TEHNICA

IMUNOENZIMATICA
CE ESTE TEHNICA
IMUNOENZIMATICA?
ELISA=Enzyme-linked Immunosorbent
Assay
Metoda de detectare a unor molecule
(proteine, carbohidrati, etc.) cu ajutorul
complexelor antigen-anticorp conjugate cu o
enzima
Foarte sensibila (pg/ml)
Cantitativa sau calitativa
Utilizeaza anticorpi monoclonali si enzime



PRODUCEREA ANTICORPILOR
MONOCLONALI
Plasmocite
producatoare de Ac
Antigen
Fuzionarea
celulelor
HIBRIDOM
Mielom
Anticorpii monoclonali
sunt purificati
Clonele
dorite se
cultiva sau
se
congeleaza
Testarea clonelor
Hibridoamele se separa
si se cultiva
Cultivarea
hibridoamelor
Mentinerea
hibridoamelor in
soareci
ENZIMELE
Enzime=catalizatori biochimici, compusi care
maresc viteza reactiilor chimice ce se
desfasoara in sistemele biologice, fara sa se
consume in cursul lor
Intensitatea reactiei ~ cantitatea de enzima
Enzime utilizate:
Peroxidaza
Fosfataza alcalina
Glucozoxidaza
G6PH
ENZIMELE
Substraturi: substante cromogene, care
formeaza produsi de reactie colorati
(cromofore)
Enzima + substrat cromofor citire la
spectrofotometru
PROBE BIOLOGICE
Ser
Plasma
Urina
Scaun
Lichid sinovial
LCR
Lichid de lavaj bronsic
PLACA PENTRU ELISA
96 godeuri
Plastic pe care adera usor proteinele
TIPURI DE ELISA
ELISA necompetitiva sandwich

ELISA competititiva

ELISA indirecta (dozarea Ac)

ELISA SANDWICH
Ag trebuie sa prezinte 2 epitopi (identici sau
diferiti)
Ac primar (Ac
1
):
Imobilizat in faza solida in godeurile placii
Nemarcat enzimatic
Ac secundar (Ac
2
):
Marcat enzimatic

ELISA SANDWICH
1. Se pipeteaza proba (cu Ag) in godeurile cu
Ac
1
fixat
2. Se incubeaza complexe Ag-Ac
1
3. Se spala excesul de Ag (Ag liber)
4. Se pipeteaza Ac
2
(marcat enzimatic)
5. Se incubeaza complexe Ac
1
-Ag-Ac
2
6. Se spala excesul de Ac
2
(Ac
2
liber)
7. Se adauga substratul colorarea mediului
de reactie ~ cantitatea de Ag din proba
8. Se citeste la spectrofotometru

ELISA SANDWICH
ELISA COMPETITIVA
Ac primar (Ac
1
):
Specific pentru Ag de determinat
Nemarcat enzimatic
Ac secundar (Ac
2
):
Specific pentru Fc al Ac
1
Marcat enzimatic
ELISA COMPETITIVA
1. Se amesteca proba (cu Ag) cu o cantitate
cunoscuta de Ac
1
, in solutie
2. Se pipeteaza amestecul in godeurile cu Ag
fixat
3. 2 situatii:
Exces de Ag
Exces de Ac
1

ELISA COMPETITIVA
Exces de Ag:
Solutie (cu Ag) + Ac
1
Ag-Ac
1
+ Ag libere
Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)
nu se formeaza complexe Ag-Ac
1
fixe
Se spala Ag-Ac
1
libere si Ag libere
Se pipeteaza Ac
2
in godeuri nu se formeaza
complexe Ag-Ac
1
- Ac
2
fixe
Se spala Ac
2
liber (tot Ac
2
, de fapt)
Se adauga substratul nu apare nicio reactie
incolor
ELISA COMPETITIVA
Exces de Ac
1
:
Solutie (cu Ag) + Ac
1
Ag-Ac
1
+ Ac
1
liberi
Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat)
complexe Ag-Ac
1
fixe
Se spala Ag-Ac
1
libere
Se pipeteaza Ac
2
in godeuri complexe Ag-
Ac
1
-Ac
2
fixe
Se spala Ac
2
liber
Se adauga substratul colorarea mediului de
reactie i.p. cantitatea de Ag din proba
Se citeste la spectrofotometru

ELISA COMPETITIVA
ELISA INDIRECTA
Dozarea Ac
Ag fixat in godeuri, specific Ac de determinat
Ac primar (Ac
1
):
=Ac de determinat
Nemarcat enzimatic
Ac secundar (Ac
2
):
Specific pentru Fc al Ac
1

Marcat enzimatic

ELISA INDIRECTA
Se pipeteaza proba (cu Ac
1
) in godeurile cu
Ag fixat
Se incubeaza complexe Ag-Ac
1
fixe
Se spala Ac
1
liber
Se pipeteaza Ac
2

Se incubeaza complexe Ag-Ac
1
-Ac
2
fixe
Se spala Ac
2
liber
Se adauga substratul colorarea mediului
de reactie ~ cantitatea de Ac
1
din proba
Se citeste la spectrofotometru


ELISA INDIRECTA
ELISA
AVANTAJE
Sensibila
Reproductibila
Cantitati mici de reactivi (ieftina)
Determina si Ag, si Ac
Automata (rapida)
Noniradianta
APLICATII
Hormoni
Markeri tumorali
Droguri, medicamente
Citokine
Ag virale (HIV!), bacteriene, parazitare
Ac (HIV!)
TEST HIV
TEST DE SARCINA