Tehnica imunoenzimatica ELISA

PRINCIPIU

Metoda ELISA presupune adsorbtia unuia dintre componentii imuni Ag sau Ac pe un suport solid.
Imunoadsorbtia permite fixarea ulterioara a reactantilor din faza lichida, care urmeaza sa fie identificati
( tehnici calitative ) sau dozati ( tehnici cantitative).

Etapa finala este o reactie enzimatica, relevata printr-o modificare de culoare. Citirea se face
spectrofotometric, iare interpretarea se face in functie de valoarea adsorbantei (intensitatea culorii),
martorii +, - si valoarea de prag.

METODE

a) metoda ELISA INDIRECTA

b) metoda ELISA COMPETITIVA

c) metoda ELISA de tip sandwich

Exemple:

DOZAREA ANTICORPILOR

a) Metoda ELISA INDIRECTA timpi:

Imobilizarea pe suportul solid a antigenelor specifice anticorpilor de dozat

Aditia probei de ser.

Incubare. Anticorpii care recunosc antigenele se fixeaza de acestia si raman atasati

3-5 spalari succesive, pentru a indeparta Ac nefixati (necorespunzatori Ag)

adaugarea conjugatului: Ac anti-imunoglobuline umane cuplati cu o enzima (peroxidaza)

incubare

3-5 spalari succesive

adaugarea substratului enzimei

incubare. Probele pozitive se coloreaza, intensitatea reactiei fiind direct proportionala cu cantitatea
de ac din proba de ser

stoparea reactiei si citirea

b) Metoda ELISA COMPETITIVA

Faza solida este identica

Proba de ser nediluata se adauga concomitent cu conjugatul

Prezenta anticorpilor in proba blocheaza fixarea conjugatului.

Adaugarea substratului enzimatic si reactia de culoare.

Interpretare: intensitatea culorii este invers proportionala cu cantitatea de anticorpi din proba.
c) Metoda ELISA de tip sandwich

Se bazeaza pe faptul ca Ac sunt del putin bivalenti

La faza solida se adsorb antigenele, de care se vor lega Ac din proba. Conjugatul Ac-enzima , ocupa
valentele libere ale Ac din proba ( Ac de dozat intre 2 straturi de Ag)

ELISA

Tehnica Imunoenzimatica ELISA in microplaca

Principiul Testului

Stripurile din microplaca din polistiren captusite cu antigeni purificati si caractererizati

biochimic,sunt utilizate drept faza solida care contine antigeni legati.

Dac proba este pozitiv, anticorpii specifici din proba de ser diluat se ataseaza la antigenii
cuplati in faza solid

In etapa a doua, anticorpii ataati sunt detectati cu anticorpi anti-umani marca i cu peroxidaz

n a treia etap, anticorpii legai devin vizibili folosind o solu ie cromogen / substrat care este
capabila de a stimula o reacie de culoare. Intensitatea culorii produs este propor ional cu
concentraia de anticorpi din proba de ser

Testul ELISA monospecific (test imunoenzimatic cu un singur antigen) furnizeaz un test

cantitativ in-vitro pentru detectarea anticorpilor. Profile ELISA furnizeaza un test semicantitativ
in-vitro pentru detectarea anticorpilor diferiti pe un singur strip din microplaca.

Faza solid a Pool ELISA este acoperita cu un amestec de antigen pentru detectarea
semicantitativa a anticorpilor a caror specificitate trebuie investigata ulterior prin teste
monospecifice.
Calibrarea/Evaluarea etape ale testarii sigure si economice

In cazul unei metode cantitative ELISA, calibrarea este efectuat in general cu trei seruri de
calibrare:

Serul de calibrare 1: limita superioar a intervalului de msurare

Serul de calibrare 2: limita superioar a intervalului valorilor normale(valoare cut-off)

-Serul de calibrare 3: negativ

Nu este nevoie pentru incubare de valori blank sau determinri duplicat

Metoda semicantitativ ELISA se realizeaza folosind un singur calibrator. Curbele de calibrare

extinse se gasesc in unele metode ELISA pentru determinarea imunit ii sau diagnosticare CSF.

Calibrarea se realizeaz n uniti relative (RU / ml) sau, n cazul n care exist un ser de
referin internaional, n uniti internaionale (UI / ml).

Fiecare test poate fi efectuat n mod opional folosind un ser de control pozitiv sau negativ inclus
n kit-ul de testare. Intervale de referin specifice ale kit-ului sunt prevzute pentru fiecare
calibrator si ser de control

Toate metodele de calibrare pot fi de obicei efectuate cu usurinta cu ajutorul software-ul ELISA