultati,
• cai alternative de metabolizare a glucozei cum sunt suntul fosfatilor si calea Entner-Doudoroff, aceasta
din urma specifica genului Pseudomonas.
Din punct de vedere practic, bacteriile se împart, dupa necesarul de oxigen, în:
• bacterii strict aerobe, care se dezvolta numai în prezenta oxigenului atmosferic, folosind exclusiv
respiratia aeroba si deci oxigenul ca acceptor final de hidrogen. Astfel de bacterii sunt, de exemplu,
Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis etc.

• bacterii strict anaerobe, care nu se dezvolta decât în absenta oxigenului, prezenta lui fiind foarte toxica
culturii chiar la o presiune de numai 10-5 atm. Aceste bacterii folosesc ca reactie energogenetica exclusiv
fermentatia, în conditii anaerobe, deci oxidatia de substrat. Daca fermentatia se produce în prezenta oxigenului,
se formeaza radicali de superoxid (O 2-) foarte toxici. Bacteriile strict anaerobe, spre deosebire de cele aerobe, sunt
lipsite de superoxiddismutaza care transforma radicalul superoxid în apa oxigenata si catalaza care descompune
apa oxigenata. Exemple de bacterii strict anaerobe sunt cele din genul Clostridium, Bacteroides, Prevotella,
Fusobacterium etc.
• bacterii facultativ anaerobe, care se pot dezvolta atât în prezenta cât si în absenta oxigenului atmosferic.
Ele utilizeaza ca reactii energogenetice respiratia aeroba, fermentatia iar unele chiar si respiratia anaeroba.
Majoritatea speciilor de interes medical sunt facultativ anaerobe (de pilda, enterobacteriile).

• bacterii anaerobe aerotolerante folosesc numai fermentatia în prezenta aerului atmosferic, fara
participarea oxigenului la reactiile energogenetice. Ele tolereaza oxigenul în mediu fie pentru ca au în
echipamentul enzimatic superoxiddismutaza si catalaza, fie ca enzimele exista în mediul de cultura. Astfel,
bacteriile din genul Streptococcus sunt lipsite de catalaza, dar pot fi cultivate în conditii de aerobioza pe medii cu
sânge, care suplineste catalaza.

• bacterii microaerofile folosesc respiratia si fermentatia, dar necesita o concentratie mai mare de bioxid de
carbon decât cea din atmosfera pentru reactii de carboxilare. Astfel, unele specii, ca cele din genurile Neisseria,
Brucella, Campylobacter, necesita concentratii de bioxid de carbon de 6-10%.
 Reactiile energogenetice ale bacteriilor sunt în principiu aceleasi ca si la celulele eucariote, si anume:
glicoliza pe calea Embden-Mayerhoff (în conditii de aerobioza sau anaerobioza), calea pentozofosfatilor, (în care
se produce NADPH2 important donor de ioni de H pentru reactiile anabolice), beta-oxidatia acizilor grasi, ciclul
acizilor tricarboxilici, dezaminarea oxidativa si transaminarea aminoacizilor, oxidarea de substrat, fosforilarea
oxidativa.

Liniile metabolice folosite de diferitele specii bacteriene variaza foarte mult, în functie de substratul care este
prezent în mediul în care bacteria se înmulteste si de dotarea genetica a bacteriei. Astfel, specia Bacteroides
fastidiosus poate cataboliza doar un singur substrat - acidul uric, sau produsii de degradare ai acestuia pe când
Pseudomonas multivorans poate folosi peste 100 de substraturi drept sursa de carbon.

Cunoasterea pretentiilor nutritive ale bacteriilor este esentiala pentru prepararea unor medii corespunzatoare
cultivarii lor, iar cunoasterea performantelor metabolice ale microorganismelor este importanta prin faptul ca,
alaturi de morfologie, constituie criteriile de baza în identificarea lor.

3.2. Reactii intermediare

Energia rezultata în urma oxidarii va fi transformata în energie chimica, fie sub forma unor tioesteri, ca de
exemplu Acetyl~SCoA, fie sub forma de ATP. Energia astfel stocata va fi eliberata la nevoie pentru amorsarea
unor reactii catabolice sau pentru sinteza unor molecule cu rol structural sau functional. Unii din produsii
intermediari rezultati pe parcursul reactiilor de oxidare pot fi utilizati de bacterie la sinteza unor substante proprii.

3.3 Reactii anabolice

Sunt reactii prin care celula bacteriana îsi sintetizeaza din compusi simpli, rezultati în timpul reactiilor
catabolice sau intermediare si cu consum energetic substante cu rol structural (macromolecule) si functional
(enzime). La acestea se adauga sinteza unor substante cu rol de rezerva energetica (incluzii de polizaharide si
lipide).

Din punct de vedere al biosintezelor, bacteriile au posiblitati practic nelimitate. Este suficient sa ne gândim la
complexitatea structurilor membranare ale bacteriilor si la structura peretelui celular, componente pe care celula
bacteriana si le sintetizeaza, uneori, numai dintr-un singur compus organic prezent în mediu.

Posibilitatea reactiilor de biosinteza difera de la specie la specie. Astfel, unele bacterii sunt capabile sa
sintetizeze toti aminoacizii, nucleotidele, monozaharidele si coenzimele din substante simple, rezultate în cursul
reactiilor catabolice si intermediare ale metabolismului. Alte bacterii însa sunt lipsite de unele linii anabolice, fiind
dependente de aportul din exterior al substantelor ce se sintetizeaza pe aceste cai. Bacteriile de interes medical se
situeaza între cele doua extreme.

Performantele biosintetice ale microorganismelor sunt exploatate în diferitele ramuri ale industriei, în care
obtinerea pe calea sintezei chimice a unor produsi ar fi imposibila sau nerentabila. Astfel, industria farmaceutica
obtine antibioticele, unii aminoacizi si vitamine prin activitatea dirijata a microorganismelor, industria alimentara
brânzeturile si bauturile alcoolice etc. Unele bacterii sunt capabile sa metabolizeze hidrocarburi alifatice, ele fiind
speranta decontaminarii apelor poluate cu titei.

Reglarea metabolismului are ca scop adaptarea economica a reactiilor si a intensitatii lor la substratul nutritiv
existent în mediul în care traieste bacteria, astfel încât ele sa asigure cresterea si înmultirea acesteia. Reglarea se
efectueaza prin modularea activitatii enzimelor bacteriene, a caror structura alosterica favorizeaza inactivarea lor
de catre produsul final a carui formare au catalizat-o.

4. CRESTEREA SI ÎNMULTIREA BACTERIILOR

Cresterea si înmultirea bacteriilor este rezultatul nutritiei si al metabolismului bacterian.

Viteza de multiplicare a bacteriilor este foarte mare. S-a facut un calcul ipotetic din care rezulta ca, daca la
fiecare 20' are loc o diviziune, dintr-o celula bacteriana cultivata într-un mediu nelimitat ar lua nastere într-o zi
1x1021 celule, ceea ce ar corespunde unei mase de 4.000 de tone. În realitate, o asemenea rata de înmultire a
bacteriilor nu este posibila, fiind împiedicata de epuizarea substantelor nutritive si a factorilor de crestere, pe de o
parte, si de acumularea metabolitilor toxici, pe de alta parte.

Bacteriile se divid în marea lor majoritate prin diviziune binara, cu exceptia chlamydiilor, care au un ciclu
de dezvoltare unic în lumea bacteriana. Diviziunea este precedata de cresterea în volum a celulei bacteriene,
dedublarea materialului nuclear si a componentelor citoplasmatice, ceea ce duce la un dezechilibru între masa si
volumul celulei bacteriene. Când acest dezechilibru atinge un punct critic se produce diviziunea celulei parentale în
doua celule fiice, identice cu celula din care au provenit.

La bacili diviziunea se face întotdeauna dupa un plan perpendicular pe lungimea bacteriilor, în timp ce la coci
planurile de diviziune sunt variate. Celulele fiice se pot separa imediat dupa diviziune sau pot ramâne legate una de
cealalta, rezultând o asezare caracteristica, utila în recunoasterea bacteriilor ca, de exemplu, a celor din genul
Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria etc.

Diviziunea bacteriilor gram pozitive are loc prin formarea unui sept între cele doua celule fiice, pe când
bacteriile gram negative se divid prin strangulare directa.

4.1. Curba de crestere si înmultire a bacteriilor într-un mediu

limitat
Daca se introduce un inocul (un numar redus) de celule bacteriene dintr-o cultura pura într-un mediu de
cultura proaspat si se incubeaza într-o atmosfera prielnica speciei respective, bacteriile vor creste si se vor înmulti,
iar timpul care trece de la o diviziune celulara la urmatoarea se numeste timp de generatie. Daca se apreciaza
numarul de celule bacteriene la intervale diferite de timp de la momentul inocularii si reprezentam grafic raportul
care se stabileste între acest numar si timpul care s-a scurs, vom obtine doua curbe caracteristice în functie de
celulele bacteriene luate în calcul.
• o numaratoare totala a germenilor ce cuprinde toate celulele bacteriene care au luat nastere, atât cele vii cât
si cele moarte, sau
• o numaratoare a germenilor viabili, cu o deosebita importanta practica si care apreciaza numarul de microbi
capabili sa se înmulteasca în continuare.

4.2. Curba de multiplicare a bacteriilor în mediu limitat

cuprinde urmatoarele faze:
• Faza de lag. În aceasta perioada nu se remarca o crestere a numarului de celule, cu toate ca ele cresc în
volum si dovedesc o activitate metabolica intensa. Durata acestei faze variaza în functie de specie, conditiile de
mediu, de numarul de celule din inocul si este intervalul de timp în care celulele se adapteaza noilor conditii de
mediu.
Astfel, daca mediul în care sunt inoculate celulele bacteriene difera de mediul din care au provenit, ele vor
trebui sa-si readapteze echipamentul enzimatic noilor conditii, renuntând la secretia unor enzime pe care le vor
înlocui cu altele. În aceasta faza se pot induce mutatii sau se produce selectia unor mutante capabile sa creasca sau
sa se înmulteasca pe noul mediu. Sensibilitatea bacteriilor fata de chimioterapice este crescuta. La majoritatea
bacteriilor de interes medical, durata ei este în jur de 1/2 de ora, iar la formele sporulate 3-4 ore.

• Faza exponentiala sau logaritmica este precedata de o faza de accelerare în care celulele bacteriene încep
sa se înmulteasca din ce în ce mai repede. Celulele se divid constant prin fisiune binara, deci în progresie
logaritmica, raportul dintre numarul bacteriilor si timp fiind liniar. Aceasta rata intensa de multiplicare este
posibila doar in vitro, in vivo ea fiind mult frânata de mecanismele apararii antiinfectioase. Durata acestei perioade
este dependenta de aceleasi conditii de mediu ca si faza precedenta dar si de specie. Astfel E.coli are un timp de
generatie de aproximativ 10 minute iar Mycobacterium tuberculosis peste 25 ore. Sensibilitatea la antibiotice a
microbilor ramâne crescuta. Compozitia mediului de cultura se modifica pâna la sfârsitul acestei faze pe de o parte
datorita consumului principiilor nutritivi iar pe de alta parte, acumularii de metaboliti. Faza de înmultire
logaritmica este urmata de o perioada de încetinire dupa care se instaleaza.

• Faza stationara. Multiplicarea bacteriilor în progresie logaritmica nu mai este posibila, rata de înmultire
scade treptat pâna când bacteriile trec în faza stationara. Numarul bacteriilor ramâne constant, de unde s-ar putea
deduce ca numarul bacteriilor care se nasc este egal cu cel al bacteriilor care mor. În realitate, însa, numarul
bacteriilor ramâne constant deoarece ele nici nu se înmultesc si nici nu mor. În aceasta faza, celulele nu mai cresc,
ci are loc o activitate metabolica endogena, prin care celula îsi sintetizeaza rezerve de energie si produsi
intermediari necesari mentinerii în viata în noile conditii. Încetarea multiplicarii în faza stationara se datoreaza în
principal epuizarii unui factor nutritiv esential din mediu, numit factor limitant si acumularii unor produsi toxici
cum sunt, de pilda, acizii organici care, prin scaderea pH-ul mediului, limiteaza multiplicarea bacteriilor. În acesta
faza scade sensibilitatea tulpinilor la chimioterapice.

Data fiind schimbarea conditiilor de viata ale bacteriilor, acestea vor prezenta modificari ale morfologiei si
fiziologiei lor, atât unele fata de celelalte, cât si comparativ cu faza exponentiala. Astfel, bacteriile gram-pozitive
nu mai retin cristalul violet si apar gram-negative pe frotiurile colorate.
În faza stationara celulele contin cantitati mari de polizaharide si lipide, substante pe care nu le gasim în faza
de multiplicare exponentiala. La începutul fazei stationare, unele specii bacteriene produc anumiti metaboliti
secundari cu distributie taxonomica foarte riguroasa. Acest metaboliti includ antibiotice, colicine   si exotoxine.
Initierea sporogenezei la bacteriile sporulate se petrece la sfârsitul fazei exponentiale sau la începutul fazei
stationare. Durata fazei stationare este în general de câteva ore.

• Faza de declin care dureaza mai multe zile se caracterizeaza prin scaderea numarului de bacterii,
remarcându-se o divergenta între curba care ilustreaza numarul total de bacterii si cea care reprezinta bacteriile vii.
Ea se datoreaza scaderii substantelor nutritive si acumularii de substante toxice pentru bacterii. La acesti factori se
adauga la unele specii bacteriene proprietatea de autoliza cu eliberarea continutului citoplasmatic în mediu.
Modificarile morfologice sunt pregnante atât în ceea ce priveste forma, dimensiunile cât si caracterele tinctoriale.
În timp mor toate bacteriile, cu exceptia celor sporulate, si cultura se autosterilizeaza.

Cultivarea bacteriilor în mediu limitat este utilizata în laboratoarele de bacteriologie medicala, pentru
stabilirea diagnosticului unei infectii bacteriene, caracterele culturale sunt deosebit de importante în identificarea
bacteriilor.

4.3. Curba de crestere si înmultire a bacteriilor

în culturi continue
Când se urmareste obtinerea unei mase mari microbiene sau a unor produsi bacterieni pentru cercetare,
preparare de vaccinuri, diversele industrii (farmaceutica, alimentara etc.), cultivarea bacteriilor se face în sisteme
deschise, în care mediul de cultura este permanent înlocuit cu mediu proaspat, îndepartându-se în acelasi timp
masa nou formata de bacterii. Bacteriile vor fi mereu în faza logaritmica, curba de înmultire având un aspect liniar.
În acest fel se obtin culturile continui, pentru realizarea carora este necesar un chimiostat sau un turbidistat.

4.4. Înmultirea bacteriilor în organism

Urmarind curba de multiplicare a bacteriilor într-un mediu limitat, putem deduce ca dupa patrunderea în
organism a unui numar mic de microbi, se poate produce o infectie. Un astfel de exemplu este meningita, în care
meningococul se înmulteste foarte rapid punând viata pacientului în pericol daca nu se intervine cu un tratament
antiinfectios.

Pe de alta parte, însa, nu toate bacteriile se divid repede. Baciul tuberculos, de pilda, a carui timp de generatie
este de 24 de ore, se va înmulti lent si va produce o infectie cu evolutie insidioasa, cronica.
În organism, cresterea si multiplicarea bacteriilor este diferita de multiplicarea in vitro, fiind stresata de
necesitati nutritive (prin competitie cu flora normala) si prin mecanismele de aparare antiinfectioasa. Conditiile pe
care microorganismele le întâlnesc în organism le selecteaza pe acelea care cresc în anumite limite de temperatura,
osmolaritate si pH.

Agentii infectiosi pe care îi gasim numai în organismele infectate vor supravietui in vitro numai în conditiile
de temperatura, osmolaritate si pH apropiate organismului nostru.
Microorganismele care au si alt habitat decât omul cresc în limite mai largi, necesitatile nutritive ale unui
microb reflectând, în general, habitatul lui. Astfel, goncocii, care traiesc aproape numai în organismul uman, au
pretentii nutritive mai mari necesitând pentru cultivarea in vitro medii speciale, pe când E. coli, Pseudomonas
aeruginosa si alte specii, care supravietuiesc frecvent în mediul înconjurator, numai medii minimale.
 La aspectele mentionate se adauga habitatul în organism al agentilor infectiosi. Astfel, bacteriile cu habitat
extracelular sunt expuse actiunii anticorpilor, complementului, fagocitozei, spre deosebire de bacteriile ce se
înmultesc intracelular si care sunt protejate de actiunea acestor factorii si scapa uneori supravegherii imunologice.
Bacteriile dezvolta mecanisme adaptative care sa ocoleasca barierele ce se opun înmultirii lor. Precizam ca si
în conditiile în care multiplicarea bacteriilor este oprita, simpla lor prezenta în organism poate constitui un
permanent stimul imunologic cu urmari benefice sau dimpotriva, daunatoare.

5. METODE DE CULTIVARE A BACTERIILOR

Cunoasterea necesitatilor nutritive ale bacteriilor este foarte importanta în bacteriologia medicala, deoarece
sta la baza prepararii mediilor de cultura destinate izolarii diverselor specii bacteriene din produsele biologice sau
patologice.
La începuturile dezvoltarii bacteriologiei, prepararea mediilor a fost artizanala, numerosi bacteriologi intrând
în istoria microbiologiei prin mediile pe care le-au preparat si care le poarta si astazi numele. Astfel, amintim, de
exemplu, mediul Loeffler pentru cultivarea bacilului difteric, mediul Löwenstein-Jensen pentru bacilul lui Koch,
mediul selectiv Wilson-Blair pentru salmonele si multe altele.
Prin cercetarea necesitatilor nutritive ale diferitelor specii s-au realizat medii adecvate pentru aproape toate
bacteriile de interes medical, speciile necultivabile fiind foarte putine, ca, de pilda, Mycobacterium leprae si unele
spirochete printre care Treponema pallidum.
Cultivarea bacteriilor în scop diagnostic pune în esenta doua probleme:
• alegerea unui mediu de cultura optim, care sa permita izolarea tuturor bacteriilor care ar putea fi prezente
în produsul de examinat si
• obtinerea bacteriilor în culturi pure, pentru a putea fi identificate.

5.1. Conditii generale pentru cultivarea bacteriilor

Un mediu de cultura uzual trebuie sa contina apa, substante organice, minerale, oligoelemente si factori de
crestere. Pentru satisfacea acestor necesitati se ultilizeaza diferite substraturi biologice nutritive complexe care au
în compozitia lor aceste ingredinente. Astfel:
- peptonele, care se obtin prin hidroliza enzimatica sau acida a proteinelor de origine animala (de exemplu
faina de oase). Ele nu au o compozitie chimica foarte bine definita, iar prin continutul în peptide si aminoacizi
constituie o sursa universala de azot, pentru toate bacteriile cultivabile, fiind folosite practic în prepararea tuturor
mediilor de cultura,
- extractul de carne, ce se obtine prin deshidratarea decoctului de carne de vita. Acesta contine cantitati
importante de creatina, xantina, hipoxantina, acid uric, acid adenilic, glicocol, uree, glutamina ca sursa de azot
precum si glicogen, hexozofosfati, acid lactic etc. ca sursa de carbon,
- extractul de drojdie, care se obtine prin cultivarea controlata a drojdiilor si care contine numeroase
vitamine, mai ales cele din grupul B,
În afara de ingredientele mai sus mentionate mai amintim:
- clorura de sodiu, care se adauga la mediile uzuale într-o concentratie de 0,9%. Pentru cultivarea bacteriilor
halofile concentratie poate creste pâna la 10%,
- mono sau polizaharidele, unii alcooli (glicerina, manitol) pot înmbogati mediile, deoarece constituie surse
de carbon usor accesibile multor bacterii,
Cultivarea microbilor pe medii lichide. Mediile lichide se folosesc cel mai adesea pentru înmultirea unor
microbi care se gasesc în numar mic într-un anumit produs. Cel mai simplu mediu folosit în laboratorul de
bacteriologie este bulionul care se prepara din decoct de carne de vaca, peptona si clorura de sodiu. Cultivarea
unui produs pe medii lichide are dezavantajul ca nu permite însa obtinerea unei culturi pure.

Caracterele culturale ale microbilor pe medii lichide difera. Astfel, bacteriile apartinând familiei Enterobacteriaceae
tulbura uniform mediul, altele, ca de pilda bacteriile strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia) formeaza pelicule la suprafata mediului.
Altele formeaza agregate care se dezvolta sub forma de grunji ce se depun pe peretele eprubetei sau la fundul mediului (Streptococcus).
Unele bacterii secreta în mediu pigmenti difuzibili ca de exemplu bacilul piocianic (Ps.aeruginosa).
 Cultivarea bacteriilor pe medii solide. Introducerea mediilor de cultura solide a însemnat un progres urias
în tehnicile de diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distincta a microbilor, sub forma de colonii izolate. O
colonie bacteriana este o micropopulatie ce rezulta din înmultirea unui singur microb pe un mediu, vizibila în
general cu ochiul liber.
Cel mai simplu mediu solid este geloza simpla, ce se obtine prin adaugarea la bulion a unei substanta
gelificabile, care de regula este geloza, un polizaharid obtinut din alga marina agar-agar. La aceast mediu simplu se
pot adauga diferite ingrediente (sânge de oaie, ser, ascita, extract de drojdie etc.) pentru a putea cultiva bacteriile
pretentioase.

Caracterele culturale sunt foarte importante în identificarea microbilor. Ele se apreciaza fie cu ochiul liber, fie
cu ajutorul unei lupe. Elementele ce se descriu, în general, sunt dimensiunea, forma, pigmentul, consistenta,
aderenta la mediu, activitatea hemolitica si unele modificari pe care microorganismele le produc în mediul
respectiv.
Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate si care se suspenda omogen în ser fiziologic se numesc
colonii de tip S (smooth), pe când coloniile aceleiasi specii, cu suprafata rugoasa, relief si margini neregulate si
care aglutineaza sponatan în ser fiziologic - colonii de tip R (rough). În general, cu unele exceptii, coloniile S
apartin tupinilor virulente, pe când cele R sunt nevirulente.

Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numaratoarea de germeni într-un anumit produs.
Acest aspect este deosebit de important deoarece în multe infectii criteriul de implicare etiologic este numarul
bacteriilor în produsul de examinat (infectii urinare).
Medii speciale. Exista situatii în care izolarea unui microb necesita medii deosebite care sa favorizeze
selectarea lui din produse intens contaminate.
Mediile de îmbogatire sunt medii lichide care permit înmultirea preferentiala a unui microb dintr-un amestec.
Astfel sunt mediile cu continut mare de clorura de sodiu (1-10%) în care se pot dezvolta numai bacterii halofile ca,
de exemplu, stafilococul (mediul Chapmann lichid) si enterococul. Unele medii de îmbogatire au ca factor electiv
anumite substante, ca, de exemplu, selenitul acid de sodiu, care permite dezvoltarea salmonelelor din materiile
fecale. Alte medii se bazeaza pe propietatea unor germeni de a se dezvolta la un pH mai acid sau mai alcalin decât
majoritatea speciilor bacteriene de interes medical. Astfel, vibrionul holeric se dezvolta la un pH alcalin (9) iar
brucelele la la un pH acid (6).

Medii selective. Daca un mediu de îmbogatire se solidifica, rezulta un mediu selectiv care are avantajul
obtinerii microbilor sub forma de colonii izolate. Datorita acestor medii, izolarea si identificarea bacteriilor este
astazi mult simplificata. Mediile selective, care se bazeaza pe particularitatile metabolice ale unor specii
microbiene sau mai ales pe rezistenta naturala a acestora la antibiotice, sunt utilizate în mod curent în laboratoarele
de bacteriologie, deoarece permit, practic, izolarea dintr-un amestec de microbi, a oricarui microb în cultura pura.

Mediile de diagnostic diferential sunt medii de cultura care evidentiaza anumite proprietati fiziologice si
caractere biochimice ale tulpinilor bacteriene pe baza carora acestea pot fi identificate. Astfel, de exemplu,
numeroase specii bacteriene se recunosc pe baza zaharurilor pe care le fermenteaza. Mediile de diagnostic cu
zaharuri contin zaharul de cercetat si un indicator de pH. În cazul în care bacteria însamântata în acest mediu va
fermenta zaharul, culoarea mediului se va schimba dupa câteva ore datorita scaderii pH-ului.

Daca în trecut mediile de cultura se preparau în laboratoarele de bacteriologie, astazi productia lor a devenit o
industrie puternica. Exista mii de firme care sunt într-o permanenta concurenta, rezultatul fiind elaborarea unor
medii de cultura din ce în ce mai performante, care usureaza si îmbunatatesc asistenta medicala microbiologica.

Fermentație și respirație

Bacteriile folosesc căi biochimice pentru a cataboliza (descompune) carbohidrații și produc energie prin

două mecanisme — fermentație și respirație (denumită în mod obișnuit oxidare). Fermentaţia este un

proces anaerob desfășurat de către (obligatoriu, facultativ) anaerobii aerotoleranti. În fermentație,

acceptorul de electroni este un compus organic. Fermentarea este mai puțin eficientă din punct de vedere

al generarii energiei decât respirația deoarece substratul de început nu este complet redus; prin urmare,

toată energia din substrat nu este eliberată.

Pe lângă faptul că permite creșterea în absența oxigenului, fermentația este și ea importantă pentru că

generează nicotinamidă adenin dinucleotidă (NAD), o moleculă necesară pentru menținerea ciclului

Krebs. Când are loc fermentația, un amestec de produse finite (de exemplu, lactat, butirat, etanol și

acetoină) se acumulează în mediu.

Analiza acestor produse finite este deosebit de utila pentru identificarea bacteriilor anaerobe.

Determinarea produsului final este utilizată și în Voges-Proskauer (VP) și testele roșu de metil, două teste

de diagnostic importante utilizate în identificarea Enterobacterales. Termenul de fermentație este adesea

folosit în laboratorul de microbiologie de diagnostic pentru indica orice tip de utilizare – fermentativă sau

oxidativă – a unui carbohidrat — zahăr — cu producerea rezultată a unui pH acid.

Respirația aerobă (oxidarea) este un generator eficient de energie, proces în care oxigenul molecular (O2)

este acceptorul final de electroni. Anumiți anaerobi pot efectua respirație anaerobă, în care molecule,

altele decât oxigenul molecular, cum ar fi nitratul și sulfatul, acționează ca acceptori finali de electroni.

Respirația anaerobă consuma mai puțină energie decât respirația aerobă.

S 8. Genetica bacteriană: organizarea materialului genetic la bacterii, funcții, ereditatea și

variabilitatea genetică; replicarea, transcrierea și traducerea mesajului genetic. Mecanisme ale
variabilității genetice. Bacteriofagul.

GENETICA BACTERIANĂ
Ereditatea este însuşirea generală biologică a tuturor vieţuitoarelor de a transmite
caracterele specifice speciei la urmaşi iar variabilitatea apariţia unor caractere diferite de cele
ale genitorilor.
Dintre cele două laturi ale geneticii bacteriene, variabilitatea este cea care interesează
medicina în mod deosebit. Modificarea zestrei ereditare la bacteriilor dă naştere unor tulpini
bacteriene noi care, prin virulenţă şi rezistenţa la chimioterapice, se adaptează mai bine
condiţiilor de mediu şi înlocuiesc bacteriile mai puţin adaptabile.

Un exemplu foarte sugestiv în acest sens îl reprezintă modificarea, numai într-un secol, a
etiologiei infecţiilor nosocomiale  1. Astfel, agenţii etiologici ai hospitalismului clasic ca, de pildă,
bacteriile din genurile Clostridium şi Streptococcus, se întâlnesc astăzi extrem de rar, ei fiind
înlocuiţi cu agenţii etiologici ai hospitalismului modern care sunt tulpini multirezistente la
antibiotice ce aparţin speciilor Staphylococus aureus, Pseudomonas aeruginosa, familiei
Enterobacteriaceae etc.
Pentru a înţelege mecanismele variabilităţii, vom schiţa, pe scurt, bazele structurii, replicării
şi funcţionalităţii materialul genetic la bacterii.

1. SUPORTUL MATERIAL AL EREDITĂŢII

Totalitatea caracterelor unei bacterii sunt determinate genetic, informaţiile fiind codificate
de ADN. Exprimarea manifestă a acestor caractere constituie fenotipul unei tulpini iar
informaţiile care le codifică genotipul.
Genetica moleculară, în general, a avut ca punct de pornire studiul bacteriilor şi
bacteriofagilor.
În anul 1892 August Weisman susţinea, deja, că esenţa eredităţii constă în transmiterea
la descendenţi a unei substanţe nucleare cu structură moleculară specifică. Cunoaşterea
precisă a substanţei care păstrează şi transmite caracterele ereditare a parcurs un drum lung,
care a început în anul 1928 prin experienţele bacteriologului englez Fred Griffith.

Griffith a pornit de la observaţia că pneumococul de tip S, virulent, capsulat, injectat la

şoarecele alb produce la acesta septicemie mortală, în timp ce injectarea pneumococului de tip
R, nevirulent, necapsulat, sau a pneumococului de tip S capsulat omorât prin căldură rămâne
fără efect. Injectând însă un amestec dintr-o tulpină de pneumococ de tip R necapsulat,
nevirulent, viu şi o tulpină de pneumococ de tip S, capsulat, omorât prin căldură, la şoarece,
acesta a dezvoltat o septicemie mortală.

Prin hemocultură s-a izolat pneumococ viu, de tip S, capsulat. Griffith a tras concluzia că
pneumococul viu de tip R necapsulat a preluat un “principiu transformant” de la pneumococul
de tip S omorât, principiu ce îi permite sinteza factorului de virulenţă - capsula.

Precizarea naturii acestui principiu transformant este meritul unui colectiv format din Avery,
Mc Leod şi Mc Carty, care în anul 1944 au extras diferite substanţe din pneumococul virulent
(polizaharid capsular, lipide, proteine, acizi nucleici) şi au arătat că transformarea
pneumococului de tip R se face numai în prezenţa acidului dezoxiribonucleic provenit de la
pneumococul de tip S.
Dovada hotărâtoare că ADN este depozitarul informaţiei genetice a fost adusă după
descoperirea bacteriofagului de către Twort şi d’Herelle, independent în 1915 şi 1917. Atunci
s-a demonstrat că bacteriofagul îşi injectează numai ADN în celula gazdă şi că acesta singur
este capabil să determine în celula gazdă sinteza de bacteriofagi compleţi, identici cu cei de la
care provenea acidul nucleic.

1.1. Structura ADN

ADN este format din 2 catene spiralate complementare şi de polaritate inversă (modelul
Watson şi Crick), fiecare fiind rezultatul polimerizării într-o anumită ordine a untăţilor structurale
de bază a acizilor nucleici, nucleotidele. Acestea sunt formate la rândul lor dintr-o moleculă de dezoxiriboză, o
moleculă de acid ortofosforic şi dintr-una din bazele azotate purinice - adenina (A) şi guanina (G) -
sau pirimidinice - citozină (C) şi timina (T).

Scheletul spiralei este format din acidul ortofosforic şi dezoxiriboză de care se leagă bazele
azotate. Complementaritatea celor două lanţuri de nucleotide se realizează prin relaţiile sterice
ce se stabilesc între bazele complementare, iar legăturile prin punţi de hidrogen.
 Proporţia de baze complementare este constantă în cadrul unei specii, raportul
adenină-timină/guanină-citozină (AT/GC) servind drept criteriu taxonomic de bază în
clasificarea modernă a bacteriilor.

1.2. Replicarea ADN

Structura dublu spiralată a ADN permite replicarea lui identică, semiconservativă. Spirala
se deschide ca un fermoar la locul iniţial al replicării sub acţiunea unei ADN-giraze. Pe fiecare
spirală se va sintetiza o spirală nouă, complementară, cu participarea ADN - polimerazei (I, II,
III) din direcţia capătului 5' terminal spre capătul 3' terminal.

1.3. Transcripţia şi translaţia

S-a stabilit că specificitatea biologică a funcţionalităţii ADN constă în secvenţa de
nucleotide. Cele 4 baze se succed în lanţul de ADN într-o ordine specifică ce se aseamănă cu
un text, secvenţa lor reprezentând conţinutul textului. Fiecare aminoacid dintr-un polipeptid este
codificat de trei nucleotide consecutive (triplet) ce alcătuiesc un codon. Codul genetic este
corespondenţa dintre secvenţa codonilor şi cea a aminoacizilor în cadrul unui polipeptid.
O genă reprezintă o anumită secvenţă de nucleotide ce codifică structura primară a unui
polipeptid care funcţionează direct sau împreună cu alte polipeptide ca enzimă sau proteină
structurală.
Pe lîngă genele care codifică polipeptide, există, de asemenea, gene ce codifică ARN-ul
ribozomal şi ARN-ul de transfer.
Transcripţia reprezintă transcrierea codului genetic de pe ADN pe ARNm, proces la care
participă o ARN - polimerază ADN dependentă. Această enzimă găseşte prin intermediul unui
factor promotorul, locul de legare şi recunoaştere situat deasupra genei, sau a genelor din
ADN care codifică ARNm. La bacterii, promotorul este reprezentat de regulă de 40 de baze.
ARN-polimeraza determină separarea catenelor de ADN şi iniţierea transcripţiei ARNm. Punctul
de start corespunde primului nucleotid de m - ARN. Terminatorul este reprezentat de o
succesiune de baze care încheie sinteza de ARNm. Cei mai mulţi ARN-m bacterieni sunt
policistronici, deci conţin informaţii codificate de mai multe gene.
Ceea ce deosebeşte transcripţia la celulele procariote de cele eucariote este faptul că
translaţia începe imediat după iniţierea transcripţiei informaţiei în ARNm, înainte chiar ca
sinteza acestuia să fie încheiată. Procesul de cuplare transcripţie-translaţie este regulă la
bacterii.

Translaţia reprezintă transpunerea, respectiv concretizarea, informaţiei m-ARN la nivelul

ribozomilor în secvenţa de aminoacizi din cadrul unui polipeptid.
ARN-m transpune informaţia de pe gena corespunzătoare la ribozomi nespecifici, cărora le
conferă o specificitate temporară sintezei unui anumit polipeptid. Ribozomul se “înşiră” pe
ARNm, acesta fixându-se de unitatea 30S a ribozomului.
Aminoacizii sunt aduşi la ribozomi de ARNt sub forma de aminoacyl - tARN, pentru fiecare
dintre aminoacizi existând cel puţin un ARN de transfer. Acesta poartă un anticodon
complementar codonului de pe m-ARN. De exemplu, ARNt pentru metionină are un anticodon
UAC, ce se va lega de codonul AUG de pe ARNm.

Iniţierea şi terminarea translaţiei secvenţei de nucleotide ale m-ARN într-o secvenţă de

aminoacizi într-un peptid sunt determinate de codoni speciali, codon start şi stop. Regiunea
ARN-m dintre cele 2 semnale se numeşte regiune de codare, iar intervalul dintre 2 asemenea
segmente, regiune intercistronică.

Sintezei oricărui polipeptid începe prin fixarea anticodonului de pe ARNt pentru

formilmetionină pe codonul de iniţiere (start) de pe ARNm situat în poziţia A a ribozomului (locul
de fixare a aminoacidului). Menţionăm că formilmetionina transportată aici de ARNt nu participă
la structura polipeptidului, ci are numai rol de iniţiere a sintezei. În cazul când intră în structura
polipeptidului, ea trebuie să fie neformilată. (Formil-metionina este o substanţă
chemoatractantă puternică pentru leucocite, influenţând deci apărarea antinfecţioasă.)

După fixarea anticodonului de codonul metioninei, ribozomul se deplasează de-a lungul

ARNm în aşa fel încât pe poziţia A a ribozomului trece codonul următor al ARNm, iar ARNt
legat de ARNm trece în poziţia P a ribozomului (locul de elongare propriu-zisă a peptidului). În
poziţia A vine următorul aminoacyl-ARNt. Între metionină şi al doilea aminoacid se realizează
legătura peptidică (NH-CO-) şi ARNt al celui de al doilea aminoacid este eliberat. Ribozomul
suferă din nou o translocaţie.

Poziţia A este din nou liberă pentru al următorul ARNt, iar în poziţia P se află primul ARNt
de care este legat un dipeptidul rezultat. La acesta se va adăuga un al treilea aminoacid adus
la ribozom şi aşa mai departe până se încheie sinteza polipeptidului care este semnalată de un
codon nonsens (stop) de pe ARNm. În această etapă lanţul peptidic este eliberat din legătura
cu ARNt şi ARNm şi ribozom.

1.4. Reglarea activităţii genelor

Jacob şi Monod au imaginat un model de funcţionare al genelor bacteriene care a fost
demonstrat ulterior experimental. Scopul mecanismelor de control genetic la bacterii este
ajustarea metabolismului la condiţiile mediului înconjurător în aşa fel încât creşterea şi
multiplicarea să se producă în condiţii optime. Aceste mecanisme ale reglării negative, prezente
numai la procariote, pot fi prezentate sintetic după cum urmează:

• genele structurale codifică sinteza unor enzime care aparţin unei anumite linii
metabolice sunt situate una după alta şi formează o unitate care se numeşte operon. Acesta
este delimitat de secvenţele de control care sunt:
- operatorul, care reprezintă porţiunea de ADN din structura operonului care
recepţionează semnalele asigurând funcţionarea coordonată a operonului, promotor şi
terminator;
- promotorul, care este situat lângă operator şi iniţiază transcrierea genei structurale. La
unii operoni operatorul şi promotorul sunt identici. La alţii ei sunt învecinaţi, sau chiar se
întrepătrund;
- terminatorul, care incheie transcriptia;

• genă reglatoare conduce activitatea unui operon şi codifică sinteza unui represor.
Acesta, prin configuraţia sa sterică este capabil să se fixeze pe operator, blocînd activitatea m-
ARN polimerazei.

• activitatea proteinei represoare este indusă sau oprită printr-un efect alosteric
determinat de molecule semnal. Astfel, unele substanţe, ca de exemplu lactoza, inactivează
represorul, rezultatul fiind declanşarea activităţii genelor care codifică enzimele catabolizante
ale lactozei. Substanţele care inactivează represiunea se numesc inductori. Produşii finali de
degradare a unui substrat, activează represorul. Astfel operonul anabolizant, ce codifică
enzimele sintetice va fi inhibat. Produşii operonilor anabolici, ce activează represorul se
numesc corepresori.

2. ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC LA BACTERII

 Genomul bacterian este alcătuit din repliconi, care sunt formaţiuni genetice ce se pot
replica independent. Astfel, se descriu:
• cromozomul bacterian
• elemente genetice extracromozomiale - plasmide
- genomul bacteriofagilor
• elementele genetice transpozabile - fragmentele de inserţie (IS)
- transpozonii (Tn).

2.1. Cromozomul bacterian

Majoritatea genelor bacteriene se găsesc într-un cromozom haploid, echivalent nuclear
care codifică informaţiile absolut necesare supravieţuirii speciei în condiţii normale.

Cromozomul la Escherichia coli este format dintr-o moleculă circulară dublu spiralată de
ADN ce reprezintă 80% din greutatea lui, dintr-o componentă proteică, ARN-polimeraza care
reprezintă 10% iar restul de 10% din ARNm şi ARNr în curs de sintetizare.

Pe lângă dispoziţia dublu spiralată spre dreapta a catenelor de ADN (o spiră = 10 baze),
acestea suferă o suprahelicare spre stânga (o spiră suprahelicată = 15 spire). Acest mod de
organizare denumit “supercoil” sau “supertwist” asigură pe de o parte “împachetarea”
economică a ADN şi pe de altă parte o configuraţie optimă activităţii funcţionale a ADN
(replicare, transcripţie, recombinare). Modelul de împachetare a nucleului bacterian a fost
descris de Pettijohn şi Hecht (1973) pentru E. coli şi se pare că are un caracter general la
bacterii.

2.2. Formaţiunile genetice extracromozomiale

2.2.1. Plasmidele
Plasmidele sunt formaţiuni genetice autonome, extracromozomiale, libere în citoplasmă,
reprezentate de molecule circulare de ADN care se replică independent de cromozom.
Denumirea de plasmide le-a fost dată de Lederberg în 1952, iar importanţa lor practică a fost
sesizată în 1963 de Watanabe, o dată cu descoperirea posibilităţii transmiterii prin plasmide a
rezistenţei la antibiotice între bacterii .

Bacteriile conţin foarte frecvent plasmide, descriindu-se peste 1.000 de tipuri diferite.
Lungimea acestor molecule variază între 1-150 mm şi greutatea moleculară între 2-3 milioane
(3x103 până la 450x103 perechi de baze). Plasmidele mici se găsesc de obicei într-o celulă
bacteriană în 10-40 de copii, pe când cele mari în număr mai redus de 1-3 copii. În aceeaşi
celulă nu pot coexista mai multe plasmide înrudite (cu mecanism comun de control al replicării),
ele fiind incompatibile, spre deosebire de cele neînrudite (cu mecanism distinct de reglare al
replicării), care sunt compatibile. Compatibilitatea exprimă competiţia plasmidelor pentru un
anumit situs de legare în celula bacteriană.

Plasmidele pot fi:

 • conjugative, care se pot transfera singure la alte bacterii, ca de exemplu plasmidele de
rezistenţă la antibiotice R,
• neconjugative, care nu pot părăsi ele însăşi bacteria de origine, ci numai prin intermediul
unui alt plasmid conjugativ sau a unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codifică secreţia
de beta-lactamază la S.aureus)
• episomi, care se pot integra prin recombinare în cromozomul bacterian, pierzându-şi
astfel autonomia de replicare. Un exemplu de episom este factorul de sex F (plasmidul F sau
factorul de fertilitate).
Determinanţii genetici esenţiali ai plasmidelor codifică informaţiile legate de replicarea lor
autonomă, iar cei accesorii caractere fenotipice neesenţiale supravieţuirii celulei bacteriene în
condiţii naturale: gene de transfer (tra), de rezistenţă la antibiotice (factorul R), de secreţie a
colicinelor (factorul col), de secreţie a unor toxine, de metabolizarea unor substraturi, de
rezistenţă la unii ioni şi compuşi organometalici etc. Unele plasmide nu au un efect observabil
asupra fenotipului bacteriei şi se numesc plasmide criptice.

Pentru medicină importantă este cunoaşterea plasmidelor de virulenţă şi a celor care

conferă bacteriilor rezistenţa la antibiotice.

Plasmidele de virulenţă poartă determinanţii genetici ai unor factori de virulenţă la

bacterii, ca de exemplu secreţia de enterotoxina (termolabilă şi termostabilă) şi factorul de
colonizare la Escherichia coli, hemolizina la Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis şi
E.coli, exfoliantina la S. aureus, gena de invazivitate la Shigella etc.

Plasmidele R - de rezistenţă la chimioterapice (Factorul R) sunt molecule circulare de

ADN care constau în esenţă din două regiuni genetice distincte: genele care codifică rezistenţa
la antibiotice “R”, care pot fi unice sau multiple şi genele care conferă plasmidului capacitatea
de a se transfera “FTR”.

Rezistenţa la peste 90% din tulpinile de spital este de natură plasmidică. Existenţa acestor
plasmide se explică prin aglomerarea mai multor gene de rezistenţă R, pe acelaşi plasmid, prin
fenomenul transpoziţiei repetate de material genetic. Plasmide de rezistenţă au fost evidenţiate
la genurile Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia, Klebsiella, Serratia din
familia Enterobacteriaceae, la genurile Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Yersinia,
Pasteurella, Campylobacter, Haemophilus, Neisseria, Bacteroides, Staphylococcus,
Streptococcus, Bacillus, Clostridium, şi Corynebacterium. Plasmidele prezente la bacilii gram-
negativi sunt mai mari decât cele evidenţiate la bacteriile gram-pozitive.

Plasmidul F se mai numeşte şi plasmid de sex, sau factor de fertilitate şi conţine, pe lângă
alţi determinanţi genetici, genele de transfer tra. Plasmidul F se poate transmite altor celule
bacteriene prin conjugare. El se poate integra în cromozomul bacterian putând media
transferul de gene cromozomiale de la o celulă bacteriană donor la cea receptor . În
funcţie de prezenţa factorului F, bacteriile se împart în:
• bacterii F- lipsite de factorul F, denumite celule femele şi care sunt receptoare de
material genetic,
• bacterii F+, masculine, care au factorul F+, autonom, ca plasmid în citoplasmă şi care
sunt celule donoare,
• bacterii Hfr care au factorul F+ integrat în cromozom, de asemenea masculine,
• bacterii F' care au factorul F+ ca plasmid autonom, după ce acesta a fost integrat în
cromozom şi l-a părăsit rupând un fragment ADN din cromozom. și aceste celule sunt donoare,
deci masculine.

2.2.2.Bacteriofagii
Sunt virusuri care parazitează bacteriile. Se cunosc 6 grupe morfologice de bacteriofagi,
cei mai bine studiaţi fiind bacteriofagii T ai E. coli.
Morfologie. Bacteriofagii sunt formaţi dintr-un cap hexagonal, un gât şi o prelungire numită
picior (coadă). Capul este alcătuit dintr-un înveliş proteic caracteristic virusurilor (capsida) şi
adăposteşte ADN. Coada este un cilindru rigid învelit într-un manşon proteic asemănător
miozinei şi se termină cu o placă hexagonală ce conţine o enzimă de tipul lizozimului. De placa
bazală se prind 6 fibre si crosete cu rol în fixarea bacteriofagului pe suprafaţa bacteriei.

Ataşarea bacteriofagului pe suprafaţa peretelui bacterian este determinată de existenţa

unor receptori de perete, specifici. Această specificitate este de tip enzimatic şi stă la baza
lizotipiei. După ataşare are loc contracţia manşonului proteic şi bacteriofagul îşi injectează
numai ADN în celula bacteriană.

După pătrunderea genomului fagic în celula bacteriană, acesta va determina sinteza de noi
bacteriofagi identici cu cel de la care a provenit ADN. ADN se replică prin replicare
semiconservativă iar ribozomii bacterieni vor sintetiza proteinele capsidale şi ale cozii. După
asamblarea noilor virusuri ele vor părăsi celula bacteriană care se lizează. Acesta este ciclul
litic al bacteriofagilor, iar ei se numesc fagi virulenţi.

Dar nu întotdeauna relaţiile bacteriofag-bacterie evoluează în acest fel. Uneori genomul

bacteriofagului se va integra în cromozomul bacterian încadrându-se şi funcţional în acesta. În
această situaţie el nu se mai replică decât în acelaşi timp cu cromozomul bacterian, deci în
timpul diviziunii bacteriene şi se numeşte profag. Acest ciclu este ciclul lizogen iar
bacteriofagii se numesc fagi temperaţi.

Lizogenia are următoarele consecinţe pentru bacteria în cauză:

• bacteria lizogenizată este imună la infecţia cu acelaşi bacteriofag, dar nu pentru alţi
bacteriofagi
• profagul codifică el însuşi unele caractere pe care le dobândeşte astfel bacteria lizogenă.
Un exemplu clasic în acest sens este toxigeneza la bacilul difteric care este codificată de un
profag ce se află în cromozomul bacterian. Tulpinile de bacili difterici care nu sunt lizogenizate
de acest profag, nu sunt capabile să secrete toxina şi sunt, deci nepatogene,
• transducţia, mecanism de transfer genetic de la o bacterie la alta, mediată de bacteriofagi
şi asupra căreia vom reveni la variabilitatea bacteriană.

2.3. Elemente genetice transpozabile

Elementele genetice transpozabile sunt fragmentele de inserţie (IS) şi transpozonii (Tn).
IS şi Tn sunt fragmente mici de ADN cu limite structurale bine precizate care se pot integra
repetat în mai multe situsuri dintr-un genom. Existenţa lor a fost presupusă încă în anul 1931 şi
în anul 1952 de Barbara Mc Clintock care le-a denumit “gene săltăreţe” (jumping genes).
Descoperirea a fost primită cu mult scepticism şi neîncredere la vremea respectivă, dar timpul a
dovedit importanţa ei, autoarea fiind onorată cu premiul Nobel în anul 1983.

3. VARIABILITATEA LA BACTERII

Bacteriile sunt supuse aceloraşi legi ale ereditătii, unitare lumii vii, cu unele particularităţi
dictate de organizarea materialului genetic. Astfel, în timpul diviziunilor succesive (în lipsa unui
accident genetic) toţi descendenţii unei bacterii sunt identici între ei şi identici cu celula din care
provin. Aceasta este descendenţa verticală cu formare de “clone” de indivizi identici, stabilitatea
fiind posibilă datorită cromozomului haploid cu set unic de gene.

Variabitatea la bacterii, latură a geneticii care are implicaţii deosebite în medicina practică,
poate fi explicată prin două procese fundamentale:
• variaţia fenotipică, care reprezintă schimbarea unor însuşiri ale bacteriilor, ca adaptare la
condiţiile mediului înconjurător, fără să intervină vreo modificare în genomul bacterian şi
• variaţia genotipică, ce rezultă prin modificarea genomului.
Apariţia modificărilor genetice la bacterii este cunoscută de mult dar nu s-a ştiut, însă, dacă
aceste modificări urmează aceleaşi legi ca şi la organismele cu organizare superioară. În 1943
s-a dovedit faptul că modificările proprietăţilor unei populaţii bacteriene este rezultatul unor
variaţii rare la un număr mic de celule, care se selectează şi dau naştere unei populaţii noi.
Variabilitatea la bacterii se produce prin: mutaţii, transfer de material genetic şi transpoziţie.

3.1. Mutaţia
Modificările spontane ale genomului se numesc mutaţii şi constau din modificarea
secvenţei de nucleotide dintr-o genă. Ele pot fi punctiforme, inversii, inserţii, deleţii şi mutaţii
secundare.
Mutaţiile punctiforme afectează un singur nucleotid în cadrul unei gene şi sunt reversibile.
Consecinţele unei astfel de mutaţii pot fi:
• înlocuirea unui codon cu altul, ceea ce se va traduce prin înlocuirea unui aminoacid cu
altul din structura unui polipeptid. Această mutaţie se numeşte “mutaţie cu sens greşit”,
• apariţia unui codon nonsens. Mutaţia nonsens împiedică sinteza în continuare a unui
polipeptid, iar dacă ea se produce la începutul genei ce codifică un polpeptid - mutaţie polară,
acesta nu se va mai putea sintetiza deloc.

Inserţia şi deleţia înseamnă adăugarea, respectiv pierderea a două până la sute sau chiar
mii de nucleotide, procesul fiind ireversibil. Acest tip de mutaţie duce la modificarea importantă
a secvenţei de aminoacizi, fiind denumită “mutaţie cu schimbare de proiect”.
Mutaţiile secundare sunt mutaţiile reverse, care restabilesc o secvenţă nucleotidică ce s-a
modificat, iar mutaţiile supresoare permit exprimarea funcţiei anterioare a unei gene care a
suferit o mutaţie, fără restaurarea codonilor iniţiali. Acest fenomen se explică prin sinteza unui
ARNt care “ştie” să citească un codon nonsens.

Frecvenţa pe unitatea de timp cu care se produc mutaţiile este diferită şi se numeşte rată
de mutaţie. Mutaţia spontană poate varia de la genă la genă între 10 -6 şi 10-10.
Mutaţiile duc la apariţia unor indivizi cu caractere noi, cum sunt rezistenţa la chimioterapice,
structură antigenică modificată, pierderea unor receptori specifici pentru bacteriofagi, pierderea
capacităţii de sinteză a unui metabolit etc.

Din punct de vedere medical interesează în mod deosebit mutaţia spre chemorezistenţă
care se poate produce dintr-o dată, adică “one-step”, sau în mai multe etape, “multistep”.

Prin mutaţie “one-step” bacteria devine rezistentă brusc “peste noapte” la un antibiotic, pe
când prin mecanism multistep se produc mutaţii multiple, succesive, până ia naştere o mutantă
rezistentă la concentraţii ridicate de antibiotic. Astfel prima mutantă va fi puţin mai rezistentă
decît tulpinile sălbatice din care provine, mutanta a doua mai rezistentă decît mutanta 1 etc.

Dat fiind că mutaţiile naturale sunt rare, este necesar un mijloc care să selecteze mutanta
pentru ca aceasta să se transforme într-o populaţie bacteriană cu proprietăţi noi.
Rata mutaţiei poate fi crescută în mod considerabil prin agenţi mutageni, ca, de pildă, raze
X, UV, derivaţi acridinici, agenţi alchilanţi etc.

Mutaţiile spontane sau induse pot duce la “pierderea” integrală a unui plasmid printr-o
modificare ce produce deficienţe ale mecanismului de replicare, astfel încît plasmidele nu vor
mai fi “moştenite” de celulele fiice.

3.2.Transferul de material genetic

Organismele superioare se reproduc sexuat. Materialul genetic a 2 indivizi de sex opus se
transmite combinat urmaşilor. Bacteriile se înmulţesc vegetativ prin diviziune directă, deci
materialul genetic provine de la o singură celulă. Cu toate acestea există şi la bacterii
mecanisme care permit schimbul de material genetic de la o bacterie la alta. Dat fiind că aceste
mecanisme nu urmează legile sexuale ale transmiterii caracterelor ereditare, ele se numesc
mecanisme parasexuale. Transmiterea materialului genetic de la celula donor la celula receptor
este unidirecţională şi se realizează prin transformare, transducţie şi conjugare.

3.2.1.Transformarea
Reprezintă transferul de material genetic de la o celulă donor la una receptor sub forma de
ADN pur, eliberat fie prin liza celulei donor, fie prin extracţie chimică. Acest proces a fost
observat pentru prima oară la pneumococi de Griffith în 1928. ADN-ul pneumococilor virulenţi,
capabili să sintetizeze capsula, s-a transferat la mutante R, nevirulente, acestea din urmă
dobândind capacitatea de a sintetiza capsula. Transformarea s-a pus în evidenţă ulterior la
numeroase genuri cum sunt, de pildă, Streptococcus, Haemophilus, Bacillus, Neisseria,
Salmonella etc. şi se petrece nu numai între tulpiile aceleiaşi specii, ci şi între specii diferite.

Transformarea genetică este posibilă numai dacă bacteria receptoare se află în stare de
competenţă, stare care-i permite înglobarea de ADN străin. Competenţa este o stare fiziologică
temporară a bacteriei, care variază în funcţie de specie şi de faza de multiplicare în care se află
bacteria. După unii autori, celulele competente au pe suprafaţa lor un antigen special numit
factor de competenţă. În timpul stării de competenţă se modifică structura peretelui celular, care
devine mai poros, încărcat electropozitiv, favorizând legarea ADN-lui străin.

Transformarea depinde în egală măsură şi de unele proprietăţi ale ADN transformant, cum
sunt structura dublu catenară şi o dimensiune minimă a moleculei de 1 x 106 daltoni.
Cu toate că transformarea s-a descoperit experimental şi se practică astăzi pe scară foarte
largă în tehnicile de inginerie genetică, ea se petrece în mod natural în mediile în care trăiesc
împreună multe specii bacteriene şi unde procesul de liză a celulelor bacteriene este frecvent,
ca de exemplu în colon . Aici se pun în libertate cantităţi mari de ADN care, dacă întîlneşte
celule bacteriene în stare de competenţă, va pătrunde şi se va recombina cu genomul acestora,
conferindu-le caractere noi.
Majoritatea bacteriilor nu sunt în mod natural capabile de transformare dar experimental s-
au dezvoltat metode de inducere artificială a stării de competenţă foarte utile ingineriei
genetice.
3.2.2.Transducţia
Transducţia reprezintă un transfer de gene cromozomiale de la o celulă bacteriană la alta,
mediat de bacteriofagi. Unii bacteriofagi sunt capabili să transfere orice genă bacteriană
(transducţie generalizată) iar alţii numai anumite gene (transducţia specializată).
Transducţia generalizată este mediată de fagii virulenţi, litici, care după pătrunderea în
celula bacteriană se multiplică şi determină liza celulei gazdă. În timpul lizei celulei bacteriene
cromozomul acesteia se fragmentează. Se poate întîmpla, ocazional, ca un fragment cu o
dimensiune apropiată de cea a genomului fagic să se integreze în capisda bacteriofagului, în
locul genomului fagic.

Astfel de fagi sunt defectivi şi nu se vor mai putea replica, dar pot pătrunde în alte celule
bacteriene injectîndu-le ADN-ul, ce provine de fapt din genomul celulei donoare. ADN-ul se va
integra în cromozomul celulei receptoare prin recombinare, conferindu-i acesteia caractere noi,
ca, de exemplu, rezistenţa la chimioterapice, proprietăţi ce ţin de patogenitatea bacteriei etc.

Transducţia specializată este mediată de fagii temperaţi. După pătrunderea în celula

bacteriană a ADN-lui bacteriofagului temperat, acesta suferă iniţial un proces de circularizare
după care se inseră în cromozom prin recombinare sub forma de profag. Inserţia în cromozom
se face pe baza homologiei dintre 10 perechi de bază ale ADN fagic şi bacterian. Profagul
devine parte integrantă a cromozomului bacterian, se va replica o dată cu acesta şi nu
independent, deoarece este supus unui proces de represie din partea genomului gazdă.

Bacteriile care au integrate în cromozomul lor un profag sunt în stare de lizogenie. În

anumite condiţii, însă, are loc un proces de derepresie şi genomul bacteriofagic părăseşte
cromozomul bacterian devenind din nou autonom. Când părăseşte cromozomul bacterian
poate detaşa din acesta un fragment de ADN care va rămâne legat de genomul bacteriofagic.
Acest bacteriofag nu se va putea înmulţi, fiind defectiv, dar va putea intra în altă celulă
integrându-se în cromozomul acesteia tot sub forma de profag. Fragmentul provenit de la prima
celulă bacteriană poate să codifice diferite caractere (rezistenţa la antibiotice, secreţia unor
enzime, toxine etc.), ce se vor manifesta fenotipic la noua bacterie gazdă.

Cel mai bine studiat exemplu de transducţie specializată este cea mediată de fagul lambda
şi gena bacteriană ce codifică degradarea galactozei (lambda-gal).

Transducţia specializată nu trebuie să se confunde cu conversia lizogenă. In acest caz

caracterul nou al celulei bacteriene este codificat chiar de genomul bacteriofagului temperat.
Fenomenul a fost descris pentru prima oară, aşa cum am mai arătat, la Corynebacterium
diphteriae, toxigeneza fiind tributară prezenţei unui fag temperat în cromozomul bacterian.

3.2.3.Conjugarea
Conjugarea este transferul de material genetic de la o bacterie donoare la una receptoare
printr-un proces de împerechere, ce se realizează prin contactul direct dintre cele două celule.
Prin conjugare se pot transmite plasmide, precum şi gene cromozomiale (prin intermediul
factorului F+).

Conjugarea la bacilii gram negativi.

 Factorul F+ poate fi situat, aşa cum s-a mai arătat, într-un plasmid, favorizând transferul
acestuia sau în cromozomul bacterian, făcând posibil transferul unor gene cromozomiale de la
o bacterie la alta. Celulele bacteriene care au factorul F+ integrat în cromozom se numesc Hfr
(high freqency of recombination ), deoarece ele pot transfera material genetic cromozomial cu o
frecvenţă mare, ceea ce duce la recombinarea unor gene din cromozomul bacteriei donoare cu
material genetic al cromozomului celulei receptoare.

Prin intermediul factorului F+ inserat în cromozom se poate transfera o copie întreagă a

cromozomului celulei donoare la cea receptoare.

Transferul integral durează în jur de 100 minute. Procesul de împerechere este un mijloc
ideal de localizare a genelor pe cromozomul celulei donoare. Ca celulă donoare se alege o
tulpină Hfr. Aceasta va fi cultivată cu celule F-. Prin agitare puternică a mediului se intrerupe
procesul de împerechere la anumite intervale de timp, şi se caută recombinanţi printre celulele
receptoare. Cu cît întreruperea recombinării se produce mai repede cu atît gena studiată se
află mai aproape de vârful moleculei de ADN transferată.

Transferul prin conjugare a plasmidelor este condiţionată de prezenţa în plasmid a

genelor de transfer tra, care sunt responsabile de sinteza sex-pilului şi de transferul
plasmidului.
Conjugarea începe prin sinteza sex-pilului care va adera de receptori specifici prezenţi pe
peretele celular al bacteriei receptoare. După formarea legăturii dintre celula donor şi cea
receptor are loc replicarea de transfer a plasmidului. O catenă parentală de ADN va rămâne în
celula donor, iar a doua va trece în celula receptoare, pe tiparul lor sintetizându-se catene
complementare.

Din punct de vedere medical importante sunt plasmidele conjugative de rezistenţă -

plasmidele R.
Dintre proprietăţile plasmidelor de rezistenţă ale bacililor-gram negativi, 3 sunt de interes
medical deosebit :
• frecvenţa transferării: frecvenţa transferului multor plasmide sălbatice pe receptori
adecvaţi este relativ scăzută 10-4/celula, şi se datorează faptului că plasmidele tulpinilor
sălbatice sunt reprimate, adică produc un represor care inhibă activitatea propriei gene de
transfer. Dacă se incubează donorii şi receptorii împreună mai multe ore, numărul de celule
recombinante cresc;

• spectrul de gazde: plasmidele transferabile R circulă între specii diferite. Acest transfer
are loc şi în laborator şi în macroorganism. S-a descris astfel transferul de plasmide de la
bacilul coli nepatogen la salmonele sau shigelle. Nu s-a observat însă transferul plasmidelor de
la bacterii gram-negative la cele gram-pozitive;

• determinanţii de rezistenţă “R”: caracteristici pentru plasmidele conjugative sunt

determinanţii de rezistenţă multipli. S-au evidenţiat astfel la tulpinile izolate din spital plasmide
ce au factori de rezistenţă faţă de toate chimioterapicele uzuale (ampicilina, cefalosporine,
streptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, kanamycina, gentamicina, sulfonamide).

Conjugarea la bacterii gram-pozitive

S-au descris procese de împerechere şi la bacteriile gram-pozitive ca, de pildă, la genurile
Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, procesul bazându-se pe performanţa celulei
receptoare.
 Celula receptoare produce un peptid cu mol. mică (GM=1000 daltoni) care determină
sinteza unor substanţe proteice de agregare de către celula donoare cu afinitate pentru unele
substanţe adezive de pe suprafaţa receptorului. Se produce astfel o legătură strînsă între
receptor şi donor cu formarea unei punţi intercelulare care permite transferul de material
genetic. Prin analogie cu substanţele atrăgătoare la insecte peptidul ce induce substanţa de
agregare a fost desemnat ca sexpheromon.

3.2.4. Transpoziţia
Transpoziţia presupune integrarea într-un genom al unui elemente genetic transpozabil din
aceeaşi moleculă de ADN sau din alta prezentă în aceeaşi celulă. Elementele genetice
transpozabile se împart, după structură şi mecanism de translocare, în 3 clase:
CLASA I cuprinde sevenţele de inserţie (IS) şi transpozonii compuşi.
Secvenţele de IS au în jur de 1000 de baze şi fac parte în mod normal din cromozom sau
plasmide. Ele sunt prezente în mai multe copii şi sunt flancate la cele 2 capete a aceleaşi baze,
10-40 pb-IR (inverted repeats), dar în ordine inversată. Acestea înrămează secvenţa ce codifică
proteine necesare procesului de transpoziţie. IS nu conferă ele însăşi un caracter nou celulei,
dar pot produce după inserţia lor modificări în expresia genelor adiacente inserării.

Transpozonii compuşi constau din 2 IS care nu au nevoie de secvenţa de ADN pentru

codificarea transpoziţiei şi delimitează determinanţi de rezistenţă sau a unor caractere ce pot
apare în fenotipul bacteriei. Un exemplu de transpozon de clasa I este Tn 9 şi Tn10, care
codifică rezistenţa la cloramfenicol şi, respectiv, la tetraciclină.

Transpoziţia elementelor din clasa I se face pe baza translocării conservative, secvenţa

transpozabilă mutându-se de pe repliconul donor pe cel receptor fără reduplicarea
tranposozonului.

CLASA II - cuprinde familia de transpozoni TnA care se translocă după modelul

transpoziţiei replicative, adică prin reduplicarea Tn înainte de translocare. Tn original rămâne
pe loc, iar copia se inseră în noul situs. La proces participă 2 enzime: transpozaza şi rezolvaza.
În timpul translocării replicative se formează un produs intermediar între repliconul donor şi
receptor care se numeşte cointegrat şi care va fi desfăcut de rezolvază. Pe lângă genele care
codifică enzimele necesare transpoziţiei, Tn de clasa II mai conţine o genă ce conferă celulei
un caracter. Tn3, de pildă, codifică rezistenţa la Ampicilină.

CLASA III cuprinde bacteriofagii transpozabili ca, de pildă, fagul Mu şi D 108, care
folosesc transpoziţia ca mod de replicare. Fagul Mu este un fag temperat care se inseră în
cromozomul celulei bacteriene după pătrundere. Inserţia acestui fag intrerupe activitatea genei
în care s-a inserat şi a unor gene neadiacente din acelaşi operon. Fagul se replică, originalul
ramâne pe loc, iar copia se inseră în orice alt loc de pe cromozom.

Inserţia oricărei gene între două elemente transpozabile face posibilă transferul ei
prin recombinare neomologă, în aceeaşi celulă pe o moleculă de ADN neînrudită
structural.

Astfel, prin transpoziţie se pot produce deleţii, inversii, transpuneri de determinanţi genetici
de pe un plasmid pe altul sau chiar fuzionarea stabilă a unor repliconi compleţi, de pildă a două
plasmide.

Evoluţia rezistenţei la antibiotice a bacteriilor nu poate fi concepută astăzi fără

fenomenul de transpoziţie.
 Studii moleculare au relevat posibilitatea ca genele de rezistenţă la antibiotice să fi apărut
cu mult timp înainte, la microorganismele producătoare de antibiotice. Aceşti determinanţi
genetici au fost mobilizaţi şi au pătruns prin mecanismele transferului genetic la bacteriile
importante din punct de vedere clinic.

Mecanismele transpoziţiei sunt responsabile de formarea plasmidelor cu multirezistenţă,

prin inserarea succesivă pe un plasmid a determinanţilor genetici de rezistenţă situaţi între
două elemente transpozabile de pe alte plasmide.

S9. Efectul factorilor fizici şi chimici asupra bacteriilor.

5. INFLUENTA FACTORILOR FIZICI ASUPRA

BACTERIILOR

5.1. Temperatura
Temperarura optima de dezvoltare a bacteriilor este cea a habitatului lor natural. În functie de aceasta
temperatura, bacteriile se împart în psihrofile, care se înmultesc optim la 20°C dar si sub aceasta temperatura,
mezofile, cu temperatura optima cuprinsa între 20-40°C si termofile, care se înmultesc optim la peste 45°C.
Bacteriile mezofile sunt cele patogene deoarece se înmultesc la temperatura organismului, fiind denumite si
bacterii “homeoterme”.
Limitele de temperatura în care aceste bacterii pot sa creasca sunt însa mai mari si variaza de la specie la
specie. Astfel, gonococul si meningococul nu suporta variatii mai mari de 1-2°C fata de temperatura optima, spre
deosebire de enterobacterii, care cresc în limite foarte largi.

Microorganismele sunt sensibile la temperaturile ridicate, aplicatia practica a acestui aspect fiind sterilizarea.
Temperaturile moderat scazute, ca, de pilda, cea de +4oC din frigidere, nu distrug bacteriile, dar opresc în
general înmultirea lor prelungindu-le viabilitatea. Din acest motiv, majoritatea produselor biologice sau patologice
destinate examenului bacteriologic se pastreaza în aceste conditii. Totusi, exista tulpini microbiene care se
înmultesc si la temperatura frigiderului ca, de exemplu, tulpinile criogene de Pseudomonas aeruginosa, ce se
înmultesc la 0oC si tulpini din familia Enterobacteriaceae (E.coli) care se în înmultesc la +5oC. Acest aspect trebuie
luat în calcul de catre medicul bacteriolog, mai ales acolo unde implicatia etiologica a unui germene într-o infectie
se bazeaza pe criteriul numeric.

Congelarea. Daca o suspensie bacteriana este supusa înghetului la temperaturi nu prea mici fata de 0oC,
cristalizarea apei determina formarea unor spatii ce contin solutii concentrate de saruri care nu cristalizeaza decât
la temperaturi mult mai joase (-20°C pentru NaCl de exemplu), când solutiile devin saturate ssi pot cristaliza.
Aceste concentratii ridicate de saruri minerale, la care se adauga cristalele de apa, vor leza structurile bacteriene.
Prin înghetare nu vor fi omorâte toate celulele unei suspensii, dar înghetul ssi dezghetul repetat scade foarte mult
numarul de bacterii viabile.

Conservarea prin congelare. Temperatura congelatoarelor casnice (-20°C) nu este destul de scazuta pentru a
permite conservarea bacteriilor. Temperatura optima este cea realizata de CO2 (-78°C) sau de azotul lichid (-
180°C). Conservarea bacteriilor, a virusurilor prin congelare este favorizata de adaosul de glicerol sau
dimethilsulfoxid. Acesti agenti chimici induc o solidificare amorfa, vitroasa care înlocuieste solidificarea prin
cristalizare.
Prin liofilizare (desicare brusca la -78oC), care este o metoda de conservare a microbilor, se extrage practic
întreaga apa libera din celulele bacteriene, ceea ce are ca urmare cresterea stabilitatii biopolimerilor si încetarea
metabolismului. Bacteriile liofilizate se pastreaza ani de zile.

5.2. pH-ul
 Bacteriile se pot dezvolta în limite largi de pH, cele patogene pentru om dezvoltându-se optim la un pH de
7,2-7,4. Exista si exceptii ca, de pilda, bacteriile din genul Brucella care cresc la un pH de 6,0 si vibrionul holeric la
pH de 9,0. Lactobacilii, prezenti în flora vaginala normala se dezvolta chiar si la un pH de 3,9.
Unele bacterii modifica prin procesele metabolice pH-ul mediului. Aceasta modificare poate opri înmultirea lor
sau chiar distruge cultura. Din acest motiv, multe medii au în compozitia lor solutii tampon care mentin pH-ul în
limite convenabile.
Modificarea de catre o bacterie a pH-lui unui mediu poate avea valoare deosebita în identificarea unui microb
si poate fi sesizata prin adaugarea în mediu a unui indicator de pH. Foarte multe bacterii se identifica biochimic prin
proprietatea lor de a fermenta diferite zaharuri. Aceasta capacitate se evidentiazaa tocmai prin însamântarea unei
bacterii pe mai multe medii ce contin fiecare alt zahar si un indicator de pH. În cazul fermentarii, acidifierea va
determina schimbarea culorii mediului.

5.3 Ultrasunetele
Ultrasunetele cu o frecventa peste 20.000 de cicli/s sunt bactericide. Bacteriile si virusurile sunt distruse de
ultrasunete într-un interval de o ora. Ultrasonarea microorganismelor se foloseste mai putin pentru sterilizare, cât
pentru a obtine diferite componente bacteriene sau virale, cum sunt: enzime, pereti celulari, acizi nucleici
bacterieni în scopul cercetarii acestora.

5.4. Presiunea hidrostaticaa

Bacteriile obisnuite sunt rezistente la presiunea atmosferica. Formele vegetative sufera alterari la 300 de atm si
sunt omorâte la 600 de atmosfere, presiune întâlnita în oceane la o adâncime de 6000m. Cultivarea bacteriilor la
presiuni mari induce cresterea lor filamentoasa scazându-le capacitatea de diviziune. Totusi unele bacteria gram-
pozitive pot rezista pana la 3000 de atmosfere cu conditia ca variatiile de presiune sa fie lente si da permita
adaptarea bacteriilor. Variatiile bruste de presiune duc la spargerea peretelui bacterian

5.5. Presiunea osmotica

Bacteriile se înmultesc optim pe medii izotonice, rezistenta lor la variatiile presiunii osmotice fiind incomparabil
mai mare decât cea a celulelor organismelor superioare. Aceastaa rezistenta se datoreazaa peretelui celular.
Bacteriile din genul Mollicutes, lipsite de actiunea protectoare a peretelui celular, sunt foarte sensibile la variatii
mici ale presiunii osmotice.
Într-un mediu puternic hiperton, bacteriile vor pierde apa din citoplasma si vor muri. Acest fenomen se
numeste de plasmolizaa.
Daca presiunea osmotica a mediului este foarte scazutaa, apa va patrunde în celula, care se va umfla
devenind turgescenta. Moartea bacteriei se produce prin plasmoptizaa.
Cresterea presiunii osmotice a unui mediu prin adaus de NaCl sau zaharuri sta la baza conservarii unor
alimente.

Exista însa bacterii osmofile, dintre care cele halofile sunt capabile sa se înmulteasca în solutii hipersaline
(bacteriile din genul Staphylococcus si Enterococcus). Pe baza acestei proprietati se prepara unele medii de
îmbogatire si selective asa cum este mediul hiperclorurat Chapmann pentru stafilococi. Acesta contine 7,5% NaCl
spre deosebire de mediile obisnuite care contin doar 0,5 %.

Dintre bacteriile osmofile mentionam si pe cele zaharofile, care sunt capabile sa se înmulteasca pe medii cu
continut mare de glucide (6g%). Acest aspect este important pentru unele medicamente, ca de pilda, siropurile
care, în ciuda continutului ridicat de zaharoza, se pot altera în urma contaminarii cu aceste bacterii.

5.6. Radiatiile
5.6.1. Razele neionizante
Razele ultraviolete. Puterea bactericida a razelor luminoase devine perceptibila la o lungime de unda de
330nm, crescând pe masura scaderii lungimii de unda a luminii UV. Timpul necesar distrugerii microorganismelor
depinde de intensitatea luminii, distanta de sursa de emisie si mediul în care se gasesc microorganismele.
Mecanismul bactericid al razelor UV consta în inducerea formarii în celula bacteriana a unor dimeri de timina care
interfereaza replicarea DNA. Alterarile altor elemente structurale bacteriene sunt neglijabile.

Fotoreactivarea. Modificarile induse în celulele bacteriene prin razele UV sunt reversibile, eficienta sterilizarii
prin aceste raze nefiind prea performanta. Astfel, daca se expune o cultura bacteriana care a fost iradiata cu raze
UV la lumina vizibila, o parte din dimerii de timina se vor disocia si bacteriile aparent omorâte îsi reiau activitatea
metabolica si înmultirea. Aceasta poate depasi de sute de ori activitatea initiala a culturii neiradiate.
În scop practic lampile cu vapori de mercur se folosesc pentru a reduce numarul de bacterii existente în aer în
salile de operatie, în laboratoare, în încaperi în care sunt adapostite animale de exprientaa etc.

Efectul bactericid al razelor solare se datoreaza continutului în raze UV (300-400nm). În conditii naturale
efectul bactericid al luminii solare este mai mare în tarile sudice unde continutul în raze UV este mare. Semple si
Greig au aratat în India (1909) ca bacilii tifici expusi pe lenjerie albaa la soare sunt distrusi în doua ore, pe când la
întuneric îsi pastreaza viabiliatea peste 6 zile.
S-a observat însa ca expunerea la lumina puternica solara poate omorâ bacteriile chiar când radiatiile UV sunt
ecranate, datorita sensibilitatii la lumina a unor substante necesare metabolismului bacterian cum sunt riboflavina si
porfiriniele. Astfel, expunerea la lumina solara a fiolelor în care se afla BCG1  va avea ca urmare pierderea
viabilitatii si deci a eficientei vaccinului.

Sensibilizarea fotodinamica. Razele luminoase vizibile au o actiune bactericida slaba, care poate însa fi
crescuta pâna la nivelul actiunii razelor UV daca sunt trecute prin coloranti fluorescenti ca, de pilda, eozina, rosu
bengal etc.

5.6.2. Radiatiile ionizante

Mecanismul bactericid al acestor raze consta în formarea în celula a unor radicali cu viatata scurta ssi protoni.
Acesti produsi vor altera bazele azotate si legaturile dintre ele. Efectul bactericid al razelor ionizante depinde de
cantitatea de energie absorbita, temperatura, presiuea partiala a oxigenului, continutul în substante organice,
prezenta unor substante protectoare ca alcoolii alifatici sau substante bogate în grupari sulfhidrilice, specia
microorganismului si continutul în apa. Sporii sunt în general mai rezistenti decât formele vegetative ale bacteriilor,
exceptie fiind o bacterie nesporulata, Micrococcus radiodurans, care este cel mai rezistent microorganism la
radiatii. El rezista la doze de 200 de ori mai mari decât restul bacteriilor datorita faptului ca este echipat cu
mecanisme deosebit de eficiente de reparare a alterarilor acizilor nucleici.

4. 2. 1. Efectele antimicrobiene ale

factorilor fizici
Cuprins:

4. 2. 1. 1. Influenţa temperaturii ridicate

4. 2. 1. 2. Influenţa temperaturii scazute
4. 2. 1. 3. Filtrarea
4. 2. 1. 4. Radiaţiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc)
4. 2. 1. 5. Ultrasunetele
4. 2. 1. 6. Presiunea osmotică

4. 2. 1. 1. Influenţa temperaturii ridicate asupra microorganismelor

În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:
·         mezofile (temperatură optimă 30-37ºC),
·         psichrofile (temperatură optimă în jur de 20ºC) şi
·         termofile (temperatură optimă 50-60ºC).
Prin acţiunea căldurii procesele chimice şi fizice sunt mult accelerate; distrugerea se produce după
atingerea temperaturii de 50-60ºC prin ruperea legăturilor intramoleculare, mai ales a punţilor de
hidrogen care menţin proteinele şi alte macromolecule în stare nativă. Ca urmare protoplasma se
denaturează. Celulele bogate în apă sunt mult mai sensibile la acţiunea căldurii decât microorganismele
care conţin puţină apă sau sunt liofilizate. Apa din compoziţia microorganismelor absoarbe căldura
proporţional cu volumul său. Sterilizarea prin căldura are loc în două variante principale: prin căldură
uscată și umedă.
 
Sterilizarea prin căldură:
a). Sterilizarea prin căldură uscată are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor
bacteriene. Amintim câteva dintre variantele tehnice:
a1. Sterilizarea prin încălzire la incandescenţă („la roşu”) reprezintă introducerea şi menţinerea
în flacăra becului Bunsen până la înroşire, pe toată lungimea, a obiectului care urmează a fi sterilizat. Se
poate aplica pentru ansa bacteriologică (cu buclă sau fir) sau pentru spatulă (Figura nr. 5, Film nr. 2).
 
Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de câteva ori) a unui obiect, fără a se atinge
temperatura de incandescenţă. Flambarea se aplică pentru portansă, gâtul unui recipient de sticlă (tub,
eprubetă, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur şi nu reprezintă sterilizare.
a2. Sterilizarea cu aer cald se realizează în etuvă (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr. 6). Etuva
este o cutie metalică cu pereţi dubli. Cu ajutorul unor rezistenţe electrice şi a unui termostat se obţine şi
menţine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii în interiorul aparatului este realizată
cu ajutorul unui sistem de ventilaţie (Schema nr. 1).
Pentru majoritatea materialelor care urmează a fi sterilizate, temperatura din etuvă trebuie să
atingă 180ºC, pentru o durată de 1 oră sau 160°C pentru o durată de 2 ore. Pot exista și alte variante,
de exemplu în funcție de dimensiunea obiectelor de sterilizat.
Sterilizarea cu aer cald este indicată pentru obiecte de sticlă, obiecte de porţelan, pulberi inerte şi
termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menţionat
faptul că repetarea sterilizării, în timp, conduce la decălirea oţelului) etc.
Nu se vor steriliza în etuvă soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vată, bumbac,
fibră sintetică, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.
a3. Incinerarea reprezintă arderea până la obţinerea de cenuşă (Figura nr. 7). Există anumite
reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. În cazul spitalelor, în
România au existat astfel de incineratoare în structura unităţii sanitare respective. Odată cu procesul de
aderare la Uniunea Europeană şi respectiv necesitatea aplicării unor reguli impuse pentru toate ţările
membre, majoritatea incineratoarelor de spital au fost închise. Modul în care s-a realizat în perioada
2003-2004 negocierea privind stoparea activităţii acestor incineratoare nu a ţinut cont de situaţia reală
din ţara noastră. În lipsa unui incinerator propriu, unitatea sanitară trebuie să încheie un contract de
prestări servicii cu o firmă de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi
supuse incinerării materiale de unică folosinţă din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele
animalelor de experienţă etc.
b). Sterilizarea prin căldură umedă este cea mai eficientă metodă de sterilizare şi are ca mecanism
coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite substanţe în soluţie,
sticlărie (cu excepţia pipetelor şi lamelor), instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac),
medii de cultură, aparate de filtrat etc.
b1. Autoclavarea este esenţială atât pentru laboratoarele de microbiologie cât şi pentru unităţile
sanitare în general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de apă realizează
·       la 0,5 atmosfere o temperatură de 115ºC,
·       la 1 atmosferă o temperatură de 121ºC şi respectiv
·       134ºC la 2 atmosfere.
 Autoclavul are ca piesă principală un cazan cu pereţi metalici, care se închide etanş cu un capac
prevăzut cu un sistem special de închidere şi în interiorul căruia, vaporii de apă sunt comprimaţi la
presiunea necesară în vederea sterilizării (Schema nr. 2).
Există mai multe tipuri de autoclave:
- autoclave cu perete simplu
·         verticale
·         orizontale
- autoclave cu manta de aburi
·         verticale
·         orizontale.
În continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la
care vaporii provin din apa aflată în cazanul de presiune şi ajung în camera de sterilizare de jos în sus
(Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este înregistrată de un manometru. Pentru punerea în
funcţiune a autoclavului, în dotare există 2 robinete: unul superior (robinetul de aer şi vapori, care
permite legătura între cazan şi mediul exterior) şi unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei
din cazan). Pentru a evita accidentele există o supapă de siguranţă care se deschide şi permite
evacuarea vaporilor atunci când, accidental, presiunea vaporilor depăşeşte limita de siguranţă. În
momentul de faţă pentru evitarea riscului de a veni în contact cu vapori de apă fierbinţi aflaţi sub
presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului până când
presiunea din interior nu o egalizează pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus într-un perete
exterior solid care la partea inferioară are un spaţiu în care se află sursa de căldură.
În partea inferioară a cazanului de presiune se află un suport pe care se aşează o placă de metal
perforată (Figura nr. 9). Pe suport se aşează materialele care trebuie sterilizate iar faptul că placa este
perforată permite trecerea vaporilor de apă produşi după încălzirea apei. În vederea sterilizării se
procedează astfel:
·                      verificăm nivelul apei din partea inferioară a cazanului, care trebuie să fie până la o
distanţă de 2-3 centimetri de suport; dacă nivelul a scăzut, se completează (recomandabil se va utiliza
apă distilată);
·                      aşezăm pe suport obiectele şi materialele de sterilizat, ambalate corespunzător;
·                      închidem etanş capacul, folosind sistemul special de etanşeizare cu care este dotat
autoclavul pe care îl avem la dispoziţie;
·                      conectăm sursa de căldură;
·                      deschidem robinetul pentru evacuarea aerului şi vaporilor (dacă rămâne aer în
cazanul cu presiune eficienţa sterilizării va scădea considerabil; vaporii de apă fiind mai uşori, vor încălzi
în special partea superioară a cazanului în timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai
greu, va rămâne în partea inferioară a cazanului) ;
·                      închidem robinetul după evacuarea aerului şi apariţia unui jet continuu de vapori;
·                      presiunea din cazan începe să crească şi este urmărită cu ajutorul manometrului;
atunci când presiunea atinge valoarea dorită (de ex. 1 atmosferă), reglăm sursa de căldură în aşa fel
încât această presiune să fie menţinută pentru toată durata sterilizării (de ex. 30 minute) ;
·                      după trecerea celor 30 minute întrerupem sursa de căldură şi lăsăm autoclavul să
se răcească până când presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice;
·                      deschidem lent robinetul de vapori;
·                      deschidem sistemul de etanşeizare şi capacul autoclavului;
·                      lăsăm obiectele şi materialele să se răcească în autoclavul deschis;
·                      atunci când temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele
sterilizate.
 b2. Tindalizarea (sterilizarea fracţionată) este o metodă de sterilizare prin căldură umedă care
evită depăşirea unei temperaturi de 100ºC. Substanţele de sterilizat se menţin la 56-100ºC timp de 30-
60 minute, 3 până la 8 zile succesiv. Astfel, utilizând medii care permit germinarea, după prima încălzire
timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar după răcire are loc germinarea sporilor. În
ziua următoare sunt distruse prin încălzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar după
răcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat în prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi
utilizate autoclave la care se va menţine permanent deschis robinetul de vapori (şi astfel nu se va depăşi
în interior temperatura de 100ºC), băi de apă sau băi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente,
unele medii de cultură etc.
b3-4. Pasteurizarea şi fierberea nu reprezintă metode de sterilizare, dar sunt utilizate în anumite
situaţii.
Pasteurizarea foloseşte căldura umedă şi are aplicaţii în conservarea pentru scurtă durată a unor
alimente (lapte, bere etc). Există o pasteurizare joasă (30 minute la 56-65ºC), o pasteurizare medie (15
minute la 65-75ºC) şi o pasteurizare înaltă (2-5 minute la 85-90ºC). Prin pasteurizare sunt distruse
bacteriile în formă vegetativă dar nu şi sporii.
Fierberea poate fi utilizată atunci când nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare, iar
mecanismul de acţiune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30 minute la 100oC, distruge
bacteriile în formă vegetativă, fungii şi virusurile, dar nu şi sporii bacterieni. Timpul se înregistrează
după ce apa a început să fiarbă. Eficienţa acestei metode poate fi crescută prin adăugarea de carbonat
de sodiu 1-2%.
^inapoi sus
4. 2. 1. 2. Influenţa temperaturii scăzute asupra microorganismelor
Temperaturile joase (în jur de 0-4ºC) au în general un efect bacteriostatic. La temperaturi
scăzute, reacţiile biochimice încetinesc, multiplicarea poate fi stopată. Majoritatea produselor
biologice/patologice pot fi transportate (menţinând viabilitatea germenilor şi încetinind în acelaşi timp
multiplicarea acestora) la o temperatură de circa 4ºC. O serie de culturi pot fi de asemenea menţinute la
temperatura frigiderului pentru o durată limitată de timp în vederea prezervării şi posibilităţii de a repeta
anumite teste de identificare etc.

În funcţie de viteza cu care are loc răcirea, întâlnim situaţii diferite, cu următoarele posibile efecte
asupra structurilor celulare bacteriene.
a). Congelarea lentă, la temperaturi mai mici -21,3ºC are efecte bactericide prin formarea de
cristale de gheaţă şi prin hiperconcentrarea salină cu denaturarea proteinelor;
b). Congelarea bruscă la -70ºC are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea în masă a
apei fără apariţia cristalelor de gheaţă;
c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezintă congelarea bruscă concomitent cu desicaţia (deshidratarea
în vid). O suspensie microbiană în mediu protector, liofilizată, poate fi păstrată în fiole închise timp
îndelungat (de exemplu vaccinul BCG).

4. 2. 1. 3. Filtrarea
Microorganismele pot fi reţinute mecanic şi electrostatic în porii unui filtru. Trecerea unui lichid
printr-o substanţă prevăzută cu pori care va reţine microorganismele din lichidul respectiv poartă
numele de sterilizare prin filtrare.
De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan, sticlă poroasă, azbest
impregnat cu caolin, pământ de infuzori) (Figura nr. 10). Actualmente se folosesc din ce în ce mai
frecvent membrane filtrante din acetat de celuloză cu porozităţi între 8 şi 0,025 mm (Figura nr. 11).
 În vederea filtrării sunt necesare o serie de piese precum: un recipient în care se introduce lichidul
care urmează a fi filtrat, un recipient în care se va colecta lichidul sterilizat, o pâlnie care se montează
etanş între cele 2 recipiente, o pompă de vid care va aspira lichidul din primul în al doilea recipient, prin
membrana filtrantă. Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare înainte de începerea filtrării.

Există şi alte variante tehnice. Cu o importanţă practică particulară ar fi de menţionat filtrele pentru
sterilizarea aerului din cabinetele de siguranţă biologică (clasa II şi clasa III), filtrele HEPA (High
Efficiency Particulate Air Filters) (Figura nr. 12).
Sterilizarea prin filtrare este utilizată pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultură (care
nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse în cazul
sterilizării prin căldură etc.
^inapoi sus
 4. 2. 1. 4. Radiaţiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide prin ruperea
legăturilor de hidrogen, oxidarea legăturilor duble etc. Radiaţiile UV sunt utile în sterilizarea suprafeţelor
de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultură, alte manevre aseptice etc) în cazul în care nu există
cabinete de siguranţă biologică cu flux laminar dar şi atunci când avem la dispoziţie astfel de cabinete
de siguranţă biologică şi dorim să sterilizăm incinta în care am prelucrat spre ex. produse în care
există Mycobacterium tuberculosis.

Lămpile cu UV sunt numite lămpi germicide. Astfel de lămpi sunt plasate de ex. şi în instituţiile
sanitare în care sunt internaţi pacienţi cu tuberculoză (Figura nr. 13). Radiaţiile ionizante se pot utiliza în
sterilizări industriale (pentru alimente, medicamente, seringi de unică întrebuinţare etc).

4. 2. 1. 5. Ultrasunetele au efecte bactericide prin acţiune mecanică, mişcare activă a

conţinutului celular, formare în mediul extern de bule mici de gaze dizolvate care se mişcă energic şi se
izbesc de membrană (fenomenul de cavitaţie) şi creşterea temperaturii la 50-80ºC. Sporii rezistă acestor
efecte.

4. 2. 1. 6. Presiunea osmotică
Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) în medii hipertone are efecte letale asupra unor bacterii.
În medii hipotone are loc acumularea de apă în celula bacteriană; aceasta devine turgescentă şi peretele
bacterian cedează.

4. 2. 2. Efectele antimicrobiene ale

factorilor chimici
Există o serie de substanţe chimice necesare creşterii şi multiplicării bacteriene. Alte substanţe
chimice (antibioticele şi chimioterapicele) au efect bactericid sau bacteriostatic selectiv.
Antisepticele şi dezinfectantele sunt substanţe cu acţiune antimicrobiană neselectivă,
alterândstructuri şi funcţii comune microorganismelor şi organismelor superioare.
Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente şi mucoase.

Dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafeţe şi structuri care nu sunt vii.

O parte dintre dezinfectante au efect sterilizant. Aşa cum am menţionat anterior, trebuie să existe o
etapă de pregătire a materialelor în vederea sterilizării. Materialele de laborator, instrumentarul,
materialele chirurgicale etc, trebuie curăţate perfect, de ex. prin spălare cu ajutorul unor detergenţi.
Dacă aceste materiale au fost contaminate cu sânge, înainte de spălare se vor dezinfecta.

Substanţele antiseptice şi dezinfectante se pot clasifica în funcţie de mecanismul de acţiune, după

cum urmează:
a). Substanţe care denaturează proteinele (au în general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii şi
derivaţii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70º, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor).

b). Substanţe care oxidează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH):
hipermanganatul de potasiu, KMnO71‰, util în antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, H2O2,
soluţie 3% în apă, utilizat în antiseptizarea plăgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) şi derivaţii lor (hipocloriţi,
cloramine, soluţii iodurate etc. Există și diferite clase de compuşi halogenaţi cu potență mai mare, cum
ar fi cei care au în componenţa lor radicalul benzil -C6H5. Indiferent de substanța folosită este necesară
realizarea concentraţiei corespunzătoare.

c). Substanţe care blochează grupările chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale
grele [sărurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu merthiolatul de sodiu,
C9H9HgO2SNa ), sărurile de argint, compuşi de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte
bactericide], grupările alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O)
etc.
d). Substanţe care lezează membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizări limitate datorită
proprietăţilor caustice şi toxicităţii sale; este etalonul faţă de care se măsoară activitatea antimicrobiană
a antisepticelor şi dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte
toxice mai reduse) etc], detergenţii [anionici (săpunuri, perlan etc), cationici (săruri cuaternare de
amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu
propilenglicolul)].

e). Substanţe care alterează acizii nucleici: coloranţii bazici (violet de genţiană, albastru de metilen,
fucsină bazică etc), derivaţii de acridină, de exemplu rivanolul.
Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70º, diferiţi derivaţi halogenaţi,
hipermanganatul de potasiu 1‰, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substanţe
antiseptice.

Dorim să menţionăm şi să subliniem că atât în cazul antisepticelor cât şi în cazul dezinfectantelor

este important ca substanţa utilizată să aibă concentraţia corespunzătoare, să fie aplicată pentru
o durată de timp corespunzătoare, să se afle în termenul de garanţie. Aceeaşi substanţă chimică
(de ex. cloramina) poate intra în categoria antisepticelor sau în categoria dezinfectantelor, în funcţie de
concentraţie (concentraţia este mai mare în al doilea caz).

În continuare vom prezenta pe scurt câteva exemple de substanţe dezinfectante. Dorim să

menţionăm faptul că, până în prezent, nu există nici un dezinfectant ideal. Există numeroase substanţe
şi numeroşi producători de antiseptice şi dezinfectante.

Hipocloriţii:
 soluţiile de hipoclorit se prepară periodic (se inactivează după mai mult de 24 ore),
  concentraţia în clor activ este diferită în funcţie de scopul urmărit (ex. 2.500 ppm clor activ
pentru dezinfectarea pipetelor contaminate);
 au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, sporilor bacterieni, fungilor (100
ppm în o oră), virusurilor (200 ppm în 10 minute);
 efectul este diminuat considerabil în prezenţa substanţelor organice (în special proteine),
maselor plastice, detergenţilor.

Derivaţii fenolici:
 din cauza toxicităţii, potenţialului carcinogenetic şi corozivităţii, fenolii nu se folosesc ca atare, ci
sub forma derivaţilor fenolici;
 soluţiile fenolice se prepară periodic (după cel mult 24 ore);
 concentraţia poate fi diferită în funcţie de scopul urmărit (de obicei este de 2-5%);
 au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, fungilor, unor virusuri (ex. HIV este
inactivat de soluţia 0,5%);
 efectul este diminuat pe suprafeţele de cauciuc, lemn sau material plastic.

Glutaraldehida:
 cel mai frecvent este utilizată concentraţia de 2%, la un pH alcalin;
 are efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă (în cazul mycobacteriilor este
necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor;
 datorită faptului că nu corodează metalele (aşa cum se întâmplă în cazul substanţelor prezentate
mai sus) se poate folosi şi la dezinfectarea suprafeţelor metalice;
 nu poate fi folosită pentru suprafeţe, datorită vaporilor iritanţi şi timpului mare de expunere;
ideală pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai mare de
timp în containere menţinute închise.

Iodoforii:
 sunt substanţe care complexează iodul pe care îl eliberează în soluţii apoase;
 au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni, fungilor, unor
virusuri (ex. virusuri cu înveliş lipidic);
 sunt inactivaţi de substanţe organice (în special proteice), mase plastice, detergenţi;
 pot fi utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor, dezinfecţia pipetelor contaminate.

Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O):

 exercită activităţi bactericide prin alkilarea acizilor nucleici şi prin înlocuirea hidrogenului labil
printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH);
 sporii de Bacillus subtilis nu sunt distruşi;
 acest tip de sterilizare se utilizează pentru materiale care nu rezistă atunci când sunt supuse
acţiunii temperaturii sau radiaţiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc.);
·         fiind o substanţă explozivă, etilenoxidul este utilizat în camere speciale în care se menţine o
presiune negativă, iar pentru a preveni o explozie dioxidul de carbon poate fi combinat cu această
substanţă în încăperi de oţel speciale; o altă variantă de protecție ar fi combinarea cu hidrocarburi
fluorinate.
  indiferent de varianta folosită trebuie respectate toate recomandările producătorului;
există o serie de inconveniente în ceea ce priveşte acest tip de sterilizare (pot să apară efecte
carcinogenetice și afectarea sistemului nervos etc., dar e posibilă afectarea întregului organism);
 sterilizarea este în principiu influenţată de: concentraţia etilenoxidului, temperatură, umiditatea
relativă şi timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraţiei va reduce la jumătate timpul necesar
pentru sterilizare).

S 10. Sterilizarea şi dezinfecţia – definire; factorii care influenţează distrugerea microorganismelor.

-doc Rafila

Dezinfectantele sunt substante puternic bactericide la concentratii relativ scazute, folosite la decontaminarea
obiectelor si încaperilor. Dupa folosirea de catre Lister a fenolului pentru dezinfectia salilor de operatii, s-a
convenit ca acest compus sa fie socotit dezinfectantul standard, cu toate ca actioneaza în concentratii mai mari
decât majoritatea dezinfectantelor folosite astazi.

Sterilizarea - distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor patogene sau

nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafata sau dintr-un mediu(lichid sau
solid).prin sterilizare se realizeaza asepsia.

Dezinfectia - distrugerea formelor vegetative microbiene(uneori si a sporilor) din

anumite medii (lichide,solide) sau de pe suprafete.Se realizeaza cu ajutorul unor agenti
fizici sau cu ajutorul substantelor dezinfectante.(realizeaza antisepsia)

Dezinfectante - substante toxice sau iritante pentru tesuturile vii ,puternic

germicide, care se utilizeaza pentru decontaminarea obiectelor si suprafetelor(in functie
de concentratie unele dezinfectante pot fi folosite si ca antiseptice)

Exemple:alcoolii,halogenii(clor iod),fenolii,compusi cuaternari de

amoniu,aldehide(glutaraldehida,formaldehida),peroxizii(apa oxigenata,acid peracetic)

-curs Baicus

Sterilizarea - distrugerea tuturor microorganismelor patogene

sau nepatogene forme vegetative / sporulate - suprafeţe /mediu lichid /
solid - utilizarea metodelor fizice şi chimice

Dezinfecţia
-distrugerea formelor vegetative microbiene
- inhibiţia creşterii acestora pe suprafeţe inerte

Eficienţa utilizării dezinfectanţilor influenţată :

•natura obiectului
•cantitatea de material organic prezent care poate
inactiva dezinfectantul
•numărul de microorganisme contaminante
•tipul şi concentraţia dezinfectantului
•durata şi temperatura expunerii la acesta

-definitii Buiuc

Sterilizarea este distrugerea sau indepartarea tuturor microorganismelor, inclusiv a sporilor.

Dezinfectia este distrugerea tuturor formelor vegetative ale microorganismelor, dar nu in mod necesar
si a sporilor.

- Curs Rafila

- Prin termenul de sterilizare, care este un termen absolut, se înteleg procedeele fizice ssi chimice
care elimina toti germenii viabili (bacterii, spori, fungi, virusuri, paraziti) de pe un obiect. Se
desemneaza ca steril un obiect care a fost supus unui procedeu de sterilizare ssi protejat în mod
corespunzator pentru a preveni contaminarea sa.
- Se folosesc, în principiu, 4 metode de sterilizare:
- •sterilizarea prin caldura;
- •filtrarea prin filtre bacteriologice care retin bacteriile din lichidele ce nu pot fi supuse
temperaturilor ridicate;
- •iradierea cu raze UV sau raze ionizante;
- •sterilizarea chimica, metoda evitata în general deoarece doar câtiva dezinfectanti, foarte toxici si
iritanti (ca de exemplu, formaldehida, oxidul de etilen etc.) folositi în conditii riguros controlate,
sunt capabili sa omoare toate formele de viata inclusiv sporii, fara a deteriora obiectele de
sterilizat.
- Trebuie specificat, însa, ca sterilizarea nu este identica cu distrugerea fizica a bacteriei, cu toate ca
cele doua notiuni se folosesc des una în locul celeilalte. Acest aspect este foarte important,
deoarece solutiile perfuzabile, care sunt sterile dar contin bacterii omorâte, a caror produsi de
degradare au efecte pirogene, dau reactii toxice a caror gravitate merge pâna la socul endotoxinic.
Deci, apa si lichidele care vor servi la prepararea solutiilor injectabile sau perfuzabile trebuie sa
fie nu numai sterile, dar sa aiba un grad pronuntat de puritate.
- Dezinfectia se refera în general la distrugerea tintita a potentialului infectios în scopul de a
împiedica raspândirea microbilor dintr-un anumit focar de infectie, rezultatul nefiind întotdeauna
omorârea tuturor formelor microbiene, mai ales a endosporilor. Dezinfectantele sunt substante
puternic bactericide, cel mai des toxice pentru organismul uman. Dezinfectia se aplica acolo unde
sterilizarea nu se poate efectua: mobilier, asternuturi de pat, bazine de înot, încaperi etc.
- Metodele de dezinfectie sunt:
- • dezinfectia prin caldura umeda si consta in fierbere si pasteurizare
- • dezinfectia chimica.

S 11. Metode de sterilizare, tipuri, aplicaţii, metode de control al eficienţei.

2. STERILIZAREA PRIN CALDURA

Microorganismele sunt distruse la temperaturi ridicate într-un timp care depinde de mai multi
factori:
• temperatura, care este invers proprotionala cu timpul necesar expunerii bacteriilor,
• numarul microorganismelor si al sporilor, elemente ce afecteaza rapiditatea sterilizarii,
• specia si proprietatea de a sporula a microorganismelor. Sensiblitatea si supravietuirea la caldura
variaza la diferitele tulpini din cadrul aceleiasi specii,
• materialul în care este cuprins microorgansimul. Un continut ridicat de substante proteice, zaharuri,
lipide, amidon, acizii nucleici sau uleiuri protejeaza sporii si formele vegetative de actiunea
caldurii. Prezenta dezinfectantilor are efect sinergic cu cel al temperaturii ridicate,
• pH-ul. Rezistenta maxima a sporilor la caldura se situeaza la un pH de 7 si scade o data cu
cresterea aciditatii sau alcalinitatii,
• conditiile în care are loc sporularea. Se pare ca sporii formati în habitatul natural al microbilor sunt
mai rezistenti la caldura decât cei obtinuti pe mediile de cultura.
Sensibilitatea microorganismelor la caldura se poate exprima prin:
• punctul termic letal, care se defineste ca cea mai joasa temperatura care distruge bacteriile dintr-o
cultura cu densitate data în 10 minute. Pentru E.coli valoarea se situeaza la 55°C, pentru bacilul
tuberculos la 60°C, iar pentru majoritatea sporilor la 120°C;
• timpul termic letal, care se defineste ca timpul minim în care are loc distrugerea bacteriilor la o
temperatura data.
Data fiind sensibilitatea diferita a tulpinilor din cadrul unei specii se prefera ca index pentru timpul
în care sunt distruse bacteriile timpul zecimal de reducere, sau valoarea D10, care este timpul minim
exprimat în minute care reduce viabilitatea culturii bacteriene cu 90% la o temperatura data în conditii
standard.

2.1. Sterilizarea prin caldura uscata

Caldura uscata omoara microorganismele prin oxidarea distructiva a componentelor celulare. Cei
mai rezistenti spori sunt distrusi de caldura uscata la 160o, timp de 60 de minute. Caldura uscata de 100o
C distruge în 60 de minute bacteriile care sunt omorâte prin calduraa umeda la 60 oC în 30 de minute.
Sporii fungilor sunt distrusi în 60 de minute la 115 oC, iar cei bacterieni la temperaturi cuprinse între 120-
160oC. În laboratorul de microbiologie se utilizeaza urmatoarele tehnici de sterilizare:
• încalzirea la rosu în flacara a obiectelor se aplica anselor bacteriologice în laboratorul de
microbiologie;
• flambarea (trecerea prin flacara pentru câteva secunde) se aplica gâtului baloanelor, eprubetelor
dupa deschiderea si înainte de închiderea lor, pipetelor înainte de utilizare pentru a preveni
contaminarea cu germenii din aer. Se mai sterilizeaza prin flambare instrumente de mica chirurgie,
dupa ce se stropesc cu alcool, dar temperatura produsa nu este suficient de înalta pentru a asigura o
sterilizare optima;
• sterilizarea la pupinel. Pupinelul sau cuptorul cu aer cald este o cutie metalica cu pereti dubli între
care se gaseste un strat de azbest care împiedica pierderile de caldura, o sursa de caldura care este
energia electrica si un termoregulator. În interior pupinelul este prevazut cu rafturi pentru obiectele
de sterlizat. Temperatura de sterilizarea la pupinel este de 180-200 oC timp de o ora. La
pupinel se sterilizeaza întreaga sticlarie de laborator, instrumentarul de stomatologie, seringi fara
armatura metalica, pudre, uleiuri etc. Pupinelul nu trebuie sa fie supraîncarcat, pentru ca aerul sa
poata circula nestingherit printre obiectele de sterilizat
• incinerarea deseurilor infectioase
 2.2. Sterilizarea prin caldura umeda
Caldura umeda este mai eficienta decât caldura uscata, distrugând bacteriile la o temperatura mai
scazuta si timp mai scurt. Formele vegetative a majoritatii bacteriilor, fungilor si virusurilor animale sunt
omorâte de caldura umeda în 10 minute la temperaturi cuprinse între 50 oC (Neisseria gonorrhoeae) si
65oC (Staphylococcus aureus). O susceptibilitate deosebita fata de caldura o prezinta Treponema
pallidum, care este distrusa în 10 minute la 43oC. Rezistenta maxima la caldura umeda o are, însa,
Bacillus stearothermophylus, a carui forma vegetativa se poate multiplica la 80 oC. O parte din virusurile
animale au o rezistenta crescuta fata de caldura umeda, ca, de pilda, virusul poliomielitic care este
inactivat la 60oC dupa 30 de minute, si virusul hepatitei B care daca se afla în ser rezista 10 ore la 60 o.
Multi bacteriofagi au o rezistenta mai mare la caldura umeda decât bacteria gazda, aceasta fiind distrusa
la 60oC în 15-30 minute iar bacteriofagul la temperaturi cuprinse între 65-80oC.
Formele sporulate ale actinomicetelor, ciupercilor si a fungilor sunt mai rezistente decât formele
vegetative, dar nu atât de rezistente ca si sporii bacterieni.
Rezistenta sporilor bacterieni variaza la diferitele specii, dar chiar si între tulpinile aceleiasi specii.
Astfel, majoritatea sporilor de Cl.tetani sunt distrusi prin fierbere la 100oC în 10 minute, dar s-au
semnalat tulpini a caror spori rezista la fierbere 1-3 ore, fiind cei mai rezistenti patogeni ce pot infecta o
plaga. Rezistenta lor determina standardele minime pentru sterilizarea chirurgicala: 10 minute la 121 oC
sau 30 de minute la 115oC fara a socoti timpul de încalzire. Unii spori de Cl.botulinum rezista la fierbere
la un pH=7 pâna la 8 ore iar la autoclavare 10-40 de minute la 115oC.
Omorârea microorganismelor prin caldura umeda se produce prin coagularea proteinelor
structurale si inactivarea enzimelor, cu participarea apei. Cei mai rezistenti spori sunt distrusi
prin expunere la caldura umeda la 121o timp de 30 de minute.
• fierberea este de fapt o metoda de dezinfectie deoarece ea nu distruge toate formele sporulate. Se
efectueaza la 100oC timp de 1/2 de ora si se aplica siringilor si instrumentelor de mica chirurgie
atunci când nu este posibila alta metoda. Fierberea se mai foloseste în epidemii la sterilizarea apei.
• pasteurizarea a fost introdusa de Pasteur pentru conservarea vinului, fiind utilizata si acum pentru
sterilizarea unor alimente lichide care nu suporta temperaturi prea ridicate (lapte, bere, sucuri de
fructe). Metoda consta în încalzirea lichidului la 62°C pentru 30 de minute (pasterurizare joasa),
71oC 15 minute (pasteurizare medie), 80-85o 3-5 minute (pasteurizare înalta) sau introducerea
unor vapori filanti la o temperatura de 130 -150oC sub presiune pentru câteva secunde
(ultrapasteurizare). Pasteurizarea este o metoda eficienta deoarece bacteriile patogene care se pot
dezvolta în lapte (Mycobacterium tuberculosis, Salmonella, Streptococcus si Brucella) nu sunt
bacterii sporulate, numarul lor reducându-se dupa pasteurizare cu 97-99%. Coxiella burnetii nu
este distrusa prin pasteurizare joasa.
• tyndalizarea consta în încalzirea produsului de sterilizat 3 zile la rând, în baie de apa la 56-100 oC
câte o ora. Temperatura se alege în functie de produsul de sterilizat. Metoda se aplica lichidelor
care nu suporta temperaturile ridicate, ca de exemplu: vaccinuri, medii de cultura ce contin
zaharuri în concentratie mare, proteine, gelatina etc. Formele vegetative sunt distruse în prima zi,
iar sporii se transforma în forme vegetative ce vor fi distruse zilele urmatoare.
• autoclavarea este metoda folosita pentru instrumentarul de chirurgie iar în laboratoarele de
microbiologie pentru sterilizarea mediilor de cultura si a materialului infectios. Sterilizarea are
loc într-o atmosfera saturata de vapori de apa la 121oC, la o presiune de 1 atm, timp de 20-30
de minute, în aparate speciale numite autoclave sau la 134 oC, la o presiune de 2 atm. 10-15
minute.

3. STERILIZAREA PRIN RADIATII

 3.1. Razele neionizante
Razele ultraviolete. Puterea bactericida a razelor luminoase devine perceptibila la o lungime de unda
de 330nm, crescând pe masura scaderii lungimii de unda a luminii UV. Timpul necesar distrugerii
microorganismelor depinde de intensitatea luminii, distanta de sursa de emisie si mediul în care se gasesc
microorganismele. Mecanismul bactericid al razelor UV consta în inducerea formarii în celula bacteriana
a unor dimeri de timina care interfereaza replicarea DNA, alterarile altor elemente structurale bacteriene
fiind neglijabile.
Fotoreactivarea. Modificarile induse în celulele bacteriene prin razele UV sunt reversibile, eficienta
sterilizarii nefiind deosebit de performanta. Astfel, daca se expune o cultura bacteriana care a fost iradiata
cu raze UV la lumina vizibila, o parte din dimerii de timina se vor disocia, bacteriile aparent omorâte
reluându-si activitatea metabolica si înmultirea, care vor depasi de multe ori activitatea initiala a culturii
neiradiate.
În scop practic, lampile cu vapori de mercur se folosesc pentru a reduce numarul de bacterii
existente în aer în salile de operatie, în laboratoare, în încaperi în care sunt adapostite animale de
experienta etc.
Sensibilizarea fotodinamica. Razele luminoase vizibile au o actiune bactericida slaba, care poate însa
fi crescuta pâna la nivelul actiunuii razelor UV daca sunt trecute prin coloranti fluorescenti, ca, de pilda,
eozina, rosu bengal etc.

3.2. Radiatiile ionizante

Dintre radiatiile ionizante se folosesc în practica razele electromagnetice si cele particulare,
Neutronii si protonii au o penetrare redusa sau induc o radioactivitate ridicata o obiectelor de sterilizat.
Radiatiile ionizante de timul radiatiilor gamma sunt folosite pe scara larga pentru sterilizarea materialelor
medicale de unica folosinta.