REACTIILE

SEROLOGICE
Sunt reactii Antigen – Anticorp

 Se pot folosi:
- in diagnosticare, pentru evidentierea fie a Ag, fie a Ac

- in tratament, pentru stimulare/ inhibare Ag/ Ac

Ex. : vaccinarea
Proceduri de diagnostic
Calitativa= un rezultat prezent-absent
 Cantitativa= avem o cifra si o unitate de masura

Exista tehnici sensibile si specifice

Sensibile: numar minim de rezultate fals-negative, selecteaza indivizii la
risc si se foloseste in procedurile de screening
Necesita intotdeauna confirmare printr-o metoda specifica
Specifice: numar minim de rezultate fals-pozitive (tehnica de confirmare)
Exemplu

 Pentru diagnosticul cancerului mamar, se face mamografie (tehnica sensibila),

pentru selectarea pacientelor la risc (metoda de screening)
 Tehnica specifica este reprezentata de biopsie (pentru confirmarea diagnosticului)
Clasificare
I. Reactii serologice simple
 reactia Ag-Ac este vizualizata direct

II. Reactii serologice complexe

 Pentru vizualizarea reactiei, este nevoie de un MARKER:
 Substanta fluorescenta- IMUNOFLUORESCENTA
 Substanta radioactiva- RIA
 Enzima- EIA
 Luciferina- CHEMILUMINISCENTA
I. Reactii serologice simple

1. Reactii de precipitare

2. Reactii de aglutinare
1. Reactii de precipitare
Atat antigenul, cat si anticorpul sunt solubile si la intalnirea Ag-Ac
precipita, devin insolubile

 DID (DUBLA IMUNODIFUZIE)

 IDR (IMUNODIFUZIA RADIARA SIMPLA)
DID- dubla imunodifuzie

 Tehnica de screening calitativa (identificare Ag/Ac),

sensibila

 Identifica fie Ag, fie Ac

 Are nevoie de un sistem martor

DID- dubla imunodifuzie

 Pentru identificarea Ag avem o placa

de agar, care are un godeu central si
mai multe godeuri periferice

 In godeul central se pune Ac

corespunzator Ag pe care vreau sa il
identific, iar intr-unul dintre
godeurile periferice se pune Ag de
control pe care il cunosc.
DID- dubla imunodifuzie

 Intre Ag si Ac are loc o difuziune cu formarea arcului de

precipitare acolo unde se intalnesc (acesta este sistemul
martor, unde am si Ag si Ac cunoscuti).
 In celelalte godeuri periferice se pune produsul biologic
(ser, sputa, urina, LCR, lichid pleural etc.) in care vrem sa
identificam prezenta Ag
 In dreptul godeului unde apare arcul de precipitare
IDENTIC cu cel al sistemului martor atunci inseamna ca
avem Ag respectiv
DID- dubla imunodifuzie

 Aceasta tehnica are nevoie de o tehnica specifica, pentru

confirmare → imunodifuzia radiara simpla (IDR) =

tehnica cantitativa, specifica (pentru a putea vedea cat Ag

avem)
IDR- Imunodifuzia radiara simpla
 Intr-o placa de agar se intinde Ac corespondent uniform, difuz
 In godeurile periferice se pune produsul biologic in care anterior
am identifIcat ca exista Ag (transferam doar produsul biologic in
care Ag a iesit pozitiv la DID)
 Ag difuzeaza catre Ac care e incorporat in placa si formeaza un
cerc de precipitare (nu mai face un arc pentru ca difuzia e in placa,
nu intre cele doua) mai mic sau mai mare in functie de cantitatea
de Ag prezenta in godeu
 Se masoara diametrul sau raza cercului si exista o scala (in functie
de cati mm, atata cantitate de Ag avem)
Exemplu

 Pentru determinarea Ag HBs:

1. Incepem cu DID si vrem sa determinam Ag; in periferie avem Ac anti HBs, se

formeaza arc de precipitare

2. Punem ser (produsul biologic) si vedem daca se formeaza arc de precipitare,

atunci exista Ag HBs si continuam cu IDR

3. In placa Ac antiHBs masuram diametrul cercului, ca sa vedem ce cantitate avem

2. Reactii de aglutinare
 TEHNICA LATEX
CALITATIVA – PE LAMA
CANTITATIVA – IN TUBURI
 TESTUL COOMBS
DIRECT
INDIRECT
Tehnica LATEX

 Este o tehnica sensibila

 Se foloseste in screening
 Particulele de latex nu sunt vizibile cu ochiul liber
si devin vizibile doar prin aglutinare
 Se foloseste fie pentru detectia Ag, fie a Ac
Tehnica LATEX

 Daca vrem sa determinam Ac (el e solubil), pe

particulele de latex vom avea Ag corespunzator
fixat

 Daca vrem sa determinam Ag, particula va fi

invelita cu Ac
Tehnica LATEX

 Calitativa- pe lama

Reactie de aglutinare prezenta sau absenta (se prduce

sau nu aglutinare)
 Tenhnica LATEX
 Cantitativa- in tuburi

o Se fac dilutii progresive din produsul biologic de testat (in primul tub
adaugam produsul biologic nediluat, in al doilea jumatate, in al treilea un
sfert etc.)
o Ultima dilutie care a determinat aglutinare este titrul substantei
respective
o Este cea mai folosita tehnica in diagnosticul bacteriologic rapid prin
detectarea Ag bacteriene/Ac antibacterieni in diverse produse biologice
Exemplu
 Tehnica Latex la un pacient cu pneumonie

In sputa presupunem ca avem Ag bacterian

Sticlutele cu latex au pe suprafata Ac antipneumococ, Ac antistreptococ, Ac antihaemophylus

Avem 3 lame: pe una latex invelit cu Ac antipneumococ, pe a doua latex invelit cu Ac

antistreptococ; unde apare aglutinarea inseamna ca avem diagnostic rapid intr-un minut al

infectiei bacteriene

Confirmarea se face prin antibiograma

Exemplu

 Pacient cu infectie urinara.

Trebuie sa incepem tratamentul antibiotic si nu stim ce bacterie e
prezenta (pana primim rezultatul uroculturii- cateva zile)
Avem 3 lame: pe una latex invelit cu Ac antihaemophilus, pe a 2-a Ac
antiE.Coli, pe a 3-a Ac antiKlebsiella
Punem urina peste fiecare lama (contine Ag bacterian) si unde apare
aglutinare pe lama, avem bacteria respectiva
Confirmarea se face prin cultura cu antibiograma
Testul COOMBS

 Se foloseste in detectia Ac antieritrocitari care distrug hematiile in

anemiile hemolitice autoimune
 Se foloseste ser antigamaglobulina umana

Testul Coombs direct: identifica Ac fixati pe suprafata

hematiilor

Testul Coombs indirect: determina Ac circulanti in serul

pacientului
Testul Coombs direct

 Se recolteaza sangele pacientului pe anticoagulant, urmat de centrifugare cu

separarea hematiilor
 Hematiile (presupunem) au pe suprafata Ac antieritrocitari
 Hematiile se pun in contact cu ser antigamaglobulina umana
 Acest ser se obtine prin administrarea Ig umane la alte specii (iepure) ; aceste
specii le recunosc ca non-self si produc Ac impotriva Ac umani
 Serul poate fi polispecific (recunoaste toate cele 5 clase de Ig umane) sau
monospecific (impotriva unei singure clase: anti IgM, anti IgG etc)
Testul Coombs direct

 Peste
hematiile pacientului se adauga serul antigamaglobulina
umana

 Daca pe suprafata hematiilor exista Ac fixati, serul

antigamaglobulina umana va determina aglutinarea hematiilor

Test Coombs pozitiv

Testul Coombs direct

 Daca este pozitiv, pentru detectarea tipului de Ac, hematiile se vor pune in contact
cu ser antigamaglobulina umana monospecific (anti IgG, anti IgM,
anticomplement)

 Daca pe suprafata hematiilor nu sunt fixati Ac, hematiile vor cadea la fundul
tubului

Test Coombs negativ

Testul Coombs direct

Se efectueaza:
 La cald (37 C)
 La temperatura camerei
 La rece (4 C)

Amplitudinea termica este temperatura la care Ac antieritrocitari

distrug hematia
Testul Coombs direct

Amplitudinea termica are consecinte clinice:

• daca avem Ac la cald, hemoliza e continua (cronica)
pentru ca e temperatura corpului

• daca avem Ac la rece, hemoliza apare numai la

expunerea la frig
Obs. Daca avem Ac la rece, primul pas in tratament pentru pacient
este sa il punem la cald, se opreste hemoliza (ca masura terapeutica
ii spunem sa evite expunerea la frig)
Testul Coombs direct
 Determinarea amplitudinii termice se face lucrand in triplicat
(impart hematiile pacientului in 3 eprubete): intr-o prima
eprubeta incubarea cu ser antigamaglobulina umana se face la
temperatura camerei (22°C), in a doua eprubeta incubarea se
face la frigider (4°C) si a treia se pune la incubator (37°C).

acolo unde apare aglutinarea (la amplitudina termica

respectiva) Ac antieritrocitari distrug hematiile la temperatura
respectiva
Testul Coombs direct

Testul Coombs direct are 4 etape:

1. Ser polispecific
2. Ser monospecific
3. Titru prin dilutii progresive

4. Amplitudine termica
Testul Coombs indirect

 Determina Ac circulanti in serul pacientului

 Se recolteaza sange fara anticoagulant, se separa serul
 Serul separat se pune in contact cu hematii test de la un individ
sanatos, izogrup, izoRh (ca sa nu avem aglutinare din alte cauze)
 Daca exista Ac anti-eritrocitari in serul pacientului, acestia se
fixeaza pe hematiile test
 Apoi se adauga ser antigamaglobulina umana polispecific si se
continua cu etapele testului Coombs direct
Testul Coombs
II. Reactii serologice complexe

 Pentru vizualizarea reactiei, este nevoie de un MARKER:

 Substanta fluorescenta- IMUNOFLUORESCENTA
 Substanta radioactive- RIA
 Enzima- EIA
 Luciferina- CHEMILUMINISCENTA
1. Tehnici de imunofluorescenta si
imunohistochimie
Fluorescenta

Este emisa de substante fluorocrome.

Fluoresceina- fluorescenta verde
Rodamina- fluorescenta rosie
 Cum se vedem fluorescenta?
Fluorescenta se vede la un microscop special care are lampa cu UV si
camp intunecat
Fluorescenta e calitativa (prezent/absent), nu se poate masura, dar e
foarte specifica, cu foarte putine rezultate fals-pozitive
Imunofluorescenta

 Directa: pentru detectia Ag

 Indirecta: pentru detectia Ac

Imunofluorescenta directa (IFD)
 Produsul biologic in care vrem sa identificam Ag se fixeaza pe lama sub forma unui frotiu
(nu stim daca avem Ag respectiv)
 Peste lama se adauga Ac corespondent Ag marcat fluorescent (conjugat cu fluorocrom)
 Se incubeaza (se lasa sa se lege Ag-Ac)
 Urmeaza cea mai importanta etapa a acestei reactii: se spala lama foarte bine de cateva ori
astfel incat sa ramana numai Ac fixat pe Ag
 Daca nu spalam vedem fluorescenta obligatorie, daca spalam vedem doar complexul Ag-
Ac fluorescent
 Ne uitam la microscop, daca vedem fluorescenta, atunci Ag e prezent
Imunofluorescenta directa (IFD)
 Imunofluorescenta directa se foloseste in:
Diagnosticul bacteriologic, acolo unde nu putem face
antibiograma (nu creste bacteria respectiva) ex: Mycoplasma,
Chlamydia

Diagnosticul oncologic pentru evidentierea Ag tumorale pe care

le putem identifica in produsul biologic lichid (facem frotiu) sau
in biopsie de tesut
Imunofluorescenta directa (IFD)

 Cand folosim biopsia de tesut, imunofluorescenta directa poarta

numele de Imunohistochimie
 Pe lama avem sectiunea de tesut, vizualizam prezenta Ag si
distributia lor tisulara (deasupra sau sub membrana bazala, in jurul
vaselor, fibrelor musculare)
 Nu exista diagnostic oncologic fara imunohistochimie
 Important pentru examenul extemporaneu- rezectia tumorii
(maligna/benigna)
Imunofluorescenta indirecta (IFI)

 Identifica Ac prin Tehnica Sandwich

1. Se pune pe lama Ag cunoscut (sub forma de frotiu)

2. Se adauga apoi produsul biologic in care vreau sa vad daca exista

sau nu Ac

3. Lasam sa incubeze (daca exista, Ac se leaga de Ag de pe lama)

Imunofluorescenta indirecta (IFI)

4. Spalarea excesului

5. Adaugam ser antigamaglobulina umana care este marcat fluorescent

Ac e prins intre Ag cunoscut si serul antiglobulina umana

6. Daca exista Ac si s-au fixat pe lama in etapa precendenta, se fixeaza

si serul antigamaglobulina umana si vom avea fluorescenta
ANA immunofluorescence patterns recognized by the EUROPattern Suite. Patterns of positive ANA IIF samples
that can be identified by the EUROPattern Suite software include (a) homogeneous, (b) speckled, (c) nuclear
dots, (d) nucleolar and (e) centromeres. Additionally, the following patterns of related antibodies can be
recognized: (f) nuclear membranes and (g) cytoplasmic. Finally, negative and unspecific results (h) are
recognized and selected in a different tab. ANA: antinuclear antibodies; IIF: indirect immunofluorescence.