Curs 3.

Fiziologie bacteriană.
Cultivarea bacteriilor. Metabolismul bacterian. Respiraţia bacteriană

3.1. Constituţia chimică a bacteriilor

3.1.1. Apa: procent, rol
Apa reprezintă peste 75-85% din greutatea umedă a bacteriei. Există apă liberă (mediu de
dispersie) şi apă legată fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puţină apă, în special apă
legată. Bacteriile sunt fiinţe „acvatice” prin excelenţă. Vacuolele sunt formaţiuni sferice care
conţin diferite substanţe în soluţie apoasă. Au o membrană lipoproteică numită tonoplast.
Au fost descrise în special la bacteriile acvatice şi ar putea avea un rol în plutirea acestora.
Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti faptul că apa reprezintă un mediu de dispersie,
este reactiv în reacţiile metabolice, reprezintă etapa finală a unor reacţii oxidative etc.
Prin deshidratare (desicare) este posibilă prezervarea culturilor bacteriene timp
îndelungat. O metodă des utilizată datorită eficienţei sale este liofilizarea (criodesicarea).
Studiile ştiinţifice au arătat că, în general, germenii Gram-negativi rezistă mai puţin timp
liofilizării decât cei Gram-pozitivi, fenomen care a fost pus pe seama stratului mai subţire de
peptidoglican.
3.1.2. Substanţele minerale
Substanţele minerale reprezintă 2-30% din greutatea uscată a bacteriei şi variază în funcţie
de specie, vârsta culturii, compoziţia chimică a mediului. Unele elemente intră în compoziţia
diferitelor structuri (exemplu sulful intră în structura aminoacizilor, fosforul în structura
fosfolipidelor etc).
Dintre rolurile îndeplinite am putea aminti următoarele:
- favorizează schimburile cu mediul,
- participă la reglarea presiunii osmotice,
- pot stimula creşterea şi funcţia bacteriei (de exemplu fierul în cazul bacilului difteric,
care condiţionează şi producerea de toxine),
- activează unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului şi a potenţialului de
oxido-reducere.
Aşa cum am menţionat anterior, la nivel ribozomal se găsesc Mg++ şi K+.
3.1.3. Glucidele
În structura bacteriană se pot găsi glucide simple cu rol în metabolismul intermediar
glucidic, precum şi glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urmă au o serie de
roluri, spre ex. participă la realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor
bacterii etc.
Există teste biochimice în care se urmăreşte utilizarea sau imposibilitatea utilizării unui
anumit zahar de către o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei
respective (în special în cazul enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc).
Testările biochimice sunt de mare utilitate şi în studiul fungilor (auxanogramă, zimogramă).
3.1.4. Proteinele
Există proteine simple (cu rol în metabolismul intermediar protidic) şi proteine complexe,
cum ar fi:
- mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul hialuronic
din structuri de tip capsular),
- cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi),
- nucleoproteinele (ex. în acizii nucleici).
Este de remarcat prezenţa în structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul
diaminopimelic, precum şi a aminoacizilor în forma D (ceea ce reprezintă o adaptare
biochimică a bacteriilor faţă de acţiunea nocivă a enzimelor proteolitice).

1
 3.1.5. Lipidele
Reprezintă mai puţin de 10% din greutatea uscată a bacteriilor şi variază cantitativ în
funcţie de specie, vârsta culturii (cresc în celulele „îmbătrânite”, reprezentând probabil un
semn de degenerescenţă) şi compoziţia mediului. La mycobacterii, sunt în cantitate mai mare
(circa 20-40%), în special la nivel parietal şi determină o serie de proprietăţi specifice,
inclusiv afinitatea tinctorială. Lipidele se pot găsi libere în vacuole, combinate sau făcând
parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membrană, mezozomi).
Dintre lipidele bacteriene putem aminti:
- acizii graşi speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii),
- cerurile (acizi graşi plus alcooli monovalenţi superiori), care se găsesc în cantitate
mare la bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. în peretele mycobacteriilor, nocardiilor
etc). Dintre acestea, ceara D pare a fi implicată în inducerea hipersensibilităţii
întârziate (de tip IV).
- fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema pallidum
(agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor
Gram-negative, cu activitate toxică.
3.1.6. Pigmenţii
Pigmentogeneza este caracteristică bacteriilor cromogene şi este dependentă de condiţiile
de cultivare.
Producerea de pigmenţi poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. în cazul tulpinilor
de Pseudomonas aeruginosa sau în cazul unor specii din genul Staphylococcus). Trebuie să
reţinem încă de la început faptul că în cazul stafilococilor, pigmentogeneza este doar un
caracter orientativ şi nu vom clasifica drept „patogenă” o tulpină de stafilococ în funcţie de
„culoarea” coloniei. Stafilococii sunt condiţionat patogeni. Testul orientativ privind
patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat în mod obligatoriu pentru toate
tulpinile izolate de la pacienţi.
După localizarea pigmentului, bacteriile pot fi:
- cromofore (pigmentul este legat în citoplasmă);
- paracromofore (pigmentul este prezent în perete sau în stratul mucos, de exemplu la
S. aureus sau la Staphylococcus epidermidis);
- cromopare (pigmentul este difuzibil în mediu, de exemplu la Pseudomonas
aeruginosa).
În afară de faptul că datorită producerii de pigmenţi (albastru, galben-verde, maro etc. în
cazul Ps. Aeruginosa sau auriu, citrin, alb în cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul de
laborator se poate orienta în alegerea testelor de identificare într-un anumit context clinic şi
microbiologic.
Putem aminti și faptul că pigmenţii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecţie faţă
de radiaţiile UV (pigmenţi carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborată de
P. aeruginosa faţă de B. anthracis) şi rol enzimatic.
3.1.7. Enzimele
În cazul bacteriilor se poate aprecia că metabolismul este foarte intens. Capacitatea de a
elabora anumite enzime este determinată genetic (există peste 2000 de determinanţi genetici
diferiţi), precum şi prin mecanisme de control care pot modifica bagajul enzimatic în funcţie
de necesităţi.
După locul de acţiune, enzimele bacteriene se pot împărţi în:
- enzime extracelulare (exoenzime), de exemplu hidrolazele;
- enzime ectocelulare (în membrana citoplasmatică, reglând permeabilitatea selectivă),
de exemplu permeazele;
- enzime intracelulare.

2
 În raport cu reacţia catalizată, enzimele pot fi: hidrolaze, transferaze, oxidoreductaze,
liaze, izomeraze etc.
După modul de apariţie, enzimele pot fi:
- constitutive (există totdeauna în celulă, indiferent de natura mediului);
- inductibile (sunt sintetizate de către bacterie numai ca răspuns la anumiţi compuşi
apăruţi în mediu).
Studierea comportamentului enzimatic este foarte utilă în taxonomie. Fiecare unitate
taxonomică bacteriană (gen, specie) are un spectru de activitate enzimatică propriu; studierea
acestuia poate avea o deosebită importanţă în identificarea bacteriilor.
3.1.8. Substanţe cu acţiune antibiotică:
- plasmidul „Col” codifică proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu efect
asupra altor bacterii receptive înrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli);
- unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu,
B. licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizează gramicidina, iar
B. polymyxa sintetizează polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astăzi, din alte genuri).
3.1.9. Vitaminele bacteriene
Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi secretată de
exemplu de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc.; tiamina (B1), care poate fi sintetizată de
E. coli, riboflavina sintetizată de B. subtilis, vitaminele B2 şi B12 sintetizate de
B. megaterium etc. sau vitaminele din grupurile B şi K, care pot fi sintetizate sub influenţa
florei bacteriene intestinale umane.
3.1.10. Factorii de creştere
Factorii de creştere sunt metaboliţii esenţiali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza
substanţelor care se găsesc în mediul extern. Factorii de creştere trebuie neapărat incluşi în
mediul de cultură în cazul în care dorim să izolăm microorganismul respectiv, numit
„microorganism pretenţios” (ex. factorii X şi V trebuie incluşi în mediul de izolare pentru
Haemophilus influenzae).
Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptându-se la viaţa parazitară, devin dependente
de o serie de astfel de factori de creştere (unele sunt atât de dependente încât nu pot fi
cultivate „in vitro”, de exemplu bacilul leprei - Mycobacterium leprae).

3.2. Metabolismul bacterian

3.2.1. Nutriţia bacteriană
Nutriţia bacteriană reprezintă suma proceselor metabolice care conduc la producerea de
materiale convertibile în energie şi în diferite componente celulare. Nutrienţii sunt substanţe
ale căror soluţii pot traversa membrana citoplasmatică pentru a fi antrenaţi în reacţiile
metabolice care asigură creşterea şi multiplicarea celulară.
În raport cu sursa de energie, bacteriile se împart în:
- bacterii care folosesc energie luminoasă şi trăiesc la lumină (photobacterii) şi
- bacterii care îşi procură energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic şi
trăiesc la întuneric (scotobacterii, chimiosintetizante).
În raport cu sursele folosite ca material de sinteză în ambele diviziuni se diferenţiază:
- bacterii autotrofe, capabile să-şi sintetizeze toţi compuşii organici din materie
anorganică şi
- bacterii heterotrofe, dependente de prezenţa unor compuşi organici.

Nutriţia principalelor bacterii studiate

Majoritatea bacteriilor comensale, condiţionat patogene sau patogene importante pentru
om, sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se diferenţiază în funcţie de tipul respirator. Există şi
bacteriile paratrofe, a căror energie trebuie oferită de gazdă. Bacteriile paratrofe sunt parazite

3
strict intracelular (de exemplu microorganismele din genurile Rickettsia şi Chlamydia, care
depind nutriţional de o gazdă vie).
Creşterea microbiană necesită polimerizarea unor substanţe mai simple pentru a forma:
proteine, acizi nucleici, polizaharide şi lipide. Aceste substanţe se obţin fie din mediul de
cultură, fie sunt sintetizate de către celulele în creştere (sunt necesare diferite coenzime şi
legături macroergice de tipul celor din ATP). Substanţele necesare şi coenzimele implicate se
pot obţine dintr-un număr relativ redus de precursori metabolici.
Dacă o celulă bacteriană primeşte substanţele necesare, va sintetiza diferite
macromolecule, iar secvenţa aranjării componentelor în aceste macromolecule este
determinată fie după un model ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru
proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidraţi şi lipide.
După ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansamblează, formând structuri
supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor şi
activitatea căilor metabolice sunt foarte bine reglate (există o permanentă balanţă a
biosintezei).
Microorganismele reprezintă un grup de celule vii care utilizează o mare diversitate de căi
metabolice; de exemplu, mai multe căi diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur
compus simplu, benzoatul, iar o singură cale metabolică pentru benzoat poate fi reglată de
mai multe sisteme de control. Principiul determinant pentru căile metabolice este acela al
organizării unui număr relativ mic de tipuri de reacţii biochimice, într-o ordine specifică.
Multe dintre căile biosintetice se pot deduce având în vedere structura chimică de la care se
porneşte, produsul final şi eventual unul sau doi metaboliţi intermediari. Principiul
determinant al reglării metabolismului este acela că enzimele par a fi „chemate” în joc numai
când activitatea lor este necesară. Activitatea unei enzime poate fi modificată variind fie
cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acţionează.
În unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuată prin cuplarea unor efectori
specifici (metaboliţi care modulează activitatea enzimatică).
De multe ori, activitatea unei enzime care catalizează o etapă metabolică iniţială este
(poate fi) inhibată de produsul final al căii respective. O astfel de inhibiţie nu poate depinde
de competiţia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiţia depinde de
faptul că enzimele reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzimă are atât un situs catalitic de
legare cu substratul, cât şi unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule
reglatoare (numite efectori). Legarea unui efector de situsul său duce la o modificare
conformaţională a enzimei, astfel încât afinitatea situsului catalitic scade (inhibiţie allosterică)
sau creşte (activare allosterică).
Când o bacterie peritriche se mişcă, flagelii se asociază şi se mişcă împreună, rezultând o
deplasare liniară. La diferite intervale de timp, bacteria îşi schimbă direcţia (flagelii „se dau
peste cap”). Acest comportament face posibilă chemotaxia: o celulă care se îndepărtează de
sursa atractantului chimic îşi schimbă sensul de mişcare mult mai frecvent în comparaţie cu
una care se apropie de atractant şi ca o însumare, bacteria se va deplasa înspre atractant.
Spre exemplu, prezenţa unui zahar sau a unui aminoacid este sesizată de receptori specifici
localizaţi pe membrana celulară (de multe ori acelaşi receptor participă şi la transportul
membranar al acelei substanţe). Celula bacteriană este prea mică pentru a fi capabilă să
detecteze existenţa unui gradient chimic (în spaţiu), dar s-a demonstrat experimental că
detectează gradienţii în timp (de exemplu, concentraţia unei substanţe scade în timp ce
bacteria se îndepărtează de sursă şi creşte în timp ce aceasta se apropie de sursă).
Anumiţi compuşi acţionează ca respingători (R), iar alţii ca atractanţi (A). Un mecanism
care ar explica răspunsul celulei faţă de A/R ar implica metilarea şi respectiv demetilarea unei
proteine specifice din membrană, care depinde de GMPc. Atractanţii produc o inhibiţie
tranzitorie a demetilării acestei proteine. Respingătorii stimulează demetilarea.

4
 Mecanismul prin care o modificare în comportamentul celular se produce ca răspuns la o
modificare de mediu poartă numele de transducţie senzorială. Aceasta pare să fie
responsabilă de:
- chemotaxie;
- aerotaxie (deplasarea către concentraţia optimă de O2);
- fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe către lumină);
- deplasarea spre acceptorul de electroni etc.
3.2.2. Respiraţia bacteriană
Respiraţia reprezintă suma reacţiilor biochimice aerobe sau anaerobe producătoare de
energie. Mecanismul de bază este reprezentat de oxido-reducerea biologică (pierderea ionilor
de hidrogen sau a electronilor) de către o substanţă chimică (donor) şi transportul lor pe
molecula unei alte substanţe numită acceptor (prima se oxidează, a doua se reduce:
AH2 + B <=> A + BH2). În funcţie de natura acceptorului final, respiraţia poate fi: aerobă sau
anaerobă.
Respiraţia aerobă (oxibiotică)
În respiraţia aerobă, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraţia
aerobă necesită existenţa membranei celulare. Electronii sunt pasaţi de la un reducător la un
oxidant prin membrană cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reducător
frecvent utilizat este NADPH-ul.
Enzimele catenei respiratorii sunt:
- nicotinice (cu coenzima NAD şi NADP);
- flavinice (cu gruparea proteică FMN sau FAD);
- ferice (grupul prostetic conţine Fe sub formă de derivaţi ai protohemului, spre exemplu
citocromi, citocromoxidază, peroxidază etc).
NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin
mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid).
Pentru sinteza ATP-ului se utilizează fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator)
cuplată cu partea terminală a lanţului respirator.
Respiraţia anaerobă (anoxibiotică)
În respiraţia anaerobă acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substanţă
anorganică diferită de oxigen sau de orice substanţă organică (fermentaţia); fosforilarea se
face la nivelul substratului.
Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezultă prin fermentaţia
zaharidelor şi reprezintă un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere
taxonomic şi biochimic. Etapele fermentaţiei sunt mai reduse, câştigul energetic fiind mai
mic. De exemplu în cazul genului Clostridium, prin fermentaţie acetică se obţine 1 mol ATP,
iar prin fermentaţie butirică se obţin 0,5 moli ATP. Fermentaţia butirică a fost descoperită de
Louis Pasteur în anul 1861 (produsă de Vibrion butyrique, numit ulterior Clostridium
butyricum). Rolul biologic al fermentaţiei este reprezentat de producerea energiei şi nu de
obţinerea unor produşi finali.
Sinteza ATP-ului
Sinteza ATP-ului se realizează prin cuplarea reacţiilor de oxidoreducere cu reacţiile de
fosforilare.
În respiraţia aerobă se utilizează mai ales fosforilarea oxidativă (la nivel de catalizator)
cuplată cu partea terminală a lanţului respirator.
În respiraţia anaerobă fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii şi acceptorii
fiind metaboliţi anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaţia).
Energetica respiraţiei bacteriene
Prin fosforilarea oxidativă se pot obţine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.
Prin fosforilarea substratului se pot obţine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoză.

5
 Energia este folosită apoi în procese metabolice de asimilaţie.
Tipul respirator
În raport cu utilizarea proceselor pentru obţinerea energiei şi de relaţia cu oxigenul din
mediu, bacteriile se pot grupa în 4 „tipuri respiratorii” principale:
- strict aerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvoltă
numai în prezenţa unei presiuni crescute a O 2, care este folosit ca acceptor final unic.
Aceste bacterii posedă catalază, peroxidază, citocromi (de exemplu catalaza desface H 2O2
toxic pentru celula bacteriană) şi utilizează numai procese de respiraţie. Unele specii aerobe
(exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta în medii lipsite de oxigen, dacă în mediu
sunt prezenţi nitratul sau nitritul;
- strict anaerob, atunci când bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium
botulinum, Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc.) cresc numai în absenţa O2.
Nu pot supravieţui în prezenţa O2, care nefiind redus are o acţiune bactericidă. Nu au catalază,
peroxidază (care acţionează asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc
pentru obţinerea energiei numai procese de fermentaţie. Pentru cultivarea lor este necesară
utilizarea unui mediu cu potenţial redox foarte scăzut.
- aerob facultativ anaerob, atunci când bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes, etc.) se
dezvoltă mai bine în mediile cu oxigen, prin procese de respiraţie, dar pot prezenta ambele
tipuri respiratorii, în funcţie de potenţialul redox. Majoritatea au catalază sau
citocromoxidază, dar nu au peroxidaze flavoproteice. În acest tip se încadrează majoritatea
bacteriilor studiate.
- anaerob microaerofil, atunci când bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolerează
mici cantităţi de O2.
3.3. Căi metabolice
Metabolismul glucidic
Polizaharidele utilizabile de către bacterii nu pot pătrunde ca atare în celulă. Ele sunt
degradate de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindează unităţile
monozaharidice din extremităţile lanţurilor polizaharidice) şi endohidrolaze (care hidrolizează
unităţile interne). Polizaharidele existente în celulă ca materiale de rezervă au o degradare
diferită, prin fosforoliză, rezultând hexozo-monofosfaţi.
Principalele căi metabolice (de catabolism) sunt:
a) calea hexozo-difosfaţilor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care în final pentru 1 mol de
glucoză se obţin 1 mol de acid piruvic şi 2 moli ATP;
b) calea pentozo-monofosfaţilor;
c) calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas).
Metabolismul lipidic
Multe bacterii degradează trigliceridele prin lipaze exocelulare în glicerol şi acizi graşi
liberi. Activitatea lipazică poate fi cercetată pe medii care conţin glicerol-tributirat. Pentru
degradarea lipidelor unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posedă enzime
specifice (lecitinaza D, fosfolipaza C). Prin degradarea fosfolipidelor din membrana
hematiilor, fosfolipaza C conferă bacteriilor proprietatea de hemoliză. Acizii graşi sunt
degradaţi preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii graşi reprezintă surse de energie
foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic generează 129 moli de ATP).
Bacteriile saprofite au proprietăţi lipolitice intense, participând la biodegradarea
grăsimilor şi uleiurilor (mai ales în mediul marin).
Metabolismul proteic
În lumea bacteriană mai răspândiţi sunt D-aminoacizii. Aceştia pot forma diferite
polipeptide cu activitate antibiotică (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu
capsula bacilului anthraxului. Participă de asemenea şi la formarea peretelui celular
(de exemplu D-Ala).

6
 Căile de degradare sunt reprezentate mai ales de:
a). transaminarea şi dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au căi
proprii de catabolism, utile în identificare);
b). decarboxilarea aminoacizilor.
3.4. Căi biosintetice particulare
3.4.1. Formarea structurilor precursorilor biosintetici glutamat, aspartat etc. se realizează
utilizând inclusiv structuri chimice care în lumea vie sunt utilizate numai de către bacterii, de
exemplu acidul diaminopimelic sau acidul dipicolinic.
3.4.2. Sinteza peptidoglicanului
Sinteza peptidoglicanului se desfăşoară pe parcursul mai multor etape. Începe prin sinteza
în citoplasmă a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM). Această structură se
ataşează de bactoprenol (un lipid din membrana celulară), după care urmează un lanţ de
reacţii biochimice. Legarea încrucişată finală se realizează printr-o reacţie de transpeptidare în
care terminaţiile amino libere ale pentaglicinei înlocuiesc reziduurile terminale ale D-Ala de
la peptidul învecinat. Reacţia este catalizată de transpeptidaze, un set de enzime numite şi
PBPs (penicillin binding proteins) care au atât activitate de transpeptidaze şi
carboxipeptidaze, dar controlează şi gradul de legare a peptidoglicanului (aspect foarte
important în diviziunea celulară). La nivelul lor se pot lega penicilinele şi alte medicamente
beta-lactamice.
Această cale de biosinteză are o importanţă particulară în medicină, oferind şi baza
acţiunii selective a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracină, vancomicină,
cicloserină, etc). Spre deosebire de celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu fluidele
organismului. În interiorul lor presiunea osmotică este foarte mare şi viabilitatea lor depinde
de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular. Orice compus care
inhibă o etapă în biosinteza peptidoglicanului la o bacterie în creştere va putea produce liza
bacteriană (efect bactericid).
3.4.3. Sinteza LPZ
Sinteza este asemănătoare cu cea a peptidoglicanului; în ambele situaţii, o serie de
subunităţi se asamblează pe un lipid transportor la nivelul membranei şi apoi sunt transferate
în „fabrica” polimerului în creştere pentru realizarea peretelui celular. Toate componentele
LPZ sunt sintetizate şi ansamblate la nivelul membranei citoplasmatice.
3.4.4. Sinteza capsulei extracelulare
Capsula se sintetizează enzimatic din subunităţi activate. În sinteza capsulei extracelulare
(poate avea structură polizaharidică sau peptidică) nu sunt implicate lipide transportoare de
provenienţă membranară. Prezenţa capsulei este adesea determinată de condiţiile de mediu.
De exemplu, dextranii se pot sintetiza pornind de la sucroză şi acest lucru se va realiza doar
dacă există sucroză în mediu.
3.4.5. Sinteza substanţelor de rezervă
Când nutrienţii sunt în exces, bacteria poate converti o parte din ei în granule de rezervă
(vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutină, care diferă de la o bacterie la
alta.
3.5. Cultivarea bacteriilor
3.5.1. Definiţii utile
Populaţia reprezintă o multitudine de indivizi ai unei specii care convieţuiesc într-un
anumit biotop.
Clona este populaţia care rezultă dintr-o singură celulă prin înmulţire vegetativă
(diviziune binară).
Tulpina reprezintă populaţia microbiană alcătuită din descendenţii unei singure izolări în
cultură pură.
Temperatura de dezvoltare

7
 În funcţie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi:
- mezofile, cu temperatura optimă de 30-37ºC;
- psichrofile, cu temperatura optimă în jur de 20ºC (unele acceptând temperaturi apropiate
de 0ºC; Listeria spp. poate supravieţui sau se poate chiar şi multiplica la temperatura din
frigider). Ele sunt adaptate la acest mediu prin numărul mare de acizi graşi nesaturaţi conţinuţi
de membrana plasmatică. Gradul de nesaturare al unui acid gras se corelează cu timpul de
solidificare sau stadiul de tranziţie termică (temperatura la care se topeşte sau se solidifică
lipidul). Acizii graşi nesaturaţi rămân în fază lichidă la temperaturi joase, dar sunt denaturaţi
la temperaturi moderate. Fie că acizii graşi din membrană se află în fază lichidă sau solidă, ei
afectează fluiditatea membranei, care afectează în mod direct capacitatea de a funcţiona.
- termofile, cu temperatura optimă de 50-60ºC (unele putând să se multiplice şi la
temperaturi apropiate de 95ºC, ca de ex. Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt
adaptate să reziste la temperaturi de peste 60°C printr-o varietate de modalităţi. Acizii graşi
din membrana bacteriilor termofile sunt acizi graşi saturaţi, permiţând membranelor să
rămână stabile şi funcţionale la temperaturi ridicate.
- extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optimă de 80°C sau mai mare şi o
temperatură de dezvoltare maximă de 115°C. Nu sunt patogene.
Bacteriile studiate de microbiologia medicală sunt în marea lor majoritate mezofile.
3.5.2. Noţiuni de creştere şi multiplicare bacteriană
Creşterea oricărui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creşterea
volumului celular raportată la creşterea suprafeţei este mai mare, în cursul creşterii se ajunge
la un punct critic. Multiplicarea celulară este o consecinţă a creşterii. Se restabileşte raportul
optim dintre volumul şi suprafaţa celulei.
Multiplicarea majorităţii bacteriilor se face prin diviziune simplă (binară). Sporii nu
reprezintă forme de multiplicare (aşa cum se întâmplă în cazul fungilor sau paraziţilor).
3.5.3. Cultivarea bacteriilor
Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecţii, trebuie ca din produsul recoltat de la
pacient să obţinem mai întâi respectivul microorganism în cultură pură, pentru ca ulterior să îi
putem studia diferitele caractere în vederea identificării.
Metodele de cultivare a bacteriilor urmăresc mai multe obiective:
- obţinerea unei populaţii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaţiile propuse,
- prevenirea contaminării produsului cercetat cu un microorganism străin şi
- izolarea fiecărei tulpini microbiene urmărite în cazul unui produs plurimicrobian în
culturi monomicrobiene denumite „culturi pure”.
Nu există un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricărei bacterii.
Termenul „însămânţare” defineşte operaţia de introducere a unei cantitaţi de germeni într-un
mediu de cultură artificială, în timp ce pentru culturile celulare, ouă embrionate şi mai ales
animale de experienţă folosim termenul „inoculare”.
Cultivarea se realizează prin însămânţarea bacteriilor pe medii de cultură. Mediile solide
sau lichide care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-chimice necesare creşterii şi multiplicării
bacteriene se numesc medii de cultură.
Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea într-un mediu de cultură poartă
numele de cultură bacteriană.
Mediile de cultură
Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii şi pe medii artificiale.
Există anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi
cultivate decât pe gazde vii, aşa cum se întâmplă în cazul virusurilor, respectiv: animale de
laborator, ouă de găină embrionate sau culturi de celule.
Majoritatea bacteriilor, fungii şi unele protozoare se pot cultiva şi pe medii artificiale.

8
 Mediile de cultură artificiale trebuie să fie nutritive (să conţină factorii de creştere
necesari), să fie sterile, să aibă un anumit pH (de obicei între 7,2-7,6), să aibă o anumită
presiune osmotică, să aibă umiditatea favorabilă multiplicării germenilor etc.
Factorii de creştere reprezintă substanţe esenţiale pe care microorganismele nu sunt
capabile să le sintetizeze din nutrienţii de care pot să dispună. Ei sunt necesari în cantitaţi
mici. Îndeplinesc anumite roluri în biosinteză. Factorii de creştere pot fi grupaţi în:
1. Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN şi ARN);
2. Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor;
3. Vitamine: necesare în calitate de coenzime şi grupări funcţionale pentru enzime.
Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesită factori de creştere. Aceste bacterii pot
sintetiza purinele esenţiale, pirimidinele, aminoacizii şi vitaminele pornind de la o sursă de
carbon.
Alte bacterii necesită purine, pirimidine, vitamine şi anumiţi aminoacizi pentru a creşte.
Aceşti compuşi trebuie adăugaţi în prealabil în mediile de cultură.
Factorii de creştere nu sunt metabolizaţi direct ci sunt asimilaţi de către bacterii pentru
a-şi îndeplini rolul în metabolism. Tulpinile mutante care necesită anumiţi factori de creştere
ce nu sunt necesari tulpinii din care au provenit sunt numite auxotrofe. Spre exemplu, o
tulpina de E. coli care necesită triptofan pentru dezvortare se va numi auxotrof-triptofan şi va
fi desemnată E. coli trp-.
Clasificarea mediilor de cultură artificiale
Aceste medii se pot clasifica după starea de agregare, după natura ingredientelor, după
complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), după scopul urmărit (de transport,
de izolare, de identificare etc.), după conţinutul în apă, etc. Există medii de cultură simple
(agar, apă peptonată, bulion simplu etc) şi medii de cultură mai complexe (agar-sânge, bulion
glucozat, agar Muller-Hinton etc).
Medii speciale
Mediul electiv conţine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltării unei anumite
bacterii (de exemplu mediul Lőffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric).
Prin conţinutul său în substanţe antimicrobiene, mediul selectiv inhibă dezvoltarea altor
bacterii decât cea a cărei izolare se urmăreşte. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru
izolarea bacilului difteric sau medii în care includem antibiotice (faţă de care bacteria care se
doreşte a fi izolată este rezistentă).
Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii patogene, inhibând
dezvoltarea florei de asociaţie dintr-un produs patologic. Funcţionează concomitent ca mediu
selectiv şi ca mediu electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de
îmbogăţire utilizate pentru izolarea Salmonella typhi).
Mediul diferenţial conţine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate fi
sau nu metabolizat, determinând modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu,
agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care diferenţiază bacteriile
lactoză-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoză-negative (Shigella, Salmonella).
Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoză), TSI (3 zaharuri şi fier), MIU
(mobilitate indol uree).
Colonia izolată
Pe medii solide, germenii însămânţaţi în suprafaţă produc colonii. Colonia este totalitatea
bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clonă
bacteriană.
Coloniile izolate se pot obţine de exemplu prin tehnica însămânţării prin dispersie
(cu ansa bacteriologică sau cu tamponul). După prelevarea cu ansa a unei porţiuni din
produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizează ansa;
se verifică temperatura, prin atingerea mediului într-o zonă neînsămânţată, cât mai periferic;

9
cu ansa sterilă se trasează a doua latură a poligonului; se resterizează ansa şi se repetă
procedeul descris până la realizarea a 4-5 laturi, fără a atinge prima latură. În acest mod, pe
ultimele „laturi” ale poligonului se vor putea observa după trecerea timpului necesar
multiplicării bacteriene, colonii izolate, bine individualizate.
Incubarea constă în menţinerea mediilor de cultură însămânţate, în condiţiile necesare
pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvoltă şi duc la apariţia unei
culturi în circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optimă de dezvoltare (asigurată în
termostat) pentru că timpul de generaţie este de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis
are un timp de generaţie de 12-27 ore şi în acest caz cultura devine pozitivă în 2-8 săptămâni.
Pentru bacteriile strict anaerobe este necesară incubarea în anaerobioză (ex. în medii la care s-
au adăugat ingrediente cu activitate reducătoare sau în anaerostat); dorim să subliniem că dacă
transportul nu se face în condiţii de anaerobioză, nu vom mai obţine nici un rezultat indiferent
de mediile utilizate.
Dinamica multiplicării bacteriilor în culturi
Culturile bacteriene sunt discontinue când se realizează în volum limitat de mediu, care
nu este reînnoit şi continue atunci când mediul de cultură este continuu reînnoit. O populaţie
bacteriană poate fi menţinută indefinit în faza de multiplicare exponenţială dacă se adaugă
continuu mediu de cultură proaspăt, cu omogenizare prin curent de aer steril şi evacuare a
unei cantităţi corespunzătoare de cultură (de exemplu în dispozitivul numit chemostat sau
turbidostat).
Chemostatul utilizează un mediu de cultură în care unul dintre nutrienţi, aflat în
concentraţie mai redusă decât ceilalţi, funcţionează ca factor limitant al creşterii. Mediul de
cultură proaspăt este admis în vasul de cultură în ritmul în care este consumat factorul
limitant, iar cultura este evacuată cu acelaşi ritm. Cultura este menţinută astfel la o valoare
constantă şi submaximală ratei de creştere, reglată prin factorul limitant. Chemostatele sunt
foarte utile pentru obţinerea de tulpini mutante pentru că după ce rata de multiplicare a fost
determinată şansa de selectare a acestor tulpini este mai mare.
În laboratorul de microbiologie clinică, de regulă se utilizează culturile discontinue.
Timpul de generaţie
Populaţia care rezultă prin diviziunea unei bacterii creşte în progresie geometrică cu raţia
2. Timpul necesar pentru dublarea populaţiei se numeşte timp de dublare sau timp de
generaţie. Timpul de generaţie în faza exponenţială şi în condiţii optime de cultivare este
determinat genetic. De exemplu, pentru E. coli este de circa 20 minute (ca şi pentru
majoritatea bacteriilor studiate). Pentru Mycobacterium tuberculosistimpul de generaţie poate
avea o valoare între 12-27 ore.

Fazele dezvoltării unei culturi bacteriene

Teoretic, dinamica unei populaţii bacteriene ar trebui să evolueze exponenţial. Dinamica
reală a populaţiei bacteriene în cultură discontinuă are însă o evoluţie caracterizată printr-o
curbă la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmică; faza
staţionară şi faza de declin.
Faza de lag
Numărul bacteriilor însămânţate rămâne staţionar sau scade; germenii se adaptează la
condiţiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, îşi consumă până la dispariţie
incluziile, cresc mult în dimensiuni, sintetizează enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se
divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag durează aproximativ 2 ore. Această fază
este aparent dependentă de o varietate de factori incluzând dimensiunea inoculului, timpul
necesar pentru a-şi reveni din şocul fizic datorat transportului, timpul necesar pentru sinteza
coenzimelor esenţiale sau a factorilor de diviziune şi timpul necesar pentru sinteza a noi
enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent în mediu.

10
 Faza de multiplicare logaritmică (exponenţială)
Celulele bacteriene prezintă caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt însă ceva mai
mari), citoplasma este intens bazofilă şi omogenă, lipsită de incluzii. Bacteriile sunt foarte
sensibile la antibiotice. Această fază este adecvată pentru studierea bacteriilor sau pentru
recoltarea lor în vederea preparării de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenţială durează
aproximativ 2-3 ore.
Faza staţionară
Multiplicarea este realizată în progresie aritmetică, dar pentru că numărul bacteriilor care sunt
distruse este aproximativ egal cu numărul bacteriilor nou apărute rata de creştere devine nulă.
Germenii au morfologia caracteristică speciei; în această fază realizăm identificarea
germenilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene începe formarea sporilor.
Faza staţionară durează aproximativ 2-3 zile.
Faza de declin
Substratul nutritiv sărăceşte, apar metaboliţi toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se
produc şi enzime autolitice, rezervele de hrană din incluzii (ex. acidul poli-β-hidroxibutiric
sau glicogenul) se consumă, pentru un timp sursa de energie rămâne doar ARN-ul celular.
Unele bacterii pot persista 2-3 luni. În acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare
şi se exprimă o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea
pentru o durată limitată de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogeneză devine
foarte intens.
Aspectul culturilor pe medii solide
Condiţiile de cultivare şi aspectul culturii sunt caractere cheie în identificarea bacteriilor.
Aspectul coloniilor variază între diferitele bacterii, fără a permite diferenţieri definitive de
specie (dar au utilitate în contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene şi în contextul
general al diagnosticului de laborator, care la rândul său trebuie să aibă loc într-un context în
care punem în balanţă şi alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea între medicii de
diferite specialităţi este esenţială). Se examinează:
- dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm şi mici, sub 1 mm)
- conturul (circular, lobat, zimţat),
- relieful (plat, bombat, acuminat, papilat),
- suprafaţa (lucioasă, granulară, rugoasă),
- culoarea (pigmentate, nepigmentate),
- opacitatea (transparente, opace),
- consistenţa,
- aderenţa la mediu,
- prezenţa sau absenţa hemolizei (pe medii de tipul geloză-sânge).
Colonia S (smooth) are suprafaţă bombată şi netedă, margini circulare şi adesea aspect
strălucitor. Germenii păstrează structura antigenică şi nu aglutinează spontan cu soluţie salină
fiziologică. Germenii capsulaţi îşi păstrează capsula. Virulenţa este conservată.
Majoritatea bacteriilor studiate formează colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli etc.).
Colonia R (rough) este plată, suprafaţa ei prezintă rugozităţi, marginile sunt crenelate.
Structura antigenică nu este caracteristică. Nu păstrează capsula. Virulenţa nu este conservată
(excepţii Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae).
O bacterie care în mod caracteristic duce la apariţia unei colonii de tip S (ex. o
enterobacterie), în cazul în care testele de identificare prin reacţii antigen-anticorp (ex.
aglutinare pe lamă, folosind anticorpi cunoscuţi) nu se efectuează la timpul potrivit ci mai
târziu, prin „înbătrânire” va suferi anumite modificări, coloniile vor deveni de tip R, iar
identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibilă.

11
 Colonia M (mucoid) este mare, strălucitoare, mucoasă. Este dată de exemplu de bacteriile
care prezintă capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). Coloniile de Streptococcus
pneumoniae pot fi şi de tip S şi de tip M.
În cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obişnuite nu vom putea
obţine colonii izolate (a fost descris fenomenul de „invazie”). Cultura se întinde pe toată
suprafaţa plăcii în strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de „invazie”
poate fi inhibat prin incorporarea în mediu de acizi sau săruri biliare, tiosulfat de sodiu etc.
Aspectul culturilor pe medii lichide
Bacteriile şi fungii facultativ anaerobi se dezvoltă în toată masa de lichid, tulburându-l.
Bacteriile strict aerobe se dezvoltă preponderent la suprafaţa mediului. Ca un aspect
particular, în apa peptonată Vibrio cholerae se poate dezvolta şi formează un „văl” la
suprafaţa mediului. În acest caz, pH-ul mediului este 9-9,5.
Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbură omogen
mediul (majoritatea bacteriilor).
Variantele R realizează o tulburare mai puţin omogenă. Pot lăsa mediul limpede, formând
flocoane care se depun sau un strat (văl) la suprafaţa mediului (de exemplu bacilul difteric sau
bacilul tuberculos).
- Sfârşit curs -

BIBLIGRAFIE
Popa G.L., Popa M.I., Fiziologie bacteriană, în Popa M.I. (coord.), Microbiologie Medicală,
vol 1 - curs UMF „ Carol Davila”, 2010.

12