Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Bacteriile lactice sunt un grup mare de microorganisme microaerofile, Gram pozitive, al caror
metabolit final principal este acidul lactic. Grupul BL inculde peste 15 genuri bacteriene dintre care cele
mai cunoscute sunt: Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, si
Streptococcus. In ultimii ani datorita dezvoltarii tehnicilor de biologie moleculara au fost incluse noi
genuri bacteriene in grupul BL printre care: Fructobacillus, Carnobacterium.
Pe langa faptul ca suntem in contact cu acest grup de microorganisme inca de la nastere, bacteriile
lactice fiind primele care colonizeaza tractul digestiv al nou nascutilor in conditii normale, totusi ele sunt
in special cunoscute datorita importantei biotehnologice pe care o prezinta.
Diversitatea bacteriilor lactice este direct corelata si cu diversitatea surselor de izolare acestea fiind
prezente in tractul digestiv animal si uman, in tractul urogenital, in produsele lactate si pe baza de carne,
pe suprafata plantelor.
Materialul genetic al BL
Ca si in cazul celorlalte microorganisme procariote genomul bacteriilor lactice este format din
cromozom si elemente genetice extracromosomale. Cromozomul BL este o moleculă de ADN dublu
catenar, circular închis, suprarăsucit negativ şi împachetat sub formă de nucleoid (Vassu, 2001).
Cu ajutorul tehnicilor de biologie moleculară în ultimii ani dimensiunile cromozomului la diverse
specii de bacterii au fost estimate, ca fiind cuprinse între 1,7-3,4 Mpb.
După cum se constată cromozomul la bacterii lactice prezintă dimensiuni relativ mici, comparativ
cu alte genuri bacteriene (Myxococcus 12Mpb, Escherichia 4,7 Mpb) (Vassu, 2001).
O alta caracteristica a genomului BL este reprezentata de faptul ca % molar GC este scazut
comparativ cu alte bacterii, in general este < 50%, predominante fiind bazele azotate: adenina si timina.
În urma studiilor efectuate (Davidson B.E, 1996, Roissart H. 1994, Renault P., 1996a) s-a constatat
că genele implicate în căile metabolice sunt organizate în clusteri, în contrast cu organizarea randomică
observată la alte bacterii.
O alta caracteristica importanta este faptul ca la nivelul genomului bacteriilor lactice au fost
evidentiate un numar mare de pseudogene, un numar mare de transpozoni procentul fiind cuprins intre
0,2% si 5%, multiple secvente de insertie. Toate aceste caracteristici evidentiate pe baza hartilor genetice
realizate in ultimii ani indica plasticitatea genomului bacteriilor lactice si frecventa ridicata a proceselor
genetice care implica translocatii, deletii, inversii, duplicari, achizitii de gene si recombinare.
Faptul că bacteriile lactice cresc pe medii bogate în elemente nutritive, de- lungul evoluţiei a avut
loc adaptarea acestora prin eliminarea unor căi anabolice şi catabolice, ceea ce explică dimensiunile
reduse ale cromozomului acestora. Exista o stransa legatura intre nisele ecologice si genele conservate la
nivelul genomului BL. Un astfel de exemplu il reprezinta lipsa genelor implicate in metabolismul
zaharurilor la tulpinile de BL din produsele lactate, exceptie genele implicate in metabolismul lactozei.
De exemplu, tulpinile de bacterii lactice nou izolate din ecosisteme mai puţin bogate în compuşi nutritivi
(aer, apă, plante, etc) sunt încă capabile să sintetizeze aminoacizi şi vitamine, caracteristici care tind să se
piardă la tulpinile crescute exclusiv pe lapte. Mutaţiile genetice, recombinările şi deleţiile care apar în
timpul evoluţiei adaptative a bacteriilor lactice la diverse condiţii de mediu pot explica parţial
heterogenitatea genurilor şi caracterele distinctive care pot să apară în cadrul aceleiaşi specii (van Beek
S., 2002, Cai H., 2007, de Vos W. M., 1999).
In acelasi timp insa BL au si capacitatea de a “achzitiona” gene utile in adaptarea conditiilor de
mediu cum ar fi de exemplu sistemul proteolitic care este mult mai dezvoltat decat in cazul altor
microorganisme deoarece, evoluand pe medii complexe bogate in proteine necesita sisteme enzimatice
complexe.
In urma unui studiu comparativ realizat in in 2007 de catre Makarova K.S., a evidentiat faptul ca
bacteriile lactice au eliminat in timp intre 600 si 1200 de gene din genomul “inital” denumit “Bacillus
ancestor” si au achizitionat mai putin de 100.
Din punct de vedere industrial plasticitatea ridicata a genomului bacteriilor lactice este foarte
importanta din punct de vedere biotehnologic. Prezenta unui numar mare de gene cu rol in procesele
proteolitice le permite BL sa scindeze proteine si peptide din lapte conducand la imbunatatirea calitatilor
organoleptice ale produselor lactate..
Marea majoritate a plasmidelor evidenţiate la bacteriile lactice sunt reprezentate de ADNccc dar
există şi plasmide lineare, un exemplu fiind cele două plasmide lineare cu dimensiuni de 150kbp care au
fost descoperite în două tulpini de Lactobacillus gasseri. (Gasson M. J., 1994).
Bacteriocinele
Bacteriocinele compusi de natura proteica care au activitate antimicrobiana fata de un grup
restrans de microorganisme, in special fata de cele inrudite din punct de vedere filogenetics.
Mecanismele de actiune ale bacteriocinelor:
- inhiba lipidele de tip II din membrana celulara si implicit sinteza petidoglicanilor si determina
formarea de pori
- se leagă la receptorul sistemului manoză- fosfotransferază si formeaza porilor
- interfera cu moleculele de ADN, ARN și metabolismul proteinelor
Sunt folosite în special în industria alimentară sau ca agenţi de bio-conservare. Adăugarea lor în
alimente nu prezintă riscuri pentru consumatori, fiind inactivate de enzimele gastrice şi pancreatice.
Pentru a fi utilizate in industria alimentara bacteriocinele ar trebui să îndeplinească următoarele
caracterisitici:
să nu fie toxice pentru organismul uman ;
să fie inactivate de proteazele gastrice pentru a nu induce modificari la nivelul microbiotei
tractului intestinal.
să tolereze temperaturi înalte şi pH redus,
să prezinte un spectru antimicrobian relativ larg,
să exercite efect bactericid în special prin acţiunea asupra membranei plasmatice,
să fie codificate de gene plasmidiale pentru a facilita manipularea genetică;
Biosinteza nisinei
Nisina este o peptidă ce se leagă de membrana extracelulara, cu acţiune antimicrobiană, din clasa
antibioticelor, care se sintetizează sub forma unui precursor inactiv şi devine activă în urma modificarilor
translaţionale, şi cu largă utilizare în industria alimentară.
În urma analizelor s-a constat că în biosinteza acestei bacteriocine este implicat un cluster de 11
gene: nisABTCIPRKFEG (Figura A.15) a căror funcţie este următoarea:
nisA este o gena structurală;
nisBC sunt implicate în procesarea post translaţională
nisT şi nis P sunt implicate în translocaţia şi clivajul precursorului nisină;
nisI şi nis FEG sunt implicate în diferite mecanisme în special în cele de imunitate la nisină;
nisR este implicat în procesele de reglare
nisK codifică pentru un senzor proteic, histidin kinaza NisK.
Au fost identificaţi trei promotori în amonte de nisA, R şi F. Prmotorul genei nisF are o secvenţă
omoloagă cu promotorul genei nisA, fapt care sugerează ca ambii prezintă acelaşi mecanism de control.
La 42 de nucleotide în amonte de codonul start AUG al genei nisA se iniţiază transcrierea unui
ARNm de 260pb. S-a constatat că prin deleţia a 4pb în cadrul genei nisA se anulează transcrierea
acesteia. Restabilirea transcrierii se face atunci când se cultivă tulpina mutantă nisA pe mediu
conţinând nisină sau dacă în această tulpină se transferă o plasmidă conţinând gena nisA integrală.
Nisina Z, o variantă His27Asn naturală a nisinei A şi câteva mutante ale acesteia sunt capabile sa
inducă transcrierea.
Stimularea biosintezei nisinei este realizată şi de către variante modificate ale nisinei, cu rezultate
mult mai bune. Peptide similare ca subtilizina, lacticina 48 şi Pep5, ca şi precursorul nemodificat al
nisinei A nu induc transcrierea. Capacitatea de inducţie şi potenţialul antimicrobian sunt două
caracteristici independente ale moleculelor de nisină.
Inactivarea genei nisK la nivel cromozomal conduce la incapacitatea oricăror mecanisme de
restabilire a transcrierii nisA, atât prin adăugarea nisinei în mediu, cât şi prin introducerea unei plasmide
conţinând gena nisK integrală.
Experimentele au condus la concluzia că produşii genelor nisR şi nisK sunt componente esenţiale
ale biosintezei nisinei şi interacţionează cu aceasta. Amplificarea expresiei acestor doua gene implică
creşterea sensibilităţii la nisină adăugată în mediu şi activarea transcrierii genei nisA.
Studiul unei tulpini conţinând plasmide la nivelul cărora există mai multe copii plasmidiale ale
nisABTCIR a evidenţiat faptul că în urma biosintezei se obţine un precursor al nisinei mofidificat total.
Deleţia promotorului nisA conduce la anularea biosintezei chiar în prezenţa nisinei în mediu. Expresia
genelor nisB şi probabil şi nisTCIP se află sub controlul promotorului nis A. Genele nisRK au proprii
promotori a cărui TSS este localizat la 26 nucleotide în amonte de codonul start al genei nisR. Integrarea
doar a acestor două gene în cromozom determină apariţia de tulpini nisin-inductibile (Kok J., 1996,
Kuipers O. P., 1998).
Exopolizaharidele
Exopolizaharidele (EPS) sunt polizaharide cu lanţ lung produse extracelular, în special de bacterii
şi microalge. Sunt formate din unităţi repetitive de zaharuri sau derivaţi din zahar (glucoză, galactoză,
manoză, N-acetilglucozamină, N-acetil galactozamină şi ramnoză).
Dextranul a fost primul exopolizaharid bacterian descoperit in vin de Pasteur 1861, tulpina
producatoare a fost identificata ulterior ca fiind Leuconostoc mesenteriodes.
EPS nu sunt ataşate permanent la suprafaţa celulei microbiene ca şi polizaharidele capsulare şi au
un rol esenţial în protejarea MO de condiţii nefavorabile cum ar fi deshitratarea, lipsa nutrienţilor,
acţiunea unor compuşi toxici sau şocul osmotic.
În ultimele decenii datorită progeselor realizate în domeniul biologiei și biochimiei au fost
identificate și analizate un număr foarte mare de polizaharide extracelulare bacteriene, ca urmare fiind
studiate foarte mult compoziţia, structura, biosinteza si proprietaţile funcționale ale acestora.
În funcţie de compoziţia lor chimică, exopolizaharidele sunt clasificate în heteropolizaharide
(HePS) şi homopolizaharide (HoPS).
Recent, atenția cercetătorilor dar și a producătorilor s-a îndreptat către tulpini de bacterii lactice
care au capacitatea de a produce exopolizaharide (EPS), datorită contribuţiei lor textura produselor
fermentate din lapte. Cele mai multe bacterii producătoare de EPS aparţin genurilor Streptococcus,
Lactobacillus, Lactococcus. In ultimii ani sunt utilizate in calitate de prebiotice.
Exopolizaharidele biosintetizate de bacterii lactice îmbunatăţesc textura (vâscozitatea şi
elasticitatea), stabilitatea şi gustul produselor lactate fermentate. Aceste proprietăţi fizice şi reologice
depind de anumite caracteristici, cum ar fi compoziţia chimică, marimea moleculară, sarcina, prezenţa
catenelor laterale, rigiditatea moleculelor şi structurile 3D ale polimerilor EPS. Probleme care apar în
timpul fabricaţiei iaurtului, cum ar fi vâscozitatea scazută sau separarea zerului, pot fi uşor rezolvate prin
adăugarea de EPS. Brânza fabricată cu ajutorul EPS devine dulce, cremoasă şi moale, în timp ce brânza
fără EPS devine uscată şi granulată. Exopolizaharidele produse de tulpini din genul Lactobacillus
influenţează favorabil o serie de proprietăţi ale pâinii prin facilitarea absobţiei apei, creşterea volumului
specific de pâine, întârzierea învechirii pâinii şi prelungirea termenului de valabilitate.
Deşi producerea de exopolizaharide (EPS) este rezultatul unei căi de biosinteză şi nu a unei căi
catabolice, ea este strâns legată de reacţiile glicolitice. Succesiunea legării resturilor glucidice este
asigurată de glicozil transferaze, iar toate aceste resturi glucidice ca: UDP-glucoza (uridin difosfst), UDP-
galactoza şi TDP-ramnoza (timidin difosfat) sunt sintetizate pornind de la glucozo 1-fosfat.
Genele implicate în biosinteza heteropolizaharidelor sunt de obicei organizate în clusteri, care pot
fi localizaţi la nivelul cromozomului din bacteriile lactice termofile (de exemplu, S. thermophilus Sfi6 )
sau în plasmidele bacteriilor mezofile (L. lactis ssp. cremoris NIZO B40). În L. lactis, genele organizate
în clusteri au fost studiate prin mutageneză, respectiv prin introducerea unor inserţii. Genele sunt
orientate într-o singură direcţie şi transcrise ca un singur ARNm. Clusterul este format din patru regiuni:
prima conţine gene implicate in formarea proteinelor implicate în reglaj, a doua include gene care
codifică proteine implicate în polimerizare, a treia regiune conţine gene care codifică enzimele necesare
pentru biosinteza unităţilor repetitive de heteropolizaharide, iar ultima este formată din gene care codifică
proteinele implicate în transport şi polimerizare
Foarte multe specii de LAB au randamente scăzute ale producţiei de polizaharide, motiv pentru
care sunt puţin exploatate comercial. Pentru a îmbunătăţii randamentul de producţie au fost optimizate
condiţiile de creştere prin modificarea pH, temperaturii şi surselor de carbon din mediu.
Aplicarea tehnicilor de inginerie genetica la culturile starter a inceput in ani 70, dupa studierea
fenomenului de transfer a plasmidelor de la sp. Lc. lactis. Tehnicile de inginerie genetica sunt folosite pt:
- a intelege rolul unor gene, si modul de reglare al acestora,
- pt eliminarea unor caractere nedorite,
- imbunatatirea expresiei sau conferirea unor noi caractere de cultura MO.
Tehnicile moleculare utilizate sunt : vectori de clonare; sisteme de expresie, thenici de insertie si
knockout.
Vectorii de clonare
La ora actuala exista o gama variata de vectori de conare pentru culturile starter, in special pt tulpnia Lc.
lactis, dar si pt sp ale genurilor Lb. Streptococcus, Enterococus si Leuconostoc. Majoritatea utilizeaza
modelul cercului rotativ pt replicare insa sunt si vectori ce se replica dupa modelul theta. Pt a putea fi
mai usor de introdus pe piata cercetatorii au utilizat ca markeri de selectie gene izolate de la sp
recunoscute ca fiind sigure pt sanatatea umana (rezistenta la cadmiu, nisina, fermetarea melebiozei, gene
lacF, proteine de soc termic). Exemple de vectoi de clonare: pGK12, pNZ18 (Lc., RCR), pAM401 (Ent,
theta). Contin ca si marker de selectie gene de rezistenta de antibiotic: Erm, Kan, Cloranf, Amp,
Sisteme de expresie
Obtinerea de culturi starter care sa confere produselor alimentare trasaturi unice prin cresterea calitatii
organoleptice si nutritionale reprezinta o noua provocare pt oamenii de stiinta. Utilizarea sistemelor de
expresie permit: supraexprimarea unor caractere déjà existente; exprimarea noi enzime, inhibitori,
antigene de suprafata pt imunostimularea tractului digestiv. Cel mai utilizat si cel mai cunoscut sistem
NICE (nisin induced controlled expression), care este dependent de prezenta genelor nisKR pt a permite
traducerea genelor la nivelul celulei gazda. Diverse gene heteroloage au fost exprimate in tulp de
propioibacterium, brevibacterium si bifidobacterium printer care si diversi supresori tumorali.