Tehnica imunoenzimatica ELISA

PRINCIPIU

            Metoda ELISA  presupune adsorbtia unuia dintre componentii imuni Ag sau Ac pe un suport solid.
Imunoadsorbtia permite fixarea ulterioara a reactantilor din faza lichida, care urmeaza sa fie identificati
( tehnici calitative ) sau dozati ( tehnici cantitative).

            Etapa finala este o reactie enzimatica, relevata printr-o modificare de culoare. Citirea se face
spectrofotometric, iare interpretarea se face in functie de valoarea adsorbantei (intensitatea culorii),
martorii +, - si valoarea de prag.

METODE

a)                         metoda ELISA INDIRECTA

b)                        metoda ELISA COMPETITIVA

c)                         metoda ELISA de tip sandwich

Exemple:

DOZAREA ANTICORPILOR

a)                  Metoda ELISA INDIRECTA – timpi:

§                           Imobilizarea pe suportul solid a antigenelor specifice anticorpilor de dozat

§                           Aditia probei de ser.

§       Incubare. Anticorpii care recunosc antigenele se fixeaza de acestia si raman atasati

§       3-5 spalari succesive, pentru a indeparta Ac nefixati (necorespunzatori Ag)

§       adaugarea conjugatului: Ac anti-imunoglobuline umane cuplati cu o enzima (peroxidaza)

§       incubare

§       3-5 spalari succesive

§       adaugarea substratului enzimei

§       incubare. Probele pozitive se coloreaza, intensitatea reactiei fiind direct proportionala cu cantitatea
de ac din proba de ser

§       stoparea reactiei si citirea

b)         Metoda ELISA COMPETITIVA

§       Faza solida este identica

§       Proba de ser nediluata se adauga concomitent cu conjugatul

§       Prezenta anticorpilor in proba blocheaza fixarea conjugatului.

§       Adaugarea substratului enzimatic si reactia de culoare.

§       Interpretare: intensitatea culorii este invers proportionala cu cantitatea de anticorpi din proba.
c) Metoda ELISA  de tip sandwich

Se bazeaza pe faptul ca Ac sunt del putin bivalenti

La faza solida se adsorb antigenele, de care se vor lega Ac din proba. Conjugatul – Ac-enzima , ocupa
valentele libere ale Ac din proba ( Ac de dozat intre 2 straturi de Ag)

ELISA

Tehnica Imunoenzimatica ELISA in microplaca

Principiul Testului

  Stripurile din microplaca din polistiren captusite cu antigeni purificati si caractererizati

biochimic,sunt utilizate drept faza solida care contine antigeni legati.

Dacă proba este pozitivă, anticorpii specifici din proba de ser diluat se ataseaza la antigenii
cuplati in faza solidă

In etapa a doua, anticorpii atașati sunt detectati cu anticorpi anti-umani marcați cu peroxidază

În a treia etapă, anticorpii legați devin vizibili folosind o soluție cromogen / substrat care este
capabila de a stimula o reacție de culoare. Intensitatea culorii produsă este proporțională cu
concentrația de anticorpi din proba de ser

Testul ELISA monospecific (test imunoenzimatic cu un singur antigen) furnizează un test

cantitativ in-vitro pentru detectarea anticorpilor. “Profile ELISA” furnizeaza un test semicantitativ
in-vitro pentru detectarea anticorpilor diferiti pe un singur strip din microplaca.

Faza solidă a “Pool ELISA” este acoperita cu un amestec de antigen pentru detectarea
semicantitativa a anticorpilor a caror specificitate trebuie investigata ulterior prin teste
monospecifice.

Calibrarea/Evaluarea – etape ale testarii sigure si economice

In cazul unei metode cantitative ELISA, calibrarea este efectuată in general cu trei seruri de
calibrare:

   –Serul de calibrare 1: limita superioară a intervalului de măsurare

–Serul de calibrare 2: limita superioară a intervalului valorilor normale(valoare cut-off)

   -Serul de calibrare 3: negativ

Nu este nevoie pentru incubare de valori blank sau determinări duplicat

Metoda semicantitativă ELISA se realizeaza folosind un singur calibrator. Curbele de calibrare

extinse se gasesc in unele metode ELISA pentru determinarea imunității sau diagnosticare CSF.
Calibrarea se realizează în unități relative (RU / ml) sau, în cazul în care există un ser de
referință internațional, în unități internaționale (UI / ml).

Fiecare test poate fi efectuat în mod opțional folosind un ser de control pozitiv sau negativ inclus
în kit-ul de testare. Intervale de referință specifice ale kit-ului sunt prevăzute pentru fiecare
calibrator si ser de control

Toate metodele de calibrare pot fi de obicei efectuate cu usurinta cu ajutorul software-ul ELISA