MICROBIOLOGIE LP

Reactii antigen- anticorp care utilizeaza componente marcate.

Principiu: RIF, ELISA, RIA.
Teste de imunitate celulara- IDR la tuberculina.
Biopreparate utilizate in diagnostic, profilaxie si terapie.

Reactii Antigen – Anticorp in care este necesara marcarea reactantilor pentru o mai
buna vizualizare si interpretare a rezultatelor reactiei.

Marcarea reactantilor, se poate face cu:

- izotopi radioactivi (radio immuno asay, RIA),
- enzymatic (enzyme linked immuno asay, ELISA),
- substante fluorescente (fluorescent immuno asay, imunofluorescenta/ IF),
- substante chemoluniscente,
- Western Blot (WB),
- Recombinat Immunobinding Assay/ RIBA.

1. RADIOIMMUNOASSAY / RIA

Antigenele pot fi marcate cu izotopi radioactivi (3H, 125I, 14C).

Se introduce in reactie o cantitate cunoscuta de Ag marcat radioactiv, Ag
nemarcat pe care dorim sa il dozam si Ac cunoscuti cu specificitate fata de Ag.
Exista o competitie specifica pentru Ac intre Ag marcat si Ag nemarcat radioactiv.
Dupa reactie masuram radioactivitatea complexului Ag- Ac.
Concentratia Ag nemarcat o aflam comparand radioactivitatea complexului cu o
curba standard.
RIA este o metoda foarte sensibila pentru cuantificarea Ag si haptenelor.
In laboratorul clinic metoda este utilizata pentru dozarea hormonilor.
medicamentelor, si a markerilor specifici infectiei cu virusul hepatitic B (AgHBs, Ac
anti- HBs, Ac anti- HBc, Ag HBe, anticorpi anti - HBe).
Costul materialelor, riscul manipularii substantelor radioactive, au determinat
inlocuirea metodei cu tehnici imunoenzimatice (ELISA), cu eficienta asemanatoare.

2. TESTE IMUNOENZIMATICE – ENZYME IMMUNOASSAY – EIA/ ELISA:

Principiu: prezenta complexelor Ag- Ac poate fi vizualizata si cuantificata, prin

adaugarea in mediul de reactie:
- a conjugatului reprezentat fie de un Ag, fie de un Ac cunoscut, cuplat cu o
enzima,
- a substratului cromogen specific enzimei de marcare.

1
Indicatii:
ELISA poate fi folosita pentru identificarea de antigene sau anticorpi. In functie de
modificarea activitatii markerului enzimatic, reactiile ELISA pot fi clasificate in:
- reactii “in faza omogena”,
- reactii “in faza heterogena”.

 La tehnicile “in faza omogena” activitatea markerului enzimatic este

modificata de catre reactia Ag – Ac, ceea ce permite relevarea directa a
reactiei. Ac joaca rolul reactivului de legare si de revelator al complexului
Ag/ Ac, ceea ce face inutila etapa de separare.
- aceste reactii sunt utilizate in special, pentru evidentierea de medicamente si
haptene in prelevate biologice,
- utilitatea lor in microbiologia clinica este redusa.
 La tehnicile “in faza heterogena” comportamentul markerului enzimatic
este amplificat de catre reactia Ag/ Ac.
- este necesara o etapa de separare intre complexul Ag/ Ac marcat si Ag sau Ac
marcat, ramas liber,
- aceasta varianta ELISA este larg utilizata in microbiologia clinica.

a) Dozarea de Ag: tehnicile utilizate pot fi de tip competitiv sau necompetitiv:

direct si indirect.
 Tehnici competitive: competitia se realizeaza direct fata de Ac anti- Ag
imobilizati prin absorbtie pe un suport solid,
- reactivii sunt adaugati in reactie, in urmatoarea ordine: in prima etapa- Ag de
dozat si, dupa incubare, in a doua etapa, Ag marcat.
- concentratia de Ag din proba este invers proportionala cu activitatea enzimei citita
spectrofotometric dupa adaugarea substratului.
 Tehnici necompetitive directe:
- Ac anti- Ag sunt absorbiti pe suportul solid,
- in prima etapa a reactiei, se adauga in sistem proba cu Ag de dozat,
- dupa incubare si spalare, in a doua etapa, se adauga conjugatul, format din Ac
anti- Ag marcati enzimatic,
- dupa o n oua etapa de spalare si incubare, adaugarea substratului cromogen releva
activitatea enzimatica, direct proportionala cu cantitatea de Ag cuplata.
 Tehnici necompetitive indirecte: deosebirea fata de tehnica directa apare
in etapa a doua, cand Ag reactioneaza cu Ac nemarcati, adaugati in exces.
- in acest caz revelarea se face printr- un conjugat reprezentat de Ac anti-
imunglobulina marcati enzymatic.
- Conditia pentru ultimele doua tehnici este ca Ag de dozat sa prezinte cel putin 2
epitopi, identici sau nu, de unde si denumirea de tehnici cu dublu situs sau
“sandwich”.
In microbiologia clinica tehnicile ELISA/ EIA de evidentiere a AG sunt utilizate
pentru:
- diagnosticul rapid al unor bacterioze: infectii cu Streptococcus pyogenes, infectii
genitale cu Chlamydia trachomatis,

2
 - diagnosticul unor infectii virale, al caror agent etiologic este necultivabil sau greu
de cultivat: virusul hepatitei B (Ag HBs, Ag HB e) si C (Ag core/ miez), HIV (Ag
p 24) rotavirus si virusul Norwalk,
- diagnosticul bronsiolitei sugarului cu virus sincitial respirator, pentru orientarea
tratamentului spre o etiologie virala si evitarea abuzului de antibiotice,
- diagnosticul rapid al gripei,
- diagnosticul infectiilor herpetice,
- diagnosticul gastroduodenitelor virale.

b) Dozarea de Ac: datorita marii lor heterogenitati, Ac nu sunt determinati, de regula,

prin competitie, ci prin metode necompetitive directe sau indirecte.
* Tehnici necompetitive directe cu Ag marcate:
- pe baza solida este fixat in exces Ag,
- in prima etapa, Ac din proba se leaga specific de Ag,
- dupa incubare si spalare, in a doua etapa, un Ag marcat enzimatic reactioneaza cu al 2-
lea situs al Ac din complex,
- revelarea complexului format in primele doua etape se face prin adaugarea substratului
cromogen,
- activitatea enzimatica masurata este proportionala cu concentratia Ac din proba,
- tehnica mai este denumita “a dublului situs”, pentru ca Ac sunt cel putin bivalenti.
* Tehnici necompetitive indirecte cu Ac anti- imunglobulina marcati:
- deosebirea fata de tehnica directa apare in etapa a doua, cand Ac din proba reactioneaza
cu Ac anti- imunglobulina marcati enzimatic,
- activitatea enzimatica este direct proportionala cu cantitatea de Ac din proba,
- cu ajutorul acestei tehnici putem determina apartenenta Ac dozat la clase de
imunglobuline.
* Tehnici prin competitie, cu Ac marcati:
- Ac de dozat intra in competitie cu Ac marcati, care au aceeasi specificitate pentru Ag
adsorbit, pe baza solida,
- revelarea reactiei se face prin adaugarea substratului cromogen,
- activitatea enzimatica este invers proportionala cu cantitatea de Ac din proba,
Dezavantajele tehnicii:
- necesitatea conjugatelor specifice fata de variatele Ag absorbite ,
- imposibilitatea precizarii clasei de imunglobulina a Ac.
 Proba: ser sanguin, exudate, secretii etc,
 Necesar: truse comerciale, apa distilata, acid sulfuric (pentru stoparea
reactiei), pipette automate, varfuri, aparat de spalat automat si
spectrofotometrul.
 Procedura: se respecta strict indicatiile producatorului,
- repartizarea probei, a martorilor sigur (+) si sigur (-), incubarea sistemului,
- spalare pentru indepartarea reactivilor nespecifici, nefixati,
- adaugarea conjugatului si incubare,
- spalare, pentru indepartarea excesului de conjugat,
- adaugarea substratului cromogen si incubare,
- stoparea reactiei.

3
  Citire si interpretare:
- in primele 15 min dupa stoparea reactiei, se citesc rezultatele la lungimea de unda
indicata de producator (la spectrofotometru),
- daca Martorii se inscriu in limite normale, se calculeaza valoarea “prag” a trusei,
cunoscuta sub numele de “cut- off” / CO, care este o marime calculate pe baza
formulei indicate deb prospectul trusei.,
- interpretarea rezultatelor difera in functie de tehnicile utilizate:
* In tehnicile necompetitive, directe si indirecte, o proba este reactiva (are Ac) daca
absorbtia acesteia este mai mare sau egala cu valoarea CO si nereactiva (reactie negative)
daca absorbtia este sub limita CO.
* In tehnicile de tip competitiv, o proba este reactiva daca absorbtia este mai mica sau
egala cu valoarea CO si nereactiva daca absorbtia este mai mare decat CO.
Problme de interpretare ridica probele care au absorbtia egala cu +/- 10% din CO.
Aceasta este asa numita “zona gri” a trusei. Rezultatul nu poate fi interpretat si se
recomanda fie retestarea aceleiasi probe cu alt tip de trusa sau testarea unei noi probe
prelevata dupa 3- 6 luni.
Data fiind specificitatea mai redusa a tehnicilor EIA in raport cu sensibilitatea, se
recomanda ca rezultatele fals pozitive sa fie confirmate prin tehnici mai specifice, cum ar
fi Western Blot (in special in cazul infectiei HIV).
 Control de calitate: se realizeaza prin martorii pozitivi si martorii
negativi, livrati de producator, cu o anumita valoare a absorbtiei, precizata
in prospectul trusei.
 Surse de eroare: congelarea repetata a probelor, pastrarea peste 2-3 zile la
+4˚C, contaminarea probelor, prezenta eritrocitelor sau a factorului
reumatoid.

3. IMUNOFLUORESCENTA (IF):

 Principiu: conjugatele imunofluorescente realizate cu Ac specifici

recunosc antigenele din mediul de reactie, permitand evidentierea lor
microscopica. Reactia de culoare obtinuta difera in fubctie de
fluorocromul utilizat.
- IF poate fi utilizata atat in diagnosticul microbiologic direct (in produs patologic
sau cultura pura izolata), cat si in serodiagnostic. Unul dintre reactivi (Ac, Ag sau
Ac anti- Ac) este marcat fluorescent.
- Fluorocromii sunt substante organice care, dupa “iradiere” cu radiatii UV absorb
radiatia excitanta, intra in stare de excitatie si atunci cand revin la starea
“normala”, pierd energia acumulata emitand radiatii luninoase.,
- Ex. de fluorocromi: auramina O, rhodamina B, acridin – orange R, tripaflavina.
- Tehnicile IF pot fi de tip direct sau indirect:
* Tehnica IF directa: presupune incubarea probei in prezenta conjugatului:
- Ag este necunoscut, provine dintr- o cultura de identificat sau dintr-un
produs, piesa bioptica etc,
- produsul de identificat este incubat in prezenta Ac cunoscuti, marcati
fluorescent,

4
 - se spala cu tampon fosfat salin, apoi cu apa distilata, pentru indepartarea Ac
nespecifici,
- de usuca preparatul si se examineaza la microscopul cu fluorescenta.
- Aplicatii: diagnosticul unor specii ca: Legionella pneumophila, Bordetella
pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Chamydia trachomatis, treponema
pallidum, Cryptococcus neoformans, Histoplasme capsulatum, Pneumocystis
carrinni.
- metoda este rapida, aplicabila pentru frotiuri din produse patologice sau
cultura de identificat,
- se aplica in anatomie patologica, histochimie, probe biopsice, amprente
tisulare etc.
- pentru fiecare Ag de cercetat trebuie preparat serul care contine Ac specifici,
marcati fluorescent.
* Tehnica IF indirecta: presupune efectuarea unui frotiu pornind de la Ag cunoscut,
- frotiul se acopera cu un ser de cercetat si dupa o incubatie de 30 min la 37˚C, se spala
cu tampon fosfat salin si apa distilata, pentru indepartarea reactivilor care nu au intrat in
reactia Ag – Ac.
- pe frotiu se aplica un ser cu Ac anti- imunglobulina de om, marcati fluorescent si se
incubeaza 30 min la 37˚C, se spala, se usuca si se examineaza la microscopul cu
fluorescenta,
- in situatia in care in serul de cercetat exista Ac specifici Ag – lui cunoscut, se
formeaza complexul Ag- Ac, iar in etapa urmatoare, Ac anti- Ig de om se cupleaza pe
complex,
- in mod indirect, prin fluorescenta, se identifica Ac,
- Aplicatii: diagnosticul serologic al infectiilor produse de Legionella pneumophila,
Mycoplasma pneumoniae, Leptospira spp, Borrelia burgdorferi, Treponema pallidum,
Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Pneumocystis spp.

4. TEHNICA WESTERN – BLOT

 PRINCIPIU: numeroase membrane sintetice pot lega proteine suficient

de puternic incat devin suport pentru reactii imunologice in faza solida.
- proteinele legate isi pastreaza reactivitatea antigenica fiind accesibile Ac din
proba de testat,
- acest principiu a dus la dezvoltarea unui numar mare de tehnici sensibile, cu mare
specificitate, numite generic “imunobloturi”,
- curent utilizata este tehnica Western Blot (WB) in care, proteinele sunt transferate
dintr- un gel de electroforeza pe o membrana suport si, ulterior reactioneaza cu Ac
din proba,
- tehnica WB combina selectivitatea electroforezei in gel cu specificitatea testelor
imunologice, ceea ce permite detectarea si analizarea proteinelor aflate in
amestec,
- rezultatele sunt calitative.

5
  Indicatii: confirmarea serurilor reactive (positive) prin tehnica ELISA sau
IF,
 Proba: ser sanguin prelevat si conservat in conditii uzuale,
 Necesar:
- truse comerciale care contin: benzile de nitroceluloza cu Ag fixate si reactivii
necesari,
- micropipete automate,
- agitator,
- sistem de spalare a benzilor.
 Procedura: respecta indicatiile producatorului.
 Citire si interpretare: vizualizarea reactiilor positive presupune aparitia
unor linii cenusii- negrein dreptul antigenelor fata de care exista Ac in
proba testate,
- liniile de intensitate foarte slaba duc la interpretari subiective,
- in acest caz, se recomanda repetarea testului pe o noua proba, la un interval de 1-
3 luni.
 Control de calitate: se face cu seruri positive si negative, incubate
separat.
 Limite: prin scindare, migrare, etalare, unele situsuri antigenice pot fi
denaturate, ceea ce genereaza rezultate fals negative,
- cand un rezultat WB este neconcludent si in contradictie cu supozitia clinica, se
impune folosirea unei tehnici principial diferite, PCR.

5. RECOMBINAT IMMUNOBINDING ASSAY (RIBA)

 Principiu: tehnica este asemanatoare cu WB, dar Ag fixate pe banda de

nitroceluloza sunt obtinute prin recombinare, sunt plasate la distanta egala
unele de altele si nu in functie de mobilitatea in campul electroforetic.
 Indicatii: confirmarea serurilor reactive (pozitive) in ELISA, cu
precizarea specificitatii Ac fata de Ag imobilizate pe banda.
 Proba: serul sanguin,
 Necesar: truse comerciale (benzi cu antigene imobilizate, reactivi),
 Procedura: respecta indicatiile producatorului,
 Citire si interpretare:
- producatorul indica numele si pozitia fiecarui Ag fixat pe banda,
- pe fiecare banda sunt inclusi doi martori pozitivi (M+): unul “slab” si celalalt
“intens pozitiv”. O banda separata foloseste ca martor negative (M-),
- se examineaza intensitatea spoturilor pentru M(+) si M(-); rezultatele sunt validate
cand:
- intensitatea spoturilor M(+) este cel putin 2+ pe scara de la 1+ la 4+,
- spoturile M(-) trebuie sa aiba o intensitate mai slaba decat ale martorului slab
pozitiv,
- determinarea raspunsului fata de fiecare Ag o facem comparand intensitatea
spoturilor cu cea a martorilor slab si intens pozitiv.

6
 5. EVALUAREA RASPUNSULUI IMUN DE TIP CELULAR

Teste imunobiologice: * Tehnica intradermoreactiei (IDR):

- care utilizeaza Ag ce stimuleaza raspunsul imun de tip celular (“intarziat”)/
RIC.

* Intradermoreactia la tuberculina (derivate proteic purificat, PPD, extras din

cultura de Mycobacterium tuberculosis).
* Principiul metodei: tuberculina reprezinta un amestec standardizat de Ag proteice
extrase din tulpina de Mycobacterium tuberculosis, utilizat pentru diagnosticarea infectiei
tuberculoase.
- dupa ce o persoana se infecteaza cu Mycobacterium tuberculosis, urmeaza
sensibilizarea si proliferarea anumitor populatii de limfocite T (LT),
- injectarea intradermica a tuberculinei stimuleaza LT si declanseaza o serie de
evenimente ce conduc la aparitia manifestarilor RIC (raspunsului imun CELULAR),
- reactia implica vasodilatatie, edem, infiltrate cu limfocite, bazofile, macrophage,
neutrofile,
- raspunsul maxim se constituie la 48 ore de la injectare,
- aria induratiei (infiltratului celular) reflecta hipersensibilitatea de tip intarziat,
- eritemul reprezinta o reactie inflamatorie acuta, cauzata de vasodilatatia capilara, iar
aparitia lui nu va fi interpretata drept o reactie pozitiva,
- limfocitele sensibilizate ating un nivel adecvat pentru a conduce la aparitia unui raspuns
interpretabil dupa 2- 4 saptamani de la infectia initiala cu M. tuberculosis,
* Materiale si reactivi necesari:
- In Romania se utilizeaza tehnica injectarii intradermice cu PPD IC – 65, produs de
INCDMI “Cantacuzino”.
* Tehnica de lucru:
- se verifica daca produsul de injectat respecta termenul de valabilitate si conditiile de
conservare, conform producatorului,
- se utilizeaza seringi de 1 ml, cu diviziuni clar marcate, ace pentru injectare
intradermica, de unica utilizare,
- se agita energic fiola pentru omogenizarea continutului,
- se aspira in seringa intreaga cantitate de produs din fiola, evitand a aspira bule de aer,
- se antiseptizeaza suprafata cutanata cu alcool, pe fata anterioara a antebratului,
- se cuprinde zona antebratului in palma, se intinde bine tegumentul,
- se patrunde cu acul intradermic,
- se injecteaza 0,1 mL: daca injectarea s-a facut strict intradermic, apare o bula usor
denivelata, cu margini relative abrupte, cu aspect de coaja de portocala, si diametrul de 5-
8 mm,
- in lipsa aparitiei acestei bule, se reia manevra, repetand injectarea, la o distanta de 3-5
cm sau la antebratul opus.
- la persoanele care au fost infectate anterior (sensibilizate), la locul injectarii apare o
reactie constand din: eritem- edem- induratie, incepand dupa 6 ore si atingand un nivel
maxim dupa circa 36- 60 ore, care se retrage dupa cateva zile.
- pe locul reactiei poate persista o perioada indelungata, o zona de hiperpigmentatie.

7
* Citirea rezultatelor:
- se recomanda o prima citire la 24 ore, la lumina naturala, apoi, citire definitiva la 72
ore,
- se masoara diametrul maxim al zonei de infiltratie,
- infiltratia dermica “tip Palmer”, prezinta mai multe stadii:
* tip I: induratie ferma sau prezenta unei flictene,
* tip II: induratie elastica,
* tip III: infiltratie depresibila,
* tip IV: fara infiltratie aparenta.

Interpretarea rezultatului testului tuberculinic (IDR la PPD):

- Centrul de Control si Prevenire a Bolilor Atlanta – Georgia (CDC), a modificat
relative recent clasificarea reactivitatii la testul cutanat efectuat cu 5 UI PPD:
 Reactia pozitiva: daca diametrul induratiei este mai mare de 5 mm,
in urmatoarele cazuri:
- la personae care au avut un contact recent cu bolnavi TB,
- personae cu semen radiologice de TB,
- personae infectate cu HIV,
 Reactia este pozitiva daca diametrul induratiei este mai mare de 10
mm, la personae care nu apartin categoriilor anterior mentionate, dar
prezinta alti factori de risc:
- personae nascute in tari cu prevalenta crescuta a bolii TB,
- personae care utilizeaza droguri administrate pe care injectabila,
- personae fara adapost, care locuiesc in azile sau institutii corectionale (puscarii),
- personae care sufera de boli imunodeprimante (diabet zaharat, boli hematologice/
anemii, leucemii, boli de sistem, autoimune, malnutritie etc) sau care fac
tratament cu medicamente imunosupresive.
 Reactia este considerata pozitiva daca diametrul induratiei este mai
mare de 15 mm in cazul altor situatii decat cele prezentate mai sus.

! Persoanele infectate cu alte tipuri de Mycobacterii decat cele tuberculoase, pot

prezenta reactii positive dupa IDR cu PPD, insa, de regula, diametrul induratiei este
mai mic de 10 mm.
!! In tara noastra se considera drept pozitive reactiile atunci cand diametrul este
mai mare sau egal cu 9 mm.

6. BIOPREPARATE:

PRODUSELE IMUNOBIOLOGICE: utilizate in profilaxia si/ sau tratamentul

bolilor infectioase:
- Seruri hiperimune,
- Vaccinuri,
- Imunomodulatori.

8
 1. Seruri imune: utilizate in scop terapeutic, cel mai frecvent
utilizate sunt serurile imune heterologe obtinute prin imunizarea
animalelor (frecvent, cailor). In vederea imunizarii animalelor, se
utilizeaza toxine si anatoxine.
* Imunoglobuline standard (concentrate de Ac): din placenta sau sange de donatori,
- folosite in scop profilactic,
- in tratamentul asociat al unor infectii severe,
* Imunglobuline specifice (hiperimune):
- obtinute de la persoane imunizate (natural sau artificial) cu un anumit Ag,
- utilizate in tratamentul tetanosului, rabiei, varicelei, herpes zoster, infectii cu virusul
citomegalic etc,
* Seruri immune heterologe:
- obtinute de la animale imunizate (hiperimunizare) artificial,
- utilizate in tratamentul unor boli, in care rolul esential apartine unei exotoxine: difterie,
tetanos, botulism, gangrene gazoasa etc.

2. Vaccinuri:
- sunt produse biologice administrate in special in scop preventiv,
- Ex: varsta 0 – 7 ani: vaccinare BCG (tuberculoza), prima doza vaccinare anti-
hepatita B,
- 2- 6 luni: vaccinare pentru prevenirea infectiei cu virusul polio, pentru prevenirea
difteriei- tetanosului- tusei convulsive,
- 9-12 luni: vaccinare antirujeoloasa,

3. Imunomodulatori:
- unele infectii bacteriene stimuleaza in mod nespecific organismul gazada,
conducand la aparitia unei rezistente fata de alti agenti infectiosi, sau chiar fata de
aparitia unor modificari neoplazice,
- imunomodulatorii administrati mentin functiile imune in limite normale,
- un imunomodulator trebuie sa aiba o serie de calitati: sa nu fie antigenic, sa nu
conduca la fenomenul de hipersensibilitate, sa nu genereze reactii adverse, sa
poata fi administrat concomitent cu alt antigen in scop terapeutic, usor de produs
etc,
- preparate monomicrobiene: tulpina vaccinala BCG, Corynebacterium parvum,
Cantastim (normalizeaza functiile fagocitare si secretorii ale macrofagelor,
functiile citotoxice ale celulelor NK si T citotoxice, (CD8+), cooperarile
intercelulare, activitatea limfocitelor T helper (CD4+), si limfocitelor B (CD 19+).
- preparate polimicrobiene: Bronhodin, Aerodin, Polidin, Bronhovaxom,
- interferonul, interleukinele, factori de necroza tumorala/ TNF, factori de crestere a
macrofagelor etc,