LP 1 Metode de determinare ale hormonilor / 3 ore

Metode de determinare a markerilor imunologici

Multitudinea de markeri endocrini, tumorali, infeciosi, cardiaci, osoi, alergologici i

de autoimunitate efectuai in laboratoarele clinice se determin prin metode automate
care au la baz reacia antigen-anticorp (Ag-Ac), metode denumite imunochimice
(echivalentul termenului immunoassay din literatura engleza de specialitate).

Testele imune au devenit larg utilizate ca metode analitice.

Testele imunochimice pot fi utilizate fie pentru determinarea antigenelor (Ag), fie a
anticorpilor (Ac).

Sensibilitatea testelor imunologice a crescut prin dezvoltarea unor noi tipuri de

sisteme de detecie a semnalului i tehnologiei cu faz solid, astfel inct ele pot
detecta concentraii <0.1 pg/ml de Ag prezent in snge. Ele pot fi aplicate pentru
detecia de molecule mici (haptene), dar i a unor complexe proteice
macromoleculare, ca i pentru identificarea Ac fa de alergeni, ageni infeciosi sau
Ag autologe.

Principala caracteristic a testelor imunochimice const in marcarea Ag sau Ac cu o

substan care genereaz un semnal ce poate fi msurat, facilitnd astfel detecia
complexului Ag-Ac.

In funcie de tipul acestei substane testele imunochimice sunt clasificate astfel:

- teste radioimunologice (RIA): utilizeaza marcarea cu radioizotopi (125I, 131I, 3H,

14
C, 32P);
- teste imunoenzimatice (EIA): utilizeaza marcarea cu enzime;
- teste imunochimice cu detecie prin fluorescen (FIA): utilizeaz marcarea cu
molecule fluorescente (fluorocromi);
- teste imunochimice cu detecie prin chemiluminiscen (CLIA): utilizeaz
pentru marcare molecule care genereaz lumin prin reacii chimice
(chemiluminiscen), cum ar fi derivai de luminol, esteri acridinici, derivai de
oxalat de nitrofenil. O variant a acestora o constituie testele imunochimice cu
detecie prin electrochemiluminiscen (ECLIA) care utilizeaz pentru marcare
anumii compui organici (complexe de ruteniu, osmiu, etc.) care genereaz lumin
electrochimic.
Teste imunoenzimatice

Acest tip de teste utilizeaz marcarea cu enzime, care reprezint alternativa pentru
radioizotopi. Cele mai folosite sunt testele ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay), EIA si EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique).

TEHNICA ELISA

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay reprezint la ora actuala una din cele
mai des folosite metode de identificare i apreciere cantitativ pentru anticorpi,
antigene, hormoni si o palet larg de alte molecule, inclusiv peptide sintetice.

Tehnica Elisa a fost inventat de un grup de cercettori suedezi de la Universitatea

din Stockholm condus de Peter Perlmann si Eva Engval, acetia publicnd primul
articol despre tehnica Elisa in 1971. Aceast metod prezint avantaje economice dar
mai ales avantaje legate de sigurana pacientului, in contrast cu metodele radioimune.
In acest fel, tehnica imunoenzimatic ELISA a devenit o metod indispensabil in
laboratoarele clinice, dar i in cercetarea n domeniul biologiei i a biotehnologiei.

Testele ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) reprezint o metod

sensibil deoarece fiecare molecul de enzim poate converti multe molecule de
substrat servind ca amplificator al reaciei. Enzimele dau n reacie produi colorai
care precipit, astfel inct nu difuzeaz de la locul de formare.

In cele mai multe laboratoare testele ELISA sunt automatizate i sunt utilizate pentru
determinarea de testosteron liber, 17-OH progesteron, Ac anti-LKM1, Ac
anticardiolipinici IgG, Ac antispermatozoizi, serologie paraziti, etc.

Principiul metodei

Testul ELISA este o metod de detectare a unor molecule (proteine, carbohidrai,

etc.) cu ajutorul complexelor antigen-anticorp conjugate cu o enzim. Cele mai
utilizate enzime n tehnica ELISA sunt peroxidaza, fosfataza alcalin, glucozoxidaza,
glucozo-6-fosfat dehidrogenaza.

n tehnica ELISA, Ac primar este legat la o suprafa solid, apoi Ac primar se leag
de Ag (proba), iar Ac secundar marcat cu o enzim se leag de complexul Ac primar-
Ag formnd un nou complex Ac primar Ag Ac secundar legat de enzim; se
adaug substratul cromogen i enzima convertete substratul cromogen intr-un produs
colorat a crei intensitate a coloraiei este proporional cu cantitatea de Ag din serul
pacientului. Intensitatea coloraiei obinute se determin spectrofotometric la o
lungime de und caracteristic.
Probe biologice

- Ser
- Plasm
- Urin
- Scaun
- Lichid sinovial
- LCR
- Lichid de lavaj bronic

PLACA PENTRU ELISA

96 godeuri
Plastic pe care adera usor proteinele

ELISA

Exprimarea rezultatelor
APLICAII

- Hormoni
- Markeri tumorali
- Droguri, medicamente
- Citokine
- Ag virale (HIV), bacteriene,
parazitare
- Ac (HIV)

Test de sarcin
TIPURI DE ELISA

- ELISA necompetitiva sandwich

- ELISA competitiva
- ELISA indirecta (dozarea Ac)

Metoda ELISA de tip sandwich

- Ag trebuie s prezinte 2 epitopi (identici sau diferii)

- Ac primar (Ac1):
Imobilizat in faza solid in godeurile plcii
Nemarcat enzimatic
- Ac secundar (Ac2):
Marcat enzimatic

Ac1 Ag Ac2 Ac1-Ag-Ac2

Mod de lucru

1. Se pipeteaz proba (cu Ag) in godeurile cu Ac1 fixat

2. Se incubeaz complexe Ag-Ac1
3. Se spal excesul de Ag (Ag liber)
4. Se pipeteaz Ac2 (marcat enzimatic)
 5. Se incubeaz complexe Ac1-Ag-Ac2
6. Se spal excesul de Ac2 (Ac2 liber)
7. Se adaug substratul colorarea mediului de reacie ~ cantitatea de Ag din
prob
8. Se citete la spectrofotometru

Metoda ELISA de tip competitiv

- Ac primar (Ac1):
Specific pentru Ag de determinat
Nemarcat enzimatic
- Ac secundar (Ac2):
Specific pentru Fc (regiune cristalizabil de pe Ac) al Ac1
Marcat enzimatic

Mod de lucru

1. Se amestec proba (cu Ag) cu o cantitate cunoscut de Ac1, in soluie

2. Se pipeteaz amestecul in godeurile cu Ag fixat
3. Dou situaii:
Exces de Ag
Exces de Ac1

Exces de Ag:
Soluie (cu Ag) + Ac1 Ag-Ac1 + Ag libere
Se pipeteaz amestecul in godeuri (cu Ag fixat) nu se formeaz
complexe Ag-Ac1 fixe
Se spal Ag-Ac1 libere i Ag libere
Se pipeteaz Ac2 in godeuri nu se formeaz complexe Ag - Ac1 - Ac2
fixe
Se spal Ac2 liber (tot Ac2, de fapt)
Se adaug substratul nu apare nicio reacie incolor
 Exces de Ac1 :
Soluie (cu Ag) + Ac1 Ag-Ac1 + Ac1 liberi
Se pipeteaz amestecul in godeuri (cu Ag fixat) complexe Ag-Ac1
fixe
Se spal Ag-Ac1 libere
Se pipeteaz Ac2 in godeuri complexe Ag-Ac1-Ac2 fixe
Se spal Ac2 liber
Se adaug substratul colorarea mediului de reacie intro manier
invers proporional cu cantitatea de Ag din prob
Se citete la spectrofotometru

Metoda ELISA indirect

- Dozarea Ac
- Ag fixat in godeuri, specific Ac de determinat
- Ac primar (Ac1):
=Ac de determinat
Nemarcat enzimatic
- Ac secundar (Ac2):
Specific pentru Fc al Ac1
Marcat enzimatic

Mod de lucru

1. Se pipeteaz proba (cu Ac1) in godeurile cu Ag fixat

2. Se incubeaz complexe Ag-Ac1 fixe
3. Se spal Ac1 liber
4. Se pipeteaz Ac2
5. Se incubeaz complexe Ag-Ac1-Ac2 fixe
6. Se spal Ac2 liber
7. Se adaug substratul colorarea mediului de reacie ~ cantitatea de Ac1 din
prob
8. Se citete la spectrofotometru