Departamentul de Sanatate si

Dezvoltare Umana

METODA ELISA DIRECTA

Facultatea Educatie Fizica si Sport

Anul 1,semigrupa 1411D - ND - 2018
Studenta:Cojocaru Elena-Gianina
Profesor Indrumator: as .drd. LUCA LILIANA

1
 Cuprins
1. Tehnica ELISA – scurt istoric
2. Definitie si principiul metodei
3. Etapele fundamentale
4. Materiale si reactivi necesari
5. Surse de eroare
6. Bibliografie

2
Scurt istoric:

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbet Assay) reprezinta la ora actuala, una din
cele mai des folosite metode, de indentificare si apreciere cantitativa pentru
anticorpi, antigene, hormoni, citokine si o paleta larga de alte molecule, inclusiv
peptide sintetice.
Tehnica ELISA a fost inventata de un grup de cercetatori de la Universitatea din
Stokholm condus de Peter Perlmann si Eva Engval, acestia publicand primul
articol despre ELISA in 1971. Articolul descria aprecierea cantitativa a IgG in
serul de iepure folosind fosfataza alcalina ca enzima de indentificare. Avantaje
de siguranta crescuta si cele economice, fata de testarea radioimuna(RIA) au
facut din tehnica imunoenzimatica ELISA una indispensabila pentru domeniul
medicinei clinice, biologiei si al biotehnologiei.

Principiul metodei:

Metoda ELISA presupune adsorbtia unuia dintre componentii imuni Ag sau Ac

pe un suport solid. Imunoadsorbtia permite fixarea ulterioara a reactantilor din
faza lichida, care urmeaza sa fie identificati ( tehnici calitative ) sau dozati
(tehnici cantitative).
Etapa finala este o reactie enzimatica, relevata printr-o modificare de culoare.
Citirea se face spectrofotometric, iare interpretarea se face in functie de valoarea
adsorbantei (intensitatea culorii), martorii +, - si valoarea de prag.
METODE
a) metoda ELISA INDIRECTA
b) metoda ELISA COMPETITIVA
c) metoda ELISA de tip sandwich

Reactia imunoenzimatica (RIE, ELISA) directa.

Tehnica de dozare enzimatica a sangelui permite detectarea imunoglobulinelor
indreptate impotriva unui agent bacterian sau viral.
Testul Elisa permite determinarea faptului ca o persoana este sau nu infectata cu
un microorganism dat. Testul este numit seropozitiv in caz de infectie si
seronegativ in caz contrar. El serveste mai ales la diagnosticarea unei
seropozitivitati datorate a infectiei HIV. Orice pozitivitate a acestui test implica
verificarea sa printr-un procedeu mai specific, ca reactia Western-Blot.
RIE reprezinta o interactiune  a Ag (antigenului) cu Ac(anticorpul) care este
asociat cu o enzima. Complexul format  capata o activitate enzimatica si
scindeaza substratul respectiv, exteriorizind efectul de coloratie pregnanta.RIE
directa aprecizeaza prezenta Ag prin intermediul Ac, cantitatea de enzima fixata
de substrat corespunde cantitatii de Ag.

3
 RIE directa (metoda sandwich) este utilizata doar in sero-identificarea Ag. In
godeurile din placa de polistiren in care sunt fixati Ac cunoscuti se toarna solutia
de Ag necunoscuti. se incurbeaza pe 1 ora. Dupa spalare minutioasa a godeurilor
se adauga Ac marcati cu enzime, care se fixeaza pe epitopii liberi ai Ag
polivalent. Dupa incurbare de 30 min.-1 ora se spala iarasi godeurile. Prezenta
complexului Ac-Ag-Ac-marcat se depisteaza cu ajutorul substratului cromogen
(substanta initial incolora, dar care se coloreaza sub actiunea enzimei,ex. apa
oxigenata si orthofenilendiamina).
Rezultatele reactiei se apreciaza vizual sau instrumental. La citirea vizuala se
determina dilutia maxima a materialului de examinat, in care intensitatea
coloratiei este mai pronuntata fata de cea de control (albumina serica bovina).
La citirea rezultatelor cu spectrofotometrul ca pozitiva se considera dilutia
maxima a materialului examinat, unde nivelul extinctiei prevaleaza cel putin de
2 ori nivelul extinctiei din dilutia respectiva a componentului eterolog al reactiei.
Aplicarea practica: pot fi detectati  Ag in diferite afectiuni .

Metoda ELISA de tip sandwich se bazeaza pe faptul ca Ac sunt cel putin

bivalenti. La faza solida se adsorb antigenele, de care se vor lega Ac din proba.
Conjugatul – Ac-enzima , ocupa valentele libere ale Ac din proba ( Ac de dozat
intre 2 straturi de Ag)

4
Raspunsul imun produce molecule de legare biologice, sau celule de
microorganisme, care sunt de fapt incearca sa gaseasca, iar reactia enzimatica ne
permite sa vedem si sa masoare rezultatul unei reactii imunologice. Aceasta este
raspunsul imun - face parte dintr-o tehnica complexa, care detecteaza de fapt
microb dorit. O reactie enzimatica - este acea parte a unei tehnici complexe, care
permite sa traduca rezultatul raspunsului imun in forma vizibila si accesibila
masuratorii tehnice chimice de rutina. Bazat pe o astfel de metoda , analizam
separat ambele parti.
Raspunsul imun este o reactie de legare specifica a unui antigen cu un anticorp
pentru a forma un complex imun.
Pe suprafata fiecarei celule a oricarui organism exista structuri speciale numite
antigeni.
Antigenele in general - sunt molecule care transporta informatii despre celule.
Antigenele individuale sunt diferite. Doua exemplare identice de antigene
individuale nu exista! Al doilea tip principal de antigen - este antigenul de
specie, care este inerenta unei anumite specii de vietuitoare. Pe suprafata fiecarei
celule sunt prezente in mod necesar antienl de specie si antigenul individual.
Antigenul specific este utilizat de celule ale sistemului imunitar pentru
recunoastere Precizia unei astfel de recunoasteri imunologice este uimitoare.
Anticorpul este o molecula speciala localizata pe suprafata celulelor imune.
Anticorpul se leaga de antigenul celulei suspecte. In cazul in care apare
semnalul „straina“, anticorpul nu rupe legatura cu antigenul, si vice-versa, prin
trimiterea de semnale specifice, determina o „consolidare“. Biologic inseamna
ca alti anticorpi in cealalta parte a celulelor incep sa se miste intr-o zona in care
exista un semnal de pericol, si, de asemenea, formeaza o legatura intre un
antigen si anticorp. In final, antigenul este inconjurat pe toate partile si ferm de
anticorp - numit complex imun.
Anticorpul este o structura proteica. Astfel, Anticorpii sunt imunoglobuline.
Exista cinci tipuri de imunoglobuline (Ig), care se leaga de diferite tipuri de
antigene in diferite locuri ale corpului uman (de exemplu, piele, mucoase, sange,
samd). Aceste imunoglobuline sunt denumite dupa alfabetul latin - A, M, G, D,
E si sunt desemnate dupa cum urmeaza - IgA, IgM, IgG, IgD, IgE. In diagnostic
este folosit doar un singur tip de anticorp, care este cel mai specific pentru un
microb definit. Cele mai frecvent utilizate IgG si IgM.
Reactia enzimatica - o reactie chimica in care o substanta este transformata de
enzima specifica. Substanta asupra careia actioneaza enzima se numeste
substrat. O substanta care se obtine prin impactul unei enzime numite produsul
de reactie . Caracteristica reactiei enzimatice este ca o anumita enzima
actioneaza numai pe un substrat specific. Aceasta proprietate a enzimei de a
recunoaste substratul este numita afinitate. Astfel, fiecare enzima actioneaza in
mod specific asupra unui anumit substrat.

5
Enzimele din lumea biologica cunosc o mare varietate, precum si reactii
enzimatice. ELISA foloseste doar cateva reactii enzimatice - nu mai mult de 10.
In colorimetrie sunt doua posibilitati pentru densitatea de culoare in functie de
concentratia substantei - este direct proportionala dependenta sau invers
proportionala.
Din punct de vedere tehnic, acest lucru are loc dupa cum urmeaza: luate mai
multe solutii de concentratie cunoscuta densitatea substantei masurata a acestor
solutii, concentratia este reprezentata grafic pe densitatea culorii (Graficul de
calibrare). In continuare, se masoara densitatea culorii solutiei, concentratia care
apare, iar graficul de calibrare sunt valoarea concentratiei corespunzatoare
nivelului de densitate. Colorimetrele automate moderne masoara densitatea
culorii odata ce calibrarea este efectuata si unitatea construieste o curba de
calibrare, care ramane in memorie si masoara in mod automat
In ELISA directa se folosesc anticorpi pentru a identifica antigenul cuplat cu o
anumita eticheta. Aceasta eticheta special este un substrat al reactiei enzimatice.
Atasarea antigenului la antigenul de suprafata si compusul godeurilor cu
anticorpi . Materialul biologic (sange, raclaj mucus, frotiuri) este plasat in
godeuri speciale timp de 15-30 de minute . Godeurile sunt clatite de mai multe
ori cu o solutie speciala, care permite indepartarea anticorpilor „extra“. Reactia
enzimatica consta in formarea unui compus colorat.
Apoi incepe faza a doua - o reactie enzimatica. Alveolele spalate au fost
adaugate la solutia de enzima si se lasa sa stea timp de 30-60 minute. Aceasta
enzima are o afinitate pentru o substanta (eticheta specifica), care este asociat cu
anticorpul. In urma reactiei enzimatice aceasta eticheta speciala (substrat) este
transformata intr-o substanta colorata (produs).
Apoi, urmeaza metoda colorimetrica pentru determinarea concentratiei
substantei colorate. Deoarece aceasta eticheta specifica este asociata cu
anticorpi, atunci concentratia produsului de reactie colorat este egal cu
concentratia de anticorpi. Concentratia de anticorpi este egala cu cea a
antigenului . Astfel, in urma analizei, vom obtine raspunsul, ceea ce este
concentratia microb detectat sau un hormon.

6
Etape fundamentale:

• Prepararea conjugatului
Conjugatul este reprezentat de un antigen sau un anticorp cu specificitate pentru
molecula de determinat, cuplat cu o enzima. Cuplarea enzimei se realizeaza prin
cross-linkare sub actiunea unor agenti favorizanti cum ar fi glutaraldehida, di-
iso-cianat toluen, p-benzochinona, etc.
Desi un grup mai mare de enzime au fost utilizate de-a lungul timpului,
fosfataza alcalina si peroxidaza din hrean(HRP-/7orserac//s/) peroxidase) raman
cele mai populare datorita randamenului oferit prin prelucrarea rapida a
substratului si a gamei vaste de tehnici de developare existente.
Alte enzime folosite in tehnica ELISA sunt (3-galactozidaza, glucozoxidaza,
pirofosfataza, etc.
In cazul in care conjugatul folosit este reprezentat de un grup enzima-anticorp,
anticorpul respectiv trebuie sa fie ales in asa fel incat sa recunoasca alt
determinant antigenic al moleculei de determinat cum ar fi fragmentul Fc al
imunoglobulinei sau alt epitop al antigenului.

• Fixarea anticorpului sau antigenului de captura pe placa

Pentru pregatirea unei determinari ELISA, pregatirea placii de reactie este foarte
importanta.
In general se folosesc placi de microtitrare cu 96 de godeuri fabricate din
material plastic.
Majoritatea proteinelor pot fi adsorbite pe suprafete din plastic datorita
interactiunilor hidrofobice intre structurile proteice nepolare si structurile
nepolare ale matricei polimerului.
Exista mai multe protocoale de fixare, dar cele mai des folosite, implica
incubarea unei dilutii a anticorpului sau antigenului de captura in godeul placii
de microtitrare intr-un tampon carbonat la pH 9-10.
Incubarea poate fi de cateva ore sau peste noapte si se face la 37°C sau la
temperatura camerei.
Placa de microtitrare astfel pregatita poate fi pastrata la 4°C pana la 6 luni.
Deoarece fixarea anticorpilor de placa nu este una specifica este necesara
blocarea situsurilor de legare nespecifica pentru a preveni fixarea celorlalti
reactanti de placa in locul interactiunii acestora cu anticorpul fixat.
Blocarea se realizeaza de obicei prin incubarea cu un tampon de blocare, format
de obicei dintr-o proteina inerta si un detergent neionic.

• Incubarea antigenului sau anticorpului de determinat in placa

Adaugarea dilutiei de antigen sau anticorp in placa de reactie reprezinta prima
etapa efectiva a tehnicii ELISA si nu un pas pregatitor.

7
In aceasta etapa molecula de determinat se ataseaza prin legaturi de hidrogen,
ionice, interactiuni hidrofobice si forte de interactiune van der Waals, de
anticorpul/antigenul completentar, de captura.
Incubarea se realizeaza de obicei la temperatura camerei timp de 2 ore.
Cu toate ca numarul de legari specifice in timp de 2 ore este de obicei suficient
pentru a obtine un semnal puternic in reactia cromogena, saturarea situsurilor de
legare(starea de echilibru) este atinsa in aproximatix 5-10 ore, asa ca o incubare
mai lunga poate duce la rezultate mai bune.

• Indepartarea reactantilor liberi din placa (Spalarea)

Un pas foarte important in tehnica ELISA il reprezinta etapele de spalare.
Moleculele nefixate fie in timpul aderarii la placa fie in timpul legarilor
specifice cu anticorpii de captura trebuiesc eliminate din godeuri pentru a nu
inhiba legarea reactantilor ce urmeaza a fi adaugati ceea ce ar conduce la un
rezultat eronat.
O etapa de spalare presupune incarcarea godeurilor cu o anumita cantitate de
tampon de spalare si indepartarea tamponului de spalare dupa o perioada scurta
de timp.
Tamponul de spalare este reprezentat in general de o solutie de tampon fosfat
salin(TFS) la care se poate adauga 0,05% azida de sodiu(NaN3).
Pentru a asigura o spalare buna a placii si implicit o indepartare eficienta a
reactantilor liberi din placa sunt necesare mai multe spalari intre etapele
determinarii.
La sfarsitul fiecarei etape de spalare, indiferent de numarul de spalari din
respectiva etapa, este bine sa se elimine orice urma de tampon de spalare din
godeuri. Pentru aceasta, placa este intoarsa si scuturata energic pe un prosop de
hartie.
Foarte importante raman spalarile dupa fixarea antigenului pe placa, dupa prima
incubare si dupa incubarea cu solutia de conjugat.
Numarul de spalari intr-o etapa poate fi cuprins intre 2 si 5 dar atat timp cat
spalarile nu sunt facute intr-o maniera „brutala" un numar mai mare de spalari
nu poate decat sa creasca calitatea tehnicii.
Spalarea se poate face manual folosind o pipeta multichannell sau cu un spalator
automat ELISA.
La folosirea spalatorului automat trebuie acordata atentie deosebita folosirii unor
placi recunoscute de aparat si ajustarea setarilor aparatului la tipul de godeuri -
cu fundul plat, conic, rotund.

• Incubarea conjugatului in placa

in functie de tipul de ELISA aplicat, adaugarea conjugatului in reactie presupune
legarea acestuia de anticorpul de determinat sau de antigenul specific.
Ca si in etapa de incubare a anticorpilor sau antigenelor de determinat
prelungirea timpului de reactie poate oferii un semnal mai puternic.

8
Dupa incubare, placile sunt spalate si pot fi pastrate la 4°C cateva luni pana la
adaugarea substratului cromogen.

• Adaugarea substratului cromogen

Adaugarea substratului cromogen reprezinta o etapa critica in tehnica ELISA
deoarece este etapa in care rezultatul pozitiv sau negativ poate fi apreciat. Este
de asemenea prima etapa in care putem semnala daca vreo etapa in protocol a
fost executata gresit sau unul dintre reactivi nu functioneaza.
Substratul cromogen este adaugat in godeuri si placa este incubata la intuneric o
anumita perioada de timp, in functie de caracteristicile enzimei si ale
substratului, si reactia este oprita prin adaugarea unei solutii de stopare.
Timpul de incubare al substratului cromogen in proba cu conjugatul fixat se
determina empiric prin observarea modificarii culorii amestecului de reactie
pana la o intensitate comparabila cu cea teoretica a produsului final.
Conjugatul poate fi reprezentat de o enzima cuplata cu straptavidina, o proteina
tetramerica obtinuta din bacteria Streptomyces avidinii, ce are o afinitate foarte
mare pentru biotina(vitamina H). Biotina poate fi cuplata prin diverse procedee
la un aticorp si astfel, pe baza afinitatii streptavidinei pentru biotina, conjugatul
se poate cupla la anticorpul biotinilat fara a fi nevoie de un conjugat enzima-
anticorp specific. Aceasta procedura este deosebit de importanta in cazul
tehnicilor ELISA sandvis in care se dispune de o cantitate mica de anticorpi
monoclonali, folosirea complexului stravidina-biotina amplificand sensibilitatea
analizei de 2-5 ori.
Desi aceasta incursiune presupune adaugarea de pasi la protocolul initial, efortul
este unul recompensat printr-o imbunatatire considerabila a sensibilitatii
analizei.

• Interpretarea rezultatelor
Consta in aprecierea culorii probei. Intensitatea culorii se apreciaza mai intai
vizual, pentru determinarea virarii de culoare dupa adaugarea substratului si
stabilirea timpului de mentinere a lui pana la stoparea reactiei.
Densitatea optica a fiecarei probei se apreciaza la stectrofotometru, la o lungime
de unda corespunzatoare.

Aprecierea rezultatelor se face prin doua metode :

1. Metoda calitativa de apreciere a pozitivitatii probelor, prin calcularea valorilor
prag (cut off) fata de care se raporteaza absorbanta fiecarei probe. Aceasta
valoare este determinata corform formulei:
COX+ 2 DS, unde CO este valoarea prag (cutt off), X - media valorilor negative,
DS este deviatia standard. Probele cu valoarea absorbantei sub limita prag sunt
considerate negative iar cele peste aceasta valoare sunt considerate pozitive.
2. Metoda cantitativa presupune folosirea unor probe standard, de concentratii
cunoscute, cu ajutorul carora se traseaza o curba standard. Aceasta se realizeaza

9
prin introducerea concentratilor probelor standard pe axa X a unui grafic, a
valorilor densitatilor optice respective pe axa Y si stabilirea punctelor de
intersectie. Curba standard se defineste ca cea mai apropriata ecuatie liniara care
sa intersecteze cat mai multe din punctele de pe grafic.
Folosindu-ne de valorile cunoscute putem extrapola o functie, a relatiei dintre
densitatea optica si concentratia probei, prin regresie liniara. Ecuatia obtinuta
fiind de forma:
DO=C*k + DO0 , unde DO este densitatea optica a probei, C - concentratia
probei, k - constanta, DO0-valoarea absorbantei la o concentratie a probei egala
cu 0.
Valoarea lui DO0 poate fi calculata in orice program de calcul computerizat
printr-o functie ce returneaza valoarea unei curbe in punctul de intersectie cu axa
Y. in Microsoft Excel putem folosi functia INTERCEPT avand ca parametri pe
de-o parte valorile concentratiilor probelor standard si pe de alta parte valorile
densitatilor optice respective.
Dupa calcularea lui DO0 putem afla valoare lui k si de aici prin rezolvarea
ecuatiei obtinem formula de calcul a concetratiei probelor in functie de valoarea
densitatii optice :
C = (DO - DO0)/k

10
Materiale si reactivi necesari:

Tehnicile ELISA, indiferent de tipul folosit, necesita in general acelasi set de

materiale si reactivi, exceptand evident solutiile de testat si anticorpii, respectiv
antigenele, complementare care definesc fiecare protocol in parte.

Materiale si reactivi necesari:

- pipete automate de volume diferite(1 -500ul) si varfuri corespunzatoare;
- pipeta multichannel si varfuri corespunzatoare;
- placi de microtitrare corespunzatoare modelului experimental;
- piseta de plastic;
- spectrofotometru;
- cuve plastic pentru pipeta multichannel; REACTIVI:
- solutie agent de developare (conjugat enzima-anticorp/antigen);
- solutie antigen;
- solutie anticorpi de testat;
- TFS (tampon fosfat salin);
- apa distilata sau deionizata;
- substrat cromogen NPP(p-nitrofenil fosfat) sau TMB(tetrametilbenzidina);
- tampon de blocare a legarilor nespecifice;
- solutie de stopare (NaOH, H2S04)
- tampon de spalare;
- tampon de fixare a anticorpilor/antigenelor pe placa;
in cazul tehnicilor ELISA celulare(cELISA) la lista de materiale si reactivi se
adauga:
- solutie de suspensie celulare;
- solutie de conjugat enzima-anticorp specific
- tampon de spalare, tinut pe gheata;
- placi de microtitrare cu fundul rotund sau conic.

Surse de eroare:

Teoretic, orice etapa din protocolul ELISA poate reprezenta o sursa de eroare,
dar studiile au demonstrat ca numai o parte din proceduri pot fi considerate ca
surse semnificative de eroare. Aceste proceduri critice sunt pipetarea solutiei de
testat si a substratului cromogen si absorbanta inerenta a placilor de microtitrare.
Acestea sunt totusi probleme de finete pe care le pot intampina pana si cei cu
experienta in tehnica ELISA.
Conditii de indeplinit si posibile surse de eroare:
• Toti reactivii si placile de microtitrare se aduc la temperatura camerei inainte
de utilizare;

11
• Desi tehnica ELISA nu impune conditii de sterilitate, sticlaria si consumabilele
(varfuri, cuve, etc.) trebuiesc sa fie cat mai curate si fara urme de detergenti;
• Concentratia reactivului ce urmeaza a fi adsorbit pe suportul solid trebuie
determinata pentru fiecare cuplu suport-proteina si pH-ul solutiei trebuie sa fie
unul adecvat.
• Blocarea situsurilor de legare nespecifica este o etapa foarte importanta in
protocol. Tamponul de blocare asigura atat saturarea suprafetei godeului,
prevenind astfel fixarea anticorpilor de detectie sau a conjugatului de faza
solida, cat si inhibarea legarii anticorpilor specifici la antigenul/anticorpul de
captura.
• Aranjamentul probelor in placa poate influenta rezultatul determinarii. Pentru
un protocol de mare precizie este bine sa lasam marginile placii(randurile A si
H) libere pentru a masura absorbanta placii iar probele de control, pozitiv si
negativ, pot fi distribuite aleatoriu in zone diferite ale placii (Caciagli si
Verderio, 2003).
• Dilutia probei pozitive cercetate trebuie sa corespunda unei valori a
absorbantei semnificativ pozitive.
• Enzima utilizata in conjugat trebuie sa aibe o specificitate ridicata si un
randament ridicat in transformarea substratului. Este de asemenea important ca
problele de testat sa nu contina substante care ar putea intefera cu stabilitatea sau
activitatea enzimei.
• Concentratia conjugatului enzimatic trebuie sa corespunda celei mai mici
valori care asigura vizualizarea complexului format.
• Pentru rezultate mai bune, probele se lucreaza in duplicat sau chiar triplicat.
Media valorilor absorbantei este folosita pentru determinarea concentratiei
probei.
• Manevrarea brusca a placii sau adaugarea prea rapida a probelor, tamponului
de spalare in placa poate duce la desprinderea moleculei de captura de pe
suportul solid.
• Daca folositi spalatorul automat, asigurati-va ca aparatul este potrivit pentru
tipul de placa folosit si acordati atentie adancimii la care coboara acul de spalare
in placa. Setarea neadecvata a aparatului poate duce la aspirarea anticorpilor de
captura, zgarierea fundului placii sau chiar la stricarea aparatului. Este de
preferat sa folositi spalatorul automat doar in cazul folosirii unor kituri ELISA
cumparate al caror protocol prevede folosirea unui astfel de aparat. Placile
pregatire in laborator pot fi mai sensibile la mecanica spalatorului automat si
astfel rezultatul protocolului are de suferit.
• In cazul folosirii tehnicii cELISA, etapele de spalare necesita o atentie deosita.
Placile vor fi mai intai centrifugate la parametrii specificati in protocol si
supertanatul trebuie inlaturat cu grija pentru a nu desprinde butonul celular.
Adaugarea tamponului de spalare se va face intr-un mod bland. La finalul unei
etape de spalare, placa va fi agitata pentru desprinderea butonulu celular si

12
celulele vor fi resuspendate in reactivul aferent etapei urmatoare. Tamponul de
spalare trebuie sa fie tinut pe gheata.
• Concentratia solutiei de captura va fi invers proportionala fata de concentratia
teoretica a solutiei de testat pentru a prevenii legarea conjugatului sau
anticorpilor secundari la molecula de captura.

Bibliografie:
1.Olinescu A., Dolganiuc A., Imunologia practica in clinica si experiment,
subcapitolul: Analiza imunoenzimatica ELISA, pg. 153-157, Ed. Viata Medicala
Romaneasca, Bucuresti, 2001 '
2.Medicina de laborator-Mathias Imohl-2017
3.Metode de laborator in microbiologie –Iasi, Ed.Tipo-Moldova-2002
4.Tehnici de microbiologie farmaceutica - PIM-2014

13