Curs 1

PRINCIPALELE GRUPE DE MICROORGANISME

UTILIZATE ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ

BACTERII

Bacteriile fac parte din regnul Monera, fiind organisme cu existenţă unicelular-solitară
sau unicelular colonială, cu excepţia actinomicetelor, care au organizare de tip micelial. Modul
de nutriţie este predominant absorbtiv, iar metabolismul de tip foto- sau chimiosintetic.
Reproducerea se face prin diviziune asexuată, mai rar prin înmugurire.
Ca rezultat al adaptabilităţii lor, bacteriile sunt prezente în toate mediile de viaţă, acolo
unde alte organisme nu pot supravieţui.
Bacteriile reprezintă grupul microbian cel mai activ şi mai numeros din sol, valorile
medii fiind de 106-109 celule vii/g sol uscat. Bacteriile sunt răspândite şi în ape, unde numărul lor
este corelat cu bogăţia de nutrienţi, având valori cuprinse între mai puţin de 10 celule/ml în apa
de izvor şi 1010 celule/ml în apele fecalo-menajere. Există bacterii în apele subterane, în
adâncimile mărilor şi oceanelor, în apele termale.
În atmosferă, deşi există cel mult condiţii de supravieţuire temporară, bacteriile se
întâlnesc mai ales în troposfera inferioară, în care, datorită curenţilor de aer se produce
dispersarea celulelor. Din aer, bacteriile pot ajunge din nou în sol o dată cu precipitaţiile.
Bacteriile se întâlnesc în microbiota naturală a plantelor şi animalelor. În tubul digestiv al
animalelor, bacteriile joacă un rol important în procesul de transformare a alimentelor şi în
procesele de imunitate.

Importanţa bacteriilor pentru industrie şi medicină

În industria alimentară, bacteriile constituie principalii agenţi de alterare a produselor

alimentare, acestea reprezentând un mediu de viaţă propice pentru dezvoltarea celulelor
bacteriene. Contaminarea produselor alimentare şi înmulţirea acestor microorganisme este
nedorită deoarece ele scad valoarea nutritivă, astfel încât în unele cazuri fac imposibilă folosirea
produsului pentru
consum. În plus, unele bacterii pot produce toxine care determină apariţia toxiinfecţiilor
alimentare.
Unele bacterii aflate în alimente sunt utile în anumite procese tehnologice, producând
transformări fermentative ale unor materii prime: acrirea laptelui, conservarea legumelor prin
fermentaţie lactică, fermentarea măslinelor, a furajelor.
Tulpini selecţionate de bacterii sunt folosite drept culturi starter ale unor procese
fermentative, cum sunt: bacterii lactice din genul Lactobacillus şi Streptococcus în monoculturi
sau culturi mixte pentru fabricarea produselor lactate (iaurt, smântână, chefir, diferite tipuri de
brânzeturi), în industria panificaţiei pentru îmbunătăţirea calităţilor aluatului, la conservarea prin
fermentaţie a unor vegetale. De asemenea, bacteriile lactice introduse în unele preparate din
carne au rol de culturi de protecţie inhibând creşterea microorganismelor nedorite şi
îmbunătăţesc procesul de maturare şi calităţile senzoriale. Culturi selecţionate de bacterii
propionice din genul Propionbacterium determină proprietăţile caracteristice ale brânzeturilor de
tip Schweitzer şi Emmenthal, prin producerea de acid propionic şi CO2. În procesul tehnologic de
obţinere a oţetului se pot utiliza culturi starter de bacterii acetice care măresc randamentul de
producţie şi scurtează timpul de fabricare.
Unele specii bacteriene sunt utilizate în procesele biotehnologice de sinteză a unor
metaboliţi cu importanţă industrială: enzime – amilaze, proteaze, glucanaze, celulaze, (Bacillus
subtilis), biomasă proteică, acizi organici - lactic, acetic (bacterii lactice, acetice), solvenţi
(Clostridium), îngrăşăminte biologice (Azotobacter), insecticide (B. thuringiensis), vitamine
(Propionbacterium), polizaharide (Acetobacter, Leuconostoc, Xanthomonas).
Bacterii din genul Streptomyces şi Bacillus sunt utilizate pentru biosinteza unor
antibiotice cum sunt cloramfenicolul, eritromicina, kanamicina, streptomicina, polimixina-B şi
altele. Unii aminoacizi esenţiali sau de importanţă majoră sunt produşi de mutante de
Corynebacterium glutamicum; alte mutante servesc la sinteza de 5’ purin nucleotide care sunt
utilizate drept potenţiatori de aromă în produsele alimentare.
Există însă numeroase bacterii care produc boli la animale şi om, dintre care cele mai
cunoscute sunt tuberculoza produsă de Mycobacterium tuberculosis, ciuma datorată infecţiei cu
Yersinia pestis, lepra produsă de Mycobacterium leprae, sifilisul – agent Treponema pallidum,
tetanosul – agent Clostridium tetani, botulismul – agent Clostridium botulinum, listeriozele –
agent Listeria, tusea convulsivă – agent Bortedella pertussis precum şi diferite infecţii ale
stomacului şi intestinului produse de Campylobacter, meningite şi infecţii ale tubului respirator,
căilor urinare, ochilor, rănilor ai căror agenţi sunt bacteriile din genul Pseudomonas, dizenterii
datorate tulpinilor de Shigella disenteriae, infecţii din cele mai diverse produse de stafilococi,
streptococi şi pneumococi etc.

Ultrastructura celulei bacteriene

 Bacteriile sunt microorganisme unicelulare, care diferă în ceea ce priveşte mărimea şi
forma. Cele mai mici bacterii (unii membri ai genului Mycoplasma) au aproximativ 100-200 nm
în diametru, cât cele mai mari virusuri (poxvirusuri). Alte bacterii au dimensiuni mult mai mari:
Escherichia coli este un bacil cu o lăţime de aproximativ 1,1-1,5 μm şi o lungime de 2,0-6,0 μm;
spirochetele pot atinge 500 μm în lungime. În general, bacteriile au dimensiuni medii cuprinse
între 0,5 şi 6 μm, dar aceste caracteristici nu pot fi utilizate ca un criteriu de diferenţiere între
specii.
Deşi variază în funcţie de condiţiile de mediu, forma bacteriilor este controlată genetic.
După forma celulei, bacteriile pot fi grupate în 5 categorii: sferice, cilindrice, spiralate sau
elicoidale, filamentoase şi pătrate. La cele mai multe specii, celulele-fiice se separă şi rămân
independente datorită factorilor externi. La alte specii însă, aparţinând în special bacteriilor
sferice şi cilindrice, celulele-fiice nu se despart la sfârşitul diviziunii, ci formează grupări
caracteristice, cu valoare taxonomică.
Celula procariotă este formată din urmatoarele componente:
- Învelişuri celulare - Capsulă, strat mucos
- Perete celular
- Membrană plasmatică
- Apendici - Flageli
- Pili şi fimbrii
- Citoplasmă - Matrice citoplasmatică
- Ribozomi
- Granule
- Nucleoid

Funcţiile structurilor celulei bacteriene

Structura Funcţia
Perete celular Conferă forma bacteriei , rol de protecţie
Membrană Barieră permeabilă selectivă, rol în transport, situs al unor
plasmatică procese metabolice (respiraţie, fotosinteză)
Spaţiu Conţine enzime hidrolitice şi proteine implicate în procesele
periplasmic de nutriţie şi consum
Nucleoid Localizarea materialului genetic (ADN)
Ribozomi Sinteza proteinelor
Incluziuni Depozitarea rezervelor de carbon, fosfat şi alte substanţe
Vacuole de gaz Flotare în medii acvatice
Capsulă şi strat Rezistenţă la fagocitoză, aderenţă la substrat
mucos
Pili şi fimbrii Aderenţă la substrat, conjugare între bacterii
Flagel Motilitate
 Endospor Supravieţuire în condiţii nefavorabile

Bacteriile se caracterizează printr-o mare capacitate de adaptare la cele mai diferite

condiţii de mediu, ca urmare a structurii şi metabolismului lor. Bacteriile se pot dezvolta în limite
largi de temperatură, în general între -10oC şi +90oC, dar pot supravieţui la temperaturi extreme.
Celulele bacteriene vegetative sunt inactivate pe cale termică la temperaturi de pasteurizare, iar
sporii bacterieni prin sterilizare.
Domeniul de pH în care se pot dezvolta bacteriile are valori între 1 - 11 unităţi, cu valori
ale pH optim în funcţie de specia bacteriană. După necesarul de oxigen, bacteriile pot fi: strict
aerobe, strict anaerobe, facultativ anaerobe, anaerobe aerotolerante sau microaerofile.
Caracterele biochimice şi fiziologice se referă de asemenea la capacitatea bacteriilor de a
utiliza anumiţi nutrienţi (acizi organici, alcooli sau glucide ca surse de carbon), de a metaboliza
anumite substraturi, de a fermenta un anumit spectru de zaharuri cu sau fără producere de gaze,
de a modifica pH-ul mediului de cultură evidenţiat adesea de un indicator colorat.

DROJDII
Drojdiile (levurile) sunt fungi cu formă predominant unicelulară, cu un singur nucleu şi
care se reproduc fie asexuat prin înmugurire sau diviziune transversală, fie sexuat prin formare
de spori. Aceste microorganisme formează un grup taxonomic complex şi heterogen,
manifestând o mare diversitate morfologică şi biochimică.

Importanţa drojdiilor

Datorită proprietăţilor lor, drojdiile sunt o categorie taxonomică de importanţă majoră în

industria alimentară şi în alte domenii, cunoscute fiind capacitatea acestora de a produce
fermentaţia glucidelor simple în anaerobioză, cu formare de alcool etilic şi dioxid de carbon,
precum şi compoziţia chimică valoroasă pentru obţinerea unor suplimente nutritive.
Drojdiile de fermentaţie sunt utilizate în biotehnologiile fermentative la fabricarea
vinului, a berii, a altor băuturi alcoolice, a spirtului de fermentaţie, precum şi la obţinerea pâinii,
prin dospirea aluaturilor. Dacă drojdiile sunt cultivate în condiţii de aerobioză se obţine o
biomasă cu conţinut ridicat de proteine (45-55% proteină brută raportată la s.u.) cu denumirea de
“single cell biomass” , utilizată atât în furajarea animalelor cât şi în alimentaţia omului. În plus
faţă de valoarea energetică şi plastică, biomasa din drojdii mai conţine şi aminoacizi esenţiali
(lizină, triptofan) şi vitamine ale grupului B (tiamină şi riboflavină). Biomasa din drojdii se
utilizează de asemenea la obţinerea de extracte (autolizate) folosite ca aditivi alimentari sau
pentru suplimentarea unor medii de cultură în factori de creştere sau surse de azot pentru
microorganisme. Din drojdii se pot extrage unele vitamine hidrosolubile (B1, B2, PP, ergosterol),
precum şi unele enzime hidrolitice cum sunt invertaza sau lactaza. Prin tehnici de inginerie
genetică s-a reuşit obţinerea unor tulpini mutante de Saccharomyces cerevisiae producătoare de
interferon.
Drojdiile prezintă numeroase avantaje pentru cercetările de inginerie genetică, fiind
utilizate în biotehnologia modernă de manipulare a genelor, pentru obţinerea unor preparate
farmaceutice, vaccinuri noi, preparate utilizate în industria alimentară.
Unele drojdii patogene pot produce boli la om şi animale, cum este specia de Candida
albicans - agent al candidozelor cutaneo-mucoase şi viscerale, Malassezia furfur - agent al
micozei pielii sau Cryptococcus neoformans care produce îmbolnăviri ale plămânului şi
sistemului nervos central.
Deosebita importanţă a acestor microorganisme pentru producţia industrială a unor
substanţe constă în aceea că sunt rezistente, puţin exigente, prezintă o creştere rapidă şi pot fi
uşor separate din mediul de cultură.
Drojdiile sunt larg răspândite în natură, existând în majoritate ca forme saprofite de viaţă.
Datorită metabolismului lor caracteristic, o mare parte din drojdii manifestă preferinţă pentru
microhabitatele bogate în zaharuri, de obicei de origine vegetală, unde concurează cu succes alte
microorganisme. Prezente într-o varietate de habitate naturale reprezentate de plante, animale,
sol, ape, drojdiile ajung în diferite produse fermentative, alimentare, în care pot acţiona ca
microorganisme de degradare. În acelaşi timp, unele produse fermentative sunt obţinute cu
ajutorul drojdiilor existente în mod natural pe materiile prime. Se întâlnesc de asemenea specii
parazite de drojdii, în strânsă dependenţă de gazda care le furnizează substanţele nutritive
necesare. Un număr relativ mic de drojdii facultativ sau obligatoriu parazite pot determina boli la
om, animale şi plante. Deoarece drojdiile sunt imobile, răspândirea lor se face prin curenţi de aer
şi de apă, prin ploaie şi cu ajutorul insectelor şi păsărilor.
Deşi au fost găsite în sol în cantităţi mai mici comparativ cu alte microorganisme,
drojdiile alcătuiesc populaţii semnificative în acest mediu. În general, numărul de celule viabile
pe gram de sol este cuprins între 0 şi câteva mii. S-a constatat că, în probele recoltate din solurile
grădinilor şi livezilor, numărul celulelor de drojdie este mai mare, de ordinul a 105 celule per
gram.
 Apele dulci şi sărate conţin drojdii provenite dintr-un număr mare de surse: sol, floră şi
faună acvatică, plancton etc. Populaţiile cele mai abundente de drojdii se întâlnesc în apele de
suprafaţă, care conţin cantităţi mari de materii organice.
Drojdiile pot acţiona ca microorganisme de degradare a produselor alimentare, deseori de
tip special: drojdii care fermentează lactoza în produsele lactate, drojdiile osmofile în miere,
lapte condensat îndulcit şi saramuri. Cu toate acestea, prezenţa drojdiilor de contaminare nu este
asociată niciodată cu producerea de toxine, chiar dacă sunt drojdii patogene; prin urmare nu are
loc otrăvirea alimentelor.
Drojdiile capabile să se dezvolte în substrate cu conţinut ridicat de zahăr (40 - 70%
concentraţie zahăr), de exemplu în miere, gemuri, jeleuri, siropuri, fructe uscate, melase şi alte
produse sunt drojdii osmofile sau osmodure. Dezvoltarea drojdiilor în produse cu conţinut
superior de sare se întâlneşte la producerea de măsline fermentate, castraveţi muraţi, varză
murată etc. sau la producerea de pelicule vâscoase ce se formează cu timpul pe slănină, cârnaţi,
şuncă şi carne sărată, care conţin în număr mare specii din genul Debaryomyces.

Ultrastructura celulei de drojdie

Drojdiile sunt microorganisme eucariote, unicelulare, cu dimensiuni mai mari decât ale
bacteriilor, având diametrul mic cuprins între 1-5 m şi diametrul mare între 5-50 m. Formele
miceliale sau pseudomiceliale pot atinge dimensiuni de 170x8-12 m. Celula de drojdie nu
posedă flagel, fiind deci imobilă. Cele mai răspândite forme ale celulei de drojdie sunt
următoarele:
- forma ovală sau elipsoidală (Saccharomyces)
- forma sferică (Torulopsis)
-forma apiculată, asemenea unei lămâi (Nadsonia, Kloeckera, Hanseniaspora)
- forma cilindrică sau filamentoasă (Candida, Ashbya, Endomyces)
- forma de sticlă (Saccharomycodes)
- forma de triunghi (Trigonopsis)
Pe suprafaţa mediilor de cultură solide sau solidificate, dintr-o celulă de drojdie, prin
înmugurire succesivă, rezultă o biomasă de celule de acelaşi tip numită colonie. Coloniile de
drojdii au dimensiuni cuprinse între 0,2 - 2 cm în funcţie de specie şi de condiţiile de cultivare;
au aspect cremos, fiind lucioase sau mate. În general culoarea coloniilor este alb - crem, dar
există drojdii care formează colonii colorate în roşu, roz sau portocaliu datorită sintezei de
pigmenţi carotenoidici (genurile Rhodotorula şi Sporobolomyces). Coloniile pot prezenta în
secţiune un profil lenticular, semicircular sau umbonat, şi pot avea margini uniforme sau
ondulate.
În mediile de cultură lichide, drojdiile fermentative produc transformarea fermentativă
anaerobă a substraturilor dulci, rezultând alcool etilic şi dioxid de carbon, cu tulburarea mediului
şi formarea de spumă. În funcţie de structura peretelui celular, drojdiile cultivate în medii lichide
pot rămâne în suspensie (proprietate de pulverulenţă) sau se pot aglutina (proprietate de
floculare).
Drojdiile oxidative, care se dezvoltă în condiţii de aerobioză, formează la suprafaţa lichidului un
voal alb, cutat, care se rupe uşor şi cade la fundul vasului, producând tulburare şi sediment.

Microscopul optic permite vizualizarea unor structuri ale celulei de drojdie cum ar fi
nucleul, mitocondria, peretele celular şi citoplasma, ultrastructurile putând fi observate numai cu
ajutorul microscopului electronic.

Învelişurile celulare
Peretele celular şi membrana plasmatică sunt învelişurile celulei de drojdie, având rol de
delimitare, protecţie şi participând la toate procesele fiziologice fundamentale care se desfăşoară
la nivel celular.
Peretele celular al levurilor este un înveliş tare, flexibil, elastic, rezistent la acţiunea unor
factori fizici, chimici şi biologici, cu următoarele funcţii: înveleşte şi protejează protoplastul,
participă la schimburile de substanţe cu mediul ambiant, controlează rata de creştere a celulei.
Peretele celular este un complex biochimic format din polizaharide şi alte tipuri de substanţe
(proteine, lipide, fosfaţi). Glucanul, manoproteinele şi chitina reprezintă peste 90% din substanţa
uscată a peretelui celular, alături de care sunt prezente cantităţi mici de lipide, enzime, cationi
divalenţi şi apă.
Membrana plasmatică reprezintă cel de al doilea înveliş al celulei de drojdie, ce aderă
strâns pe toată suprafaţa sa la peretele celular, cu care cooperează funcţional. Plasmalema poate
fi vizualizată la microscopul electronic sub forma unui strat trilamelar lipoproteic, fiind descrisă
de Singer şi Nicholson în modelul mozaicului fluid (1972). Membrana plasmatică a drojdiilor are
rol în transportul substanţelor între celulă şi mediul ambiant, în reacţiile imunologice de
suprafaţă, în reglarea procesului de creştere celular şi în sinteza unor componenţi chimici din
structura peretelui celular.

Citoplasma și organitele celulare

Matricea citoplasmatică (hialoplasma sau citosolul) reprezintă substanţa fundamentală a
celulei de drojdie, în care sunt înglobate organitele celulare, împreună cu care formează
citoplasma. Citosolul este un mediu preponderent apos, apa reprezentând între 70 şi 85% (în
celulele aflate în faza exponenţială de creştere), în care substanţele componente se află în stare de
sol sau gel, formând micele coloidale. Dintre substanţele organice predomină proteinele cu rol
plastic sau de catalizatori, lipidele simple şi complexe (mai ales cu rol plastic) şi glucidele (mai
adesea substanţe de rezervă cu rol energetic), macromolecule de ARN (mesager, de transfer şi
ribozomal), ARN killer, ADN extracromozomial din plasmide. Contine incluziuni de rezervă de
mai multe tipuri, dintre care cele mai des întâlnite sunt granulele de glicogen şi globulele
lipidice. Celulele normale de drojdie sunt uninucleate, având un nucleu de formă sferică sau
ovală,
cu o poziţie de obicei excentrică datorită vacuomului. Reticulul endoplasmic a fost evidenţiat la
toate tipurile de drojdii, sub forma unor cisterne şi tubuli răspândiţi în spaţiul celular, uneori în
continuitate cu membrana externă a învelişului nuclear şi cu tonoplasma vacuolei centrale,
putând fi rugos sau neted (după cum are sau nu ribozomi ataşaţi de suprafaţa sa). Aparatul Golgi
este un sistem de endomembrane, cu un pronunţat polimorfism structural, având funcţii de
sinteză, acumulare, transport şi secreţie. Ribozomii sunt caracteristici celulelor eucariote, având
coeficientul de sedimentare 80S, alcătuiţi din ARN ribozomal şi proteine, cu o organizare relativ
simplă (o subunitate 40S şi o subunitate 60S). Lizozomii sunt structuri veziculare, înconjurate de
o membrană simplă, bogate în hidrolaze (peste 40 tipuri de enzime) cu pH optim acid. Enzima
marker a lizozomilor este fosfataza acidă, alături de care au mai fost identificate: glicozidaze,
ribonucleaza acidă, dezoxiribonucleaza acidă, trehalaza etc. Sistemul vacuolar, uşor de vizualizat
la microscopul optic, este alcătuit din una sau mai multe vacuole de diferite dimensiuni., cu un
diametru cuprins între 0,1 şi 3 μm în strânsă corelaţie cu stadiul celular. Peroxizomii sunt
structuri sferice sau ovale, cu diametrul de 0,1-0,8 m, delimitate de o membrană simplă.
Peroxizomii conţin enzime din clasa oxidoreductazelor implicate în reacţii de formare sau
descompunere a H2O2. Studiile de microscopie fotonică şi electronică au demonstrat marea
mobilitate, plasticitate şi flexibilitate a condriomului drojdiilor. La nivelul membranei interne
mitocondriale sunt localizate enzime de catabolism implicate în ciclul Krebs, în -oxidarea
acizilor graşi, în fosforilarea oxidativă, în sinteza de ATP . Mitocondriile reprezintă « uzina
energetică » a celulei, în interiorul lor desfăşurându-se reacţii generatoare de ATP în timpul
respiraţiei celulare.
Caractere fiziologice ale drojdiilor
Drojdiile utilizează pentru multiplicare şi întreţinerea funcţiilor vitale o serie de
substraturi nutritive, ce conţin o sursă de carbon, o sursă de azot, săruri minerale şi factori de
creştere, în anumite concentraţii. Aceste microorganisme utilizează glucidele ca principală sursă
de carbon, fie pe cale fermentativă, fie pe cale oxidativă, în procesul de respiraţie. Natura şi
concentraţia optimă a glucidelor diferă în funcţie de tipul de drojdie, acestea putând metaboliza,
în general, monozaharide ca glucoza, manoza, fructoza, unele dizaharide cum este zaharoza,
lactoza şi maltoza (dupa o hidroliză prealabilă), trizaharide ca rafinoza, polizaharide ca amidonul
şi inulina. De asemenea, drojdiile mai pot asimila pentoze (xiloza, arabinoza, riboza), alcooli
(etanol, glicerol, eritriol, manitol, sorbitol), acizi organici (acid lactic, succinic, citric, piruvic),
alcani. Ca surse de azot, levurile preferă sărurile de amoniu, peptonele, aminoacizii, în unele
cazuri ureea, nitraţii sau nitriţii. Fosforul este un element chimic necesar dezvoltării drojdiilor,
care îl preiau din mediul de cultură sub formă de fosfaţi , în funcţie de gradientul de concentraţie,
fiind stocat în celulă sub formă de monofosfat în granulele de volutină. Majoritatea speciilor de
drojdie sunt capabile să metabolizeze sulful anorganic sub formă de sulfaţi, sulfiţi, aminoacizi cu
sulf. Potasiul şi magneziul sunt elemente minerale absolut indispensabile creşterii drojdiilor, în
timp ce calciul, fierul, zincul sunt necesare în concentraţii mai mici, stimulând creşterea sau
fermentaţia. La doze prea mari substanţele minerale pot avea efecte toxice. Drojdiile au necesităţi
extrem de diferite în privinţa factorilor de creştere, dintre care cei mai cunoscuţi sunt: biotina,
acidul pantotenic, inozitolul, tiamina, acidul nicotinic şi piridoxina.
 Principala proprietate a drojdiilor utilizate în industria alimentară este dată de capacitatea
acestora de a fermenta glucidelele din mediu, cu formare de alcool etilic şi dioxid de carbon,
alături de unele produse secundare.
Capacitatea oxigenului de a influenţa procesele anaerobe, inhibând prin prezenţa sa
procesul de fermentaţie şi determinând o accentuare a respiraţiei, este cunoscută sub numele de
efect Pasteur sau efectul oxigenului. S-a constatat, de asemenea, că, în prezenţa unor concentraţii
mari de glucoză, în aerobioză, are loc represia respiraţiei celulare datorită inhibării sintezei
citocromilor a, b şi c şi ca urmare zahărul va fi metabolizat prin fermentaţie. Acest fenomen se
numeşte efectul Crabtree (1929), efectul Pasteur invers sau inhibiţie prin substrat.
Există numeroase specii de drojdii care sunt exclusiv aerobe, fiind lipsite de capacitatea
de fermentaţie (de exemplu drojdiile din genurile Rhodotorula, Cryptococcus, unele specii de
Candida).
Drojdiile sunt microorganisme în majoritate mezofile, cu o temperatură optimă de
dezvoltare cuprinsă între 28o şi 32oC, existând însă şi drojdii termofile, care se pot dezvolta la
temperaturi de 35 - 38oC şi drojdii care pot creşte la temperaturile de refrigerare.
Drojdiile se dezvoltă bine într-un domeniu larg de pH, cu valori limită între 2,5 - 8,5,
având un pH optim în jurul valorii de 5,5. O caracteristică a unor tulpini de drojdii este caracterul
killer, în funcţie de care celulele sunt împărţite în trei tipuri distincte genetic şi fenotipic: killer,
sensibile şi neutre. Celulele killer (K) secretă în mediul în care trăiesc o toxină, killina, care
omoară celulele sensibile, dar care nu are nici un efect asupra celulei care o produce.
Celulele de drojdie reacţionează activ la modificările presiunii osmotice din mediul
extern. În medii hipotonice, cu o concentraţie a substantelor dizolvate mai mică decât
concentraţia intracelulară, apa va pătrunde în celulă, care îşi măreşte volumul, având loc un
fenomen de turgescenţă. În medii hipertonice, în care concentraţia mediului este superioară celei
din celulă, apa difuzează la exterior, iar celula trece în starea de plasmoliză. Există unele specii
de drojdii rezistente la medii cu presiuni osmotice mari, cum este cazul drojdiilor osmofile din
genurile Zygosaccharomyces, care nu suferă plasmoliza în siropuri de zahăr cu concentraţii de
40-60% şi Debaryomyces, tolerante la concentraţii mari de sare (25%).

Reproducerea drojdiilor
Drojdiile se pot reproduce asexuat și sexuat.
Reproducerea asexuată a drojdiilor este o formă de multiplicare întâlnită la toate speciile
în condiţii favorabile de viaţă. Drojdiile se pot reproduce asexuat (pe cale vegetativă) în două
moduri: prin procesul de înmugurire şi prin sciziune (genurile Schizosaccharomyces şi
Saccharomycopsis).
Înmugurirea este modalitatea caracteristică de multiplicare asexuată a drojdiilor şi constă
în formarea unui mugure reprezentând celula fiică, ce apare ca o protuberanţă pe suprafaţa
celulei mame. În funcţie de specie, mugurii se pot forma polar (la unul din polii celulei), bipolar
sau multilateral.
 Reproducerea prin înmugurire este larg întâlnită în procesele de obţinere a biomasei de
drojdie, la fabricarea drojdiei comprimate, a drojdiei furajere, pentru extragerea din biomasă a
unor compuşi cu valoare industrială sau farmaceutică (vitamine, enzime). De asemenea,
înmugurirea are loc şi la obţinerea culturilor starter pentru bere, vin sau spirt de fermentaţie.
Reproducerea pe cale sexuata se face prin ascospori. Prin procesul de sporulare, în
celulele drojdiilor ascogene se formează ascosporii, al căror număr şi caractere morfologice sunt
dependente de specie.

MUCEGAIURI
Mucegaiurile sau fungii filamentoşi sunt încadraţi în regnul Fungi (din limba latină,
fungus, ciupercă), alături de drojdii. Mucegaiurile sunt microorganisme eucariote, formatoare de
spori, cu nutriţie de tip absorbtiv, care se reproduc sexuat şi asexuat.
Mucegaiurile sunt răspândite în toate mediile de viaţă, datorită capacitaţii lor deosebite
de adaptare. Celula mucegaiurilor poate sintetiza o serie de enzime care le asigură acestora
echipamentul necesar metabolizării celor mai diverse substraturi. Astfel, aceste microorganisme
puţin pretenţioase la condiţiile de mediu, pot degrada materialele organice complexe până la
compuşi organici simpli şi molecule anorganice.
Solul reprezintă un habitat în care mucegaiurile sunt răspândite în special în straturile
superficiale, acolo unde există materie organică în descompunere şi condiţiile necesare de
aerobioză. În ape, dezvoltarea mucegaiurilor este dependentă de conţinutul de substanţe
organice şi de concentraţia de oxigen. Sporii sau hifele de mucegaiuri pot ajunge în aer,
fiind purtaţi de curenţi la distanţe mari, depunându-se apoi pe suprafaţa obiectelor.
Mucegaiurile pot parazita unele organisme vii (plante, animale, om), producând boli.
Mucegaiurile se întâlnesc pe suprafaţa frunzelor, fructelor, rădăcinilor plantelor, în ţesuturile
cărora pot pătrunde datorită hifelor, invadând organele respective. Mucegaiurile care produc boli
ale plantelor sunt resposabile pentru aproximativ 70% din totalul îmbolnăvirilor întâlnite la
cereale, fructe şi legume. Dintre aceste boli, cele mai răspândite sunt mălura, rugina, tăciunele
plantelor cerealiere, atacul fructelor şi legumelor atât în timpul creşterii şi maturizării cât şi în
perioada de păstrare, producând putrezirea umedă sau uscată a ţesuturilor.

Importanța mucegaiurilor

Prin procese de biosinteză, cu ajutorul mucegaiurilor se obţin substanţe utile atât în

domeniul industriei alimentare cât şi pentru industria chimico-farmaceutică sau pentru furajarea
animalelor.
 Enzimele cele mai diverse, în special hidrolaze sunt produse în medii de cultură ieftine
conţinând deşeuri şi subproduse ale industriei agroalimentare: amilaze şi glucoamilaze din tulpini
de Aspergillus oryzae şi A. niger; enzime celulozolitice din Trichoderma viridae; enzime
pectolitice din A. niger; proteaze din A. niger şi A. oryzae; cheag microbian (substitut al reninei)
din tulpini de Mucor miehei şi M. pussilus, lipaze din Penicillium şi Aspergillus etc. De
asemenea, unii acizi organici de importanţă majoră pentru acest domeniu, cum sunt acidul citric,
gluconic, fumaric, malic, sunt biosintetizaţi în special de tulpini de Aspergillus cultivate în
suprafaţă sau submers. Unii pigmenţi alimentari de origine microbiană sunt produşi pe cale
biotehnologică din mucegaiuri: pigmenţii carotenoidici din tulpini de Phycomyces, orezul roşu
fermentat din tulpini de Monascus purpureus.
Prin cultivarea unor mucegaiuri poate fi obţinută o biomasă proteică, uşor de separat din
mediul de cultură şi utilizată în hrana animalelor. În acest scop se folosesc tulpini de Fusarium
graminearum sau tulpini de bazidiomicete cum sunt cele de Pleurotus ostreatus (buretele de fag)
şi Polyporus squamosus (buretele de nuc), ca adaos în unele alimente, datorită gustului şi aromei
deosebite.
Culturile fungice selecţionate sunt utilizate la fabricarea unor brânzeturi speciale, cum
este brânza Camembert cu pastă moale (însămânţată cu o cultură de Penicillium camemberti) sau
branza Roquefort cu pastă albastră (cu culturi de Penicillium roqueforti), cu aromă şi gust
deosebite. De asemenea, unele salamuri crude maturate se obţin folosind culturi starter de
Penicillium nalgiovensis, care asigură o uscare uniformă a produsului şi contribuie la formarea
compuşilor de gust şi aromă specifice, datorate activităţii enzimelor lipolitice şi proteolitice.
Unele mucegaiuri sunt utilizate pentru biosinteza de antibiotice - peniciline, griseofulvine
- cu fungi din genul Penicillium, cefalosporine - cu tulpini de Cephalosporium etc. Mai multe
genuri de mucegaiuri au fost şi sunt utilizate în mod tradiţional la prepararea unor mâncăruri
specifice sau băuturi, în special din soia şi orez, în ţări din Orient (Aspergillus oryzae, Monascus,
Rhizopus, Mucor).
Mucegaiurile pot juca însă şi un rol negativ în procesele din industria alimentară,
producând degradarea unor alimente din cele mai diferite categorii. Mucegăirea materiilor prime,
semifabricatelor şi a alimentelor determină modificarea calităţilor senzoriale şi pierderea valorii
alimentare a acestora, făcându-le improprii pentru consum. În plus, unele specii de mucegaiuri
pot produce, în anumite condiţii, micotoxine deosebit de periculoase pentru om şi animale.
Micotoxinele au o o toxicitate ridicată, iar majoritatea lor acţionează prin inhibarea acţiunii
enzimelor implicate în sinteza de proteine, putând produce modificări în structura acizilor
nucleici. Efectul micotoxinelor se manifestă printr-o înmulţire anarhică a celulelor şi apariţia
tumorilor maligne. Astfel de toxine sunt produse de Aspergillus flavus (aflatoxine), Penicillium
(patulina, citrinina), Fusarium (tricothecene), Claviceps purpurea (ergotoxina, ergotinina) etc.
Concentraţia maximă admisă a micotoxinelor în produselor alimentare este foarte scăzută, fiind
de 5-30 μg/kg produs.
 Caractere morfologice ale mucegaiurilor. Ultrastructura celulei de mucegai
Corpul mucegaiurilor este constituit dintr-un tal (o masă vegetativă neregulată în care nu
se diferenţiază organe, ca în cazul plantelor), format prin creşterea împreună a numeroase
filamente lungi şi subţiri numite hife, mai mult sau mai puţin alungite, ramificate, al căror
ansamblu este cunoscut sub numele de miceliu, ce poate atinge chiar câţiva metri lungime.
Aceste filamente sunt în realitate veritabile tuburi, rezistente şi protectoare, alcătuite în principal
din chitină.
Talul mucegaiurilor poate fi alcătuit fie din mai multe celule alungite, unite cap la cap, în
cazul mucegaiurilor septate (necoenocitice), fie dintr-o celulă unică, mult alungită şi ramificată,
sub forma unui tub continuu nedivizat prin septuri, în cazul mucegaiurilor neseptate
(coenocitice).
Celula de mucegai prezintă o structură caracteristică celulelor eucariote, cu unele
particularităţi specifice fungilor filamentoşi.
Peretele celular al mucegaiurilor este mai gros decât al drojdiilor, având în compoziţie  şi
-glucani, celuloză, chitină şi proteine, compoziţia lui diferind cu specia. La mucegaiurile
necoenocitice (septate) celulele sunt separate prin pereţi despărţitori numiţi septuri. Membrana
plasmatică are structura specifică celulelor eucariote, fiind alcătuită după modelul “mozaicului
fluid”. Celula de mucegai poate conţine unul sau mai multi nuclei, cu câte 2-4 cromozomi
fiecare. În cazul mucegaiurilor coenocitice, celula uriaşă prezintă numeroşi nuclei diseminati în
toată masa citoplasmatică. Celula mucegaiurilor conţine toate organitele celulare specifice celulei
eucariote: mitocondrii, reticul endoplasmic, aparat Golgi, vacuole, ribozomi, lizozomi,
peroxizomi, incluziuni. Incluziunile din celula mucegaiurilor pot conţine lipide (în special când
mediul de cultură conţine concentraţii ridicate de glucoză sau maltoză sau are un raport C/N
ridicat), glicogen, material proteic şi metafosfat. În plus, hifele mai pot conţine sau pot fi
încrustate cu cristale, cel mai adesea de oxalaţi de calciu.
Sunt microorganisme chemoorganotrofe şi folosesc materia organică drept sursă de
carbon, de electroni şi energie. Ca surse de carbon, mucegaiurile utilizează glucidele, alcoolii,
acizii organici şi alti compuşi, iar ca sursă de azot - peptonele şi aminoacizii, sărurile de amoniu
şi azotaţii. Din punct de vedere al necesarului în oxigen, fungii filamentoşi sunt microorganisme
de obicei aerobe, cresterea lor având loc în prezenţa oxigenului din aer sau a oxigenului dizolvat
în mediul lichid. Un număr limitat de specii sunt microaerofile sau anaerobe şi pot produce
mucegăirea internă a ouălor şi untului. Mucegaiurile cresc bine în atmosferă umedă, dar sunt
totuşi puţin pretenţioase la cantitatea de apă liberă prezentă în mediu. Mucegaiurile se pot
dezvolta în limite largi de pH, la valori cuprinse între 1,5-9 unităţi. Valoarea optimă a pH-ului
este de 5-6, deci în domeniul uşor acid. Majoritatea speciilor de mucegaiuri sunt mezofile, având
temperatura optimă de creştere de 22-32oC, cea minimă de 5-10oC, iar maxima de 30-40oC.
Rezistenţa termică a hifelor şi sporilor de mucegai este mică, fiind inactivate de obicei la
temperaturi de 80oC.

Reproducerea mucegaiurilor
Reproducerea mucegaiurilor se poate face fie pe cale vegetativă, prin intermediul
fragmentelor de hife desprinse din miceliu, atunci când aceste fragmente conţin cel puţin o celulă
viabilă, fie prin sporulare. Reproducerea prin sporulare este forma cea mai răspândită de
înmulţire a mucegaiurilor şi poate avea loc pe cale asexuată sau sexuată. Sporii
mucegaiurilor se remarcă printr-o mare rezistenţă la uscăciune, la presiuni osmotice
mari, la radiaţii UV şi la temperaturi moderate (până la 80-90oC).
Reproducerea asexuată
Acest tip de reproducere se realizează prin formarea sporilor asexuaţi, care iau
naştere în aşa-numitul stadiu “imperfect” al mucegaiurilor, pe hife specializate care
produc corpi reproducători de un anumit tip. Reproducerea pe cale asexuată are loc, de
obicei, în condiţii favorabile de mediu şi este forma cea mai frecventă de reproducere a
mucegaiurilor. Formarea sporilor asexuaţi se produce prin mitoză urmată de diviziunea
celulară.
Principalele tipuri de spori asexuaţi sunt următoarele:
* Sporangiosporii sunt spori endogeni, monocelulari, caracteristici
mucegaiurilor inferioare
* Conidiosporii sunt spori mono- sau pluricelulari, exogeni, formaţi la
extremitatea unei hife fertile numită conidiofor..
* Chlamidosporii se formează dintr-o celulă care îşi îngroaşă peretele,
fiind mai des întâlniţi în culturile vechi de mucegaiuri.
* Artrosporii (sau oidiile) se formează la unele mucegaiuri septate prin
fragmentarea talului în dreptul septurilor, având tendinţa de a se aranja în zig-
zag.
* Blastosporii sunt produşi de o celulă vegetativă-mamă, printr-un proces
de înmugurire,
* Zoosporii (sau planosporii) reprezintă cel mai simplu tip de spori
asexuaţi, formati în celule saciforme numite zoosporangi.

Reproducerea sexuată
Sporii sexuaţi se formează în stadiul numit “perfect” al fungilor şi reprezintă un
criteriu taxonomic important. Acest tip de spori ia naştere prin fuziunea a doi gameţi de
dimensiuni egale (izogami) sau inegale (heterogami) şi au un rol important în procesul
de evoluţie a fungilor, deoarece sunt rezultaţi prin procese de recombinare genetică.
În funcţie de modul de formare, sporii sexuaţi sunt de mai multe tipuri:

* Ascosporii se formează prin fuzionarea a două prelungiri tubulare (hife

ascogene) emise de două celule vecine de pe acelaşi miceliu sau de pe micelii
separate.
* Bazidiosporii sunt spori sexuaţi exogeni, care se formează la exteriorul
unui organ specializat numit bazidie
* Zigosporii apar în urma unirii a două celule provenind din hife
homotalice sau heterotalice, de tipuri sexuale diferite notate + şi - , deoarece nu
prezintă caractere morfologice deosebite.
 CURS 2

PROCESE FERMENTATIVE

Produsele alimentare fermentate au aparut probabil in anii 7000 – 8000

i.c. in zonele tropicale ale Mesopotamiei si vaii Indusului. Mai tarziu si alte
civilizatii au inceput sa produca alimente fermentate din diferite materii prime,
in special pentru a le conserva pe cele sezoniere, care se gaseau din abundenta
numai o perioada scurta dupa recoltare. Produsele lactate fermentate, bauturile
alcoolice din fructe si cereale si painea din aluat dospit au devenit raspandite in
timpul civilizatiilor din Orientul mijlociu si mai apoi in Egipt, Grecia si Roma
antica.
Peste 3500 de diferite alimente fermentate sunt consumate in intreaga
lume; multe din ele sunt produse traditionale si produse in cantitati mici pentru
populatia dintr-o zona restransa. Alte alimente fermentate sunt produse la scara
industriala si numarul lor este in crestere. In prezent exista un interes crescut
pentru alimentele fermentate cele mai diverse, considerate de consumatori ca
fiind naturale si sanatoase si in viitor productia si consumul acestora par sa
creasca.

Productia si caracteristicile unui mare numar de produse alimentare sunt

datorate activitatii fermentative a microorganismelor. Alimente ca branzeturile
maturate, iaurtul, muraturile, carnatii fermentati sunt produse conservate prin
fermentatie care in urma acestui proces si-au marit termenul de valabilitate fata
de cel al materiilor prime din care sunt facute. In plus, toate produsele
fermentate au gust si aroma caracteristice rezultate direct sau indirect de la
microorganismele fermentative. In unele cazuri, alimentele fermentate au un
continut crescut in vitamine precum si o digestibilitate imbunatatita. Se pare ca
nici o alta categorie specifica de alimente sau produse alimentare nu este atat de
importanta ca produsele alimentare fermentate cunoscute in intreaga lume
pentru valoarea lor nutritiva.
Ecologia microbiana a alimentelor si a produselor fermentate derivate a
fost studiata de multi ani in cazul branzeturilor, muraturilor, vinului si altor
produse, in legatura cu factorii de mediu care influenteaza natura
microorganismelor si deci tipul fermentatiei. De exemplu, cand materiile prime
sunt acide si contin zaharuri libere, drojdiile se dezvolta rapid si produc alcool
care impiedica activitatea altor microorganisme de contaminare. Pe de alta
parte, in materiile prime de natura vegetala, cand aciditatea o permite si exista
suficiente zaharuri libere se pot dezvolta bacterii lactice favorizate in special de
adaosul de NaCl (ca in muraturi).
Produsele care contin polizaharide dar nu si cantitati suficiente de
zaharuri simple sunt stabile in mod normal fata de actiunea bacteriilor lactice si
a drojdiilor din cauza absentei amilazei din majoritatea acestor celule
microbiene. Pentru declansarea procesului fermentativ trebuie adaugata o sursa
exogena de enzime de zaharificare. Cel mai bun exemplu este utilizarea
maltului din orz la fabricarea berii si a spirtului sau a produsului numit “koji” la
fermentarea boabelor de soia. Daca enzimele de zaharificare din malt se
formeaza prin germinarea orzului, in cazul preparatului koji, acestea sunt
sintetizate de mucegaiul Aspergillus niger crescut pe boabe de orez sau alte
cereale. In general enzimele sunt folosite pentru fermentarea materiilor cu
niveluri scazute de monozaharide dar cu continut mare de amidon si proteine.

Definitia fermentatiei microbiene

Termenul de “fermentatie” in sens larg poate fi inteles ca un proces in
care un substrat organic este transformat sub actiunea enzimelor produse de
microorganisme. Din punct de vedere biochimic, fermentatia reprezinta un
proces metabolic in care carbohidratii si compusii inruditi cu acestia sunt partial
oxidati cu eliberare de energie in absenta sau prezenta unor acceptori externi de
electroni. Acesti acceptori finali de electroni sunt compusi organici produsi
direct prin transformarea carbohidratilor. In consecinta, prin oxidarea
incompleta a
compusilor se elibereaza o cantitate mica de energie iar produsii finali ai
fermentatiei sunt compusi organici cu grad de reducere diferit.
Fermentaţiile sunt produse de microorganismele anaerobe sau facultativ
anaerobe. Substanţele fermentescibile sunt din cele mai diverse, incluzând
zaharuri, polialcooli, aminoacizi, acizi organici, purine, pirimidine etc. Produşii
de fermentaţie sunt de asemenea foarte diferiţi ca natură: alcooli, acizi organici,
esteri, gaze şi altele.

Aspecte nutritionale ale alimentelor fermentate

Aspectele nutritionale se refera la aportul de calorii/energie, proteine,
aminoacizi esentiali/peptide, acizi grasi esentiali si necesarul de vitamine si
minerale care satisfac nevoile metabolice ale consumatorului. In lume exista
doua probleme principale: foametea (sau subnutritia unde nu sunt suficiente
alimente sau mijloace economice de procurare) si obezitatea (sau
supraconsumul de alimente in tarile bogate dezvoltate). De asemenea exista un
mare numar de boli nutritionale in special in tarile in dezvoltare. Asa sunt
“kwashiorkor” ca rezultat al deficientei de proteine si “marasmus” cauzata de o
combinatie a deficientei de proteine si calorii, boli intalnite in special la copiii
intre 1 si 3 ani. Alte boli de acest tip sunt xeroftalmia, scaderea acuitatii vizuale
ca rezultat al deficientei de vitamina A, beri-beri (deficienta de tiamina),
pelagra (datorata deficientei de niacina), anemia si altele.
Impactul nutritional al alimentelor fermentate poate fi direct sau
indirect. Fermentatia care determina o crestere a continutului de proteine (de
exemplu soia fermentata) sau imbunatateste echilibrul in aminoacizi esentiali
sau disponibilitatea lor are un efect curativ direct. Fermentatiile care cresc
continutul sau accesul la vitamine ca tiamina, riboflavina, niacina sau acidul
folic au de asemenea un efect direct profund asupra sanatatii consumatorilor
(este cazul populatiei care subzista in special cu porumb sau orez decorticat).
Efectul indirect al consumului de alimente fermentate este corelat in special cu
prezenta microorganismelor benefice cum este cazul preparatelor probiotice, cu
prezenta
unor enzime in tractul digestiv, reducerea timpului de tratament termic,
inhibarea microorganismelor nedorite si chiar a patogenilor.
In timpul proceselor de fermentatie o serie de toxine ca inhibitorul
tripsinei, fitatii, hemaglutininele sau cianogenii sunt reduse sau distruse. Chiar
si continutul de aflatoxine intalnite frecvent in arahide si cereale poate fi redus
in unele produse.
De asemenea, fermentatia lactica de exemplu determina reducerea
partiala sau totala a timpului de preparare termica.

Metode generale de initiere a fermentatiei

Productia alimentelor fermentate se refera la doua aspecte esentiale si
anume: 1) activitatea metabolica a microorganismelor si 2) parametrii ce
trebuie respectati in timpul fermentatiei si pastrarii produsului. Fermentatia
implica expunerea materiilor prime la conditii care sa favorizeze cresterea
microorganismelor dorite, care utilizeaza anumite substraturi si formeaza
produsii finali. Acesti produsi finali impreuna cu componentele materiei prime
ramase nemetabolizate constituie alimentul fermentat avand calitatile dorite,
multe din acestea atribuite metabolitilor sintetizati.
Pentru producerea alimentelor fermentate sunt utilizate un mare numar
de materii prime de origine vegetala si animala. Acestea includ laptele (de vaca,
bivolita, oaie, capra si iapa), carnea (de vaca, porc, miel, capra, gaina), pestele,
ouale, diferite legume si fructe sau sucul acestora, cereale, tuberculi, seminte si
altele, unele in combinatii.
Fermentatia este produsa de diferite specii de bacterii, drojdii si
mucegaiuri, de o singura specie predominanta sau de populatii mixte de
bacterii, bacterii si drojdii sau bacterii si mucegaiuri. Membrii populatiilor
microbiene implicate in fermentatii nu trebuie sa manifeste relatii antagonice si
mai degraba trebuie sa fie sinergice. Cresterea microorganismelor si deci
viteza optima de
fermentatie sunt dependente de parametrii de mediu ca nutrientii, temperatura,
potential redox si pH. In procesul de fermentatie, daca diferitele specii dintr-o
populatie mixta necesita conditii diferite se ajunge la stabilirea unui compromis
care faciliteaza cresterea tuturor speciilor cu o viteza moderata.

Alimentele pot fi fermentate in trei moduri diferite, in functie de sursa

microorganismelor utilizate: fermentatie naturala, back slopping si fermentatie
controlata.
Fermentatia naturala
Multe din materiile prime folosite in fermentatii (de obicei netratate
termic) contin microorganisme utile si microorganisme asociate. Conditiile de
incubare sunt astfel mentinute incat sa favorizeze cresterea rapida a speciilor
utile si sa impiedice sau sa incetineasca dezvoltarea tipurilor asociate, din care
unele sunt chiar nedorite. Un astfel de produs alimentar fermentat natural poate
avea unele arome sau alte caracteristici rezultate din activitatea microflorei
asociate. Din cauza ca microorganismele asociate nu sunt intotdeauna aceleasi,
este dificil sa se obtina un produs cu caracteristici constante o perioada mai
lunga de timp, iar prezenta microorganismelor nedorite sau patogene are o
probabilitate crescuta.
Back slopping (utilizarea produsilor din fermentatia anterioara)
In aceasta metoda, unele produse rezultate dintr-o fermentatie optima
sunt folosite ca inocul pentru pornirea unui nou proces fermentativ, cu
respectarea parametrilor optimi pentru dezvoltarea microorganismelor
provenite din produsul anterior. Aceasta metoda se practica pentru obtinerea de
produse traditionale, la scara mica. Totusi, pastrarea acelorasi caracteristici ale
produsului un timp indelungat poate fi dificila din cauza selectiei tipurilor de
microorganisme. De asemenea, produsul final poate avea defecte sau poate
produce boli de origine alimentara.
Fermentatia controlata
Materiile prime (care pot fi pretratate termic) sunt inoculate cu o
populatie microbiana cu densitate ridicata (106 celule/ml sau mai mult) dintr-o
cultura pura continand una sau mai multe tulpini sau specii de microorganisme
(cultura starter). Conditiile de incubare sunt astfel alese incat sa favorizeze
dezvoltarea culturii starter. Prin aceasta metoda pot fi obtinute in cantitati mari
produse cu caracteristici constante si predictibile de fiecare data iar
probabilitatea de aparitie a bolilor alimentare si de dezvoltare a florei secundare
este mica.
In prezent exista in lume mai mult de 3500 de tipuri de alimente
fermentate, care pot fi grupate in cateva categorii majore, prezentate in tabelul
urmator.

Categoria de alimente Exemple

fermentate

Produse lactate Branzeturi, iaurt, lapte batut, smantana, dahi,

kumiss, kefir, lapte acidofil

Produse din carne Salami, peperoni, chorizo, thuringer, carnati,

conserve din carne, nahm

Produse din cereale Paine, pancake, biscuiti, pizza, orez fermentat,

miso, idli, dosa

Produse din fructe si legume Fructe si legume murate, masline, varza

murata, kimchi, achar

Produse din soia Tofu, lapte de soia fermentat, tempe, sos de soia

Produse din peste Sos de peste, bagoong, peste fermentat, paak,

izushi

Bauturi Bere, vin, bauturi alcoolice, alcool alimentar,

cafea, cacao, ceai
Produse din vegetale Produse fermentate din cartofi, cassava, cartofi
amidonoase dulci, banane

Alte tipuri Oua fermentate, ghee (din smantana

fermentata), otet, bors

Produsul Materia prima Microorganisme Aria geografica

alimentar de fermentatie

Cafea Boaba de cafea Erwinia disolvens, Brazilia,

Saccharomyces Congo, Hawaii,
spp. India
Miso Boaba de soia Aspergillus oryzae, Japonia
Zygosaccharomyces
rouxii

Masline Masline verzi Leuconostoc In toata lumea

mesenteroides,
Lactobacillus
plantarum

Castraveti Castraveti Pediococcus In toata lumea

murati cerevisiae,
Lactobacillus
plantarum

Varza murata Varza Leuconostoc In toata lumea

mesenteroides,
 Lactobacillus
plantarum

Sos de soia Boabe de soia Aspergillus oryzae Japonia

sau A. sojae,
Zygosaccharomyces
rouxii, Lactobacillus
delbrueckii

Sufu Boabe de soia Mucor spp. China

Kimchi Varza si alte Bacterii lactice Corea

legume

Tempeh Bobe de soia Rhizopus Indonezia,

oligosporus, Noua Guinee,
Rh. oryzae Surinam

Obtinerea aluatului in panificatie

Painea este unul din cele mai vechi alimente si este produsa cu ajutorul
microorganismelor. Utilizarea drojdiei la cresterea aluatului este pictata in
frescele din Egiptul antic.
In fabricarea painii, drojdia este crescuta in conditii aerobe, in scopul
obtinerii unui volum maxim de CO2 si acumulare minima de alcool, deci printr-
un proces in care sa fie preponderenta calea metabolica a respiratiei celulare.
Fermentatia painii implica mai multe etape: alfa- si beta amilaza prezente in
aluatul umed elibereaza maltoza si glucoza din amidon. Apoi se adauga o
tulpina de Saccharomyces cerevisiae care produce maltaza, invertaza si
complexul zimazic. CO2produs de drojdie determina textura afanata a painii iar
cantitatile mici de produse de fermentatie contribuie la gustul si aroma
produsului. De
obicei brutarii adauga drojdie suficienta pentru ca aluatul sa creasca in maxim 2 ore,
deoarece in timp mai indelungat se pot dezvolta bacterii si mucegaiuri de contaminare
care altereaza painea. Prinutilizarea unor combinatii de microorganisme pot fi obtinute
tipuri speciale de aluaturi mai acide. Drojdia Saccharomyces exiguus impreuna cu specii
de Lactobacillus produce o aroma caracteristica a acestor aluaturi. Produsele de
panifinatie pot fi contaminate cu specii de Bacillus care produc boala intinderii painii,
care altereaza calitatile senzoriale.

CURS 3

FERMENTATIA LACTICA

Fermentaţia lactică este un proces anaerob prin care glucidele

fermentescibile sunt transformate sub influenţa echipamentului enzimatic al
microorganismelor în acid lactic ca produs principal şi o serie de produşi
secundari ca diacetilul, acetoina, acidul acetic, alcoolul etilic şi CO2.
Fermentaţia lactica este frecvent întâlnită în cadrul metabolismului
microbian, cel mai adesea la bacterii şi mucegaiuri. Bacteriile lactice sunt
folosite industrial la producerea acidului lactic, în industria laptelui şi a cărnii,
în panificaţie, la conservarea produselor vegetale. Dintre mucegaiuri, unele
specii de Aspergillus, Mucor şi Penicillium pot produce acid lactic.
Bacteriile lactice au o largă răspândire în natură: în microbiota
intestinală, pe plante, în lapte, în cavitatea bucală şi pe piele, fiind destul de
pretenţioase din punct de vedere nutritiv. Ele pot fermenta pentozele, hexozele,
dizaharidele, acidul malic şi citric. Sursele de azot preferate sunt aminoacizii,
peptidele şi amidele, fără a folosi sărurile de amoniu. Aceste microorganisme
necesită de obicei în mediu factori de creştere cum sunt vitaminele B2, B6,
biotina, acidul pantotenic. Bacteriile lactice au un domeniu optim de pH cuprins
între 4-6 unităţi, sunt anaerobe sau facultativ anaerobe şi se dezvoltă într-un
domeniu larg de temperaturi (0-55 oC), fiind mezofile sau termofile. Bacteriile
lactice pot face
parte din următoarele patru grupuri taxonomice: 1) genul Streptococcus
(S. termophillus), 2) genul Lactobacillus (Lb. acidophillus, Lb. casei, Lb.
bifidum),
3) genul Leuconostoc (L. mesenteroides) şi 4) genul Pediococcus.

Bacterii lactice

Grupul este compus (dupa ultimele clasificari) din 13 genuri de bacterii

Gram-pozitive si anume: Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus,
Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,
Paralactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weisella.
In legatura cu bacteriile lactice dar considerate ca exterioare grupului
sunt genurile Aerococcus, Microbacterium si Propionbacterium, printre altele.
Desi grupul bacteriilor lactice are granite vag delimitate, principala
proprietate a acestora este producerea de acid lactic din hexoze. Ca organisme
fermentative, acestor bacterii le lipseste sistemul transportor de electroni sau
citocromii si isi obtin energia prin fosforilarea la nivelul substratului, prin
oxidarea carbohidratilor. Ciclul Krebs lipseste in cazul acestor microorganisme.
Dupa Kluyver, bacteriile lactice se impart in doua grupuri, in functie de
produsii finali rezultati in urma metabolismului glucozei. Bacteriile care
sintetizeaza acid lactic ca unic sau principal produs al fermentatiei glucozei
sunt denumite homofermentative. Bacteriile homolactice sunt capabile sa
elibereze de doua ori mai multa energie decat bacteriile heterolactice din
aceeasi cantitate de
glucoza.
Bacterii lactice homo si heterofermentative

Bacterii homofermentative Bacterii heterofermentative

Lactobacillus Lactobacillus

L. acidophilus L. brevis

L. casei L. buchneri
 L. delbruekii L. cellobiosus

L. helveticus L. fermentum

L. plantarum Leuconostoc

L. salivarius L. citreus

Lactococcus L. lactis

L. lactis L. mesenteroides

L. plantarum Carnobacterium

Pediococcus C. divergens

P. acidilactici Oenococcus

P. pentosaceus O. oeni

Streptococcus Weissella

S. bovis

S. salivarius

Subsp. Salivarius

Subsp. Thermophilus

Tetragenococcus

Vagococcus
 Căi de formare a produşilor principali şi secundari în fermentaţia lactică.

În funcţie de echipamentul enzimatic al bacteriilor lactice şi sursele de

carbon fermentescibile, biochimistul formării produşilor de fermentaţie este
diferit.
1) Bacteriile lactice homofermentative
Produc fermentarea anaerobă a hexozelor pe calea Embden – Mayerhof –
Parnas (EMP) până la formarea acidului piruvic, fiind lipsite de enzima piruvat
decarboxilază. Acidul piruvic devine acceptor de hidrogen.
În fermentaţia homolactică, forma predominantă a acidului lactic este
dependentă de stereospecificitatea lactatdehidrogenazei (lactococii formează
L(+) – lactat şi lactobacilii D(-) lactat), dar şi de prezenţa lactat racemazei, care
atunci când este activă în celula microbiană, rezultă prin fermentaţie, amestecul
racemic (D,L- lactat):

L-lactatdehidrogenază
L(+)lactat + NAD+ Piruvat + NADH + H+

D-lactatdehidrogenază
D(-)lactat + NAD+ Piruvat + NADH + H+

Lactat racemaza
L(+)lactat D(-)lactat
Ecuaţia globală a fermentaţiei homolactice:
 C6H12O6 + 2 ADP + 2Pi → 2 CH3-CHOH-COOH + 2 ATP (75 kJ)

Pentru a fi fermentate, glucoza, galactoza şi lactoza pot fi transportate ca

atare în celulă printr-un sistem activ de permeaze prezente la Streptococcus
salvarius subspecia thermophillus (SST) şi lactobacilli termofili, sau prin
transport activ catalizat de sistemul fosfotransferază – fosfoenolipiruvat (PT –
PEP) prezent la bacteriile de genul Lactococcus şi Lactobacillus sp., cu
formarea esterilor fosforici.
Lactoza sau lactozo-P în celula bacteriană sub acţiunea β-galactozidazei
(lactazei) este transformată în glucidele componente.

În fermentaţia homolactică se pot forma în cantităţi mici substanţe de aromă,

diacetil şi acetoină, fie prin metabolizarea glucidelor (genul Lactoccus), fie a
citraţilor care asigură o sursă suplimentară de acid piruvic.
Lactococii aromatizanţi (L. lactis-biovar diacetylactis, L. lactis ssp
cremoris) produc în lapte cantitaţi de 0,1-1,3 mg % diacetil care pot fi mărite
prin adaos de citrat, controlul acidităţii si al gradului de aerare.
 Acid acetic

Acid citric Acid oxalacetic Acid piruvic

Fig.1.Formarea acidului piruvic din citraţi

Lactobacillus delbruecki subspecia bulgaricus poate forma aldehidă acetică

din surse similare cu rol în formarea aromei specifice a iaurtului, atunci când
raportul între aldehida acetică şi diacetil este de 2,8.

2) Bacteriile lactice heterofermentative

Produc fermentaţia anaerobă a glucidelor (pentoze, hexoze) pe calea
pentozo- fosfatului (6P-gluconatului). Lactobacillus brevis produce prin
fermentaţia heterolactică: acid lactic, acid acetic şi CO2 în timp ce Leuconostoc
mesenteroides – acid lactic, etanol şi CO2.
Fermentaţia heterolactică se poate produce şi pe calea fructozo-6P, fară
formare de CO2 sub acţiunea bacteriei Lactobacillus bifidus, dupa ecuaţia
generală:

2C6H12O6 + 5 ADP + 5 P → 2 CH3-CHOH-COOH + 3 CH3-COOH + 5ATP

 Fermentaţia lactică dirijată este folosită în industrializarea laptelui unde se
folosesc culturi pure selecţionate de bacterii lactice la obţinerea produselor
lactate acide: lapte acru, chefir, lapte acidofil, sana, iaurt, smântînă fermentată,
a untului şi la fabricarea brânzeturilor.

Producerea de bacteriocine

Bacteriocinele sunt macromolecule ce conţin proteine cu masă moleculară

redusă cu un spectru antimicrobian restrâns. Lactococcus lactis supsp. lactis
produce nizina, care este cea mai utilizată bacteriocină recunoscută de GRAS
ca fiind lipsită de risc. Structural este o peptidă cationică policilică care conţine
dehidroalanină, dehidrobutrirină, lanthionină şi β metil lanthionină. Nu este
toxică, este stabilă la căldură şi la pH scăzut şi solubilitatea în apă scade cu
creşterea de pH; nu modifică proprietăţile senzoriale ale produselor. Nizina
favorizează formarea unor pori în membrana citoplasmatică a celulelor
sensibile ceea ce determină eflux de ATP, ioni de potasiu şi aminoacizi şi
pierderea potenţialului de membrană.
Bacteriocinele produse de bacteriile lactice inhibă celulele vegetative ale
bacteriilor Gram pozitive şi sunt bacteriostatice pentru endosporii de Bacillus
(B.cereus şi Cl.perfringens, Listeria, Staphylococcus). Bacteriile lactice pot fi
modificate genetic pentru obţinerea de tulpini înalt producătoare de nizină
deoarece biosinteza nizinei este codificată de o plasmidă ce poate fi manipulată
genetic şi transferată la o cultură starter performantă.
 Reprezintă o clasă specială de substanţe antibiotice cu acţiune bactericidă,
sintetizate de un număr mare de specii bacteriene purtătoare de informaţie
genetică specifică, conţinută în plasmide.
Principalele caracteristici ale bacteriocinelor sunt:
1) biosinteza bacteriocinelor (colicine, piocine, megacine etc.) este
codificată de gene plasmidiale;
2) prin contrast cu antibioticele uzuale, cele mai multe bacteriocine
au un spectru limitat de activitate;
3) se leagă de celulele sensibile prin intermediul unor receptori
specifici de pe suprafaţa acestora, ca şi bacteriofagii;
4) biosinteza are efect letal asupra celulei producătoare, care este
sacrificată pentru a elibera bacteriocinele care omoară ulterior celulele
sensibile din mediu;
5) în general, tulpinile producătoare sunt rezistente la propia lor
bacteriocină;
6) pot inhiba celule sensibile şi fără liză.
Bacteriocinele diferă prin specificitatea spectrului lor de activitate,
difuzibilitate, rezistenţă la temperatură, mobilitate electroforetică etc.

Formarea substanţelor de aromă

Laptele fermentat ce conţine numai acid lactic se caracterizează printr-un

gust acru nespecific. La prelucrarea industrială a laptelui, mai ales la obţinerea
produselor lactate acide, maturarea smântânei, fabricarea untului şi a
brânzeturilor, un rol important în producerea substanţelor de aromă revine
microorganisemelor selecţionate folosite drept culturi starter pentru declanşarea
proceselor microbiologice utile. Aroma produselor lactate este dată de
produsele secundare ale fermentaţiei lactice: CO 2, acid acetic, alcool etilic, acid
propionic, diacetil, aldehidă acetică, de produse rezultate prin hidroliza
enzimatică a proteinelor laptelui (peptide, aminoacizi), combinaţii cu sulf şi
prin lipoliză (acizi graşi).
Dintre bacteriile lactice aromatizante fac parte Lactococcus lactis ssp. lactis,
Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. lactis biovar
diacetylactis, Leuconostoc mesenterioides ssp. cremoris.

Culturi starter de bacterii lactice folosite în România

Din culturile microbiene utilizate la fabricarea produselor fermentate din

lapte fac parte următoarele:
-bacterii lactice mezofile: Lactococcus lactis, Lactococcus lactis ssp.
cremoris, Lactococcus lactis biovar diacetilactis, Leuconostoc mesenteroides
ssp. cremoris, Lactobacillus casei, pentru fabricarea tuturor tipurilor de
brânzeturi, smântână acidă, unt, lapte acru.
-bacterii lactice termofile: Streptococcus salivarius var. thermophillus
(SST), Lactobacillus helveticus, Lactibacillus plantarum şi Lactobacillus
delbrueckii subsp. Bulgaricus (LDB pentru iaurt, cumâs, brânzeturi cu pasta
tare)
Tab.1. Caractere morfologice ale bacteriilor din genul Lactobacillus folosite în
culturi starter
Proprietăţi Lb.delbruecki Lb. Lb.helveticus Lb. Lb.
i ssp. acidophillu case plantaru
bulgaricus s i m
Durata
coagulării
48-
laptelui (ore) 3-5 3-5 4-5 48-72
72
cu 3%
cultură
Aciditatea
limită în
350 300 300 180 180
lapte
o
Thorner
Formare:
-amoniac din
- - - - -
arginină
-CO2 din
- - - + -
lactoză
+ ± ± ± ±
-
Acetaldehidă
Temperatura
de creştere
în lapte, oC: - - - + +
10; + + + ± -
45; - - + - -
55
Temperaturi
de inactivare
75-80 70-80 75-80 72 72
a celulelor,
o
C
Temperaturi
de creştere,
o
C: 30
40-45 37-38 40 30
-Optim
Interval 15-
22-53 20-55 22-50 15-38
temperaturi 38
-eugenezice
Creştere în
lapte cu
± + + + +
NaCl 2%
- ± ± + +
4%
- - - + +
6%
 PRODUSE LACTATE FERMENTATE

Produsele lactate fermentate pot fi clasificate in doua grupe: produse

lactate fermentate si branzeturi. In produsele lactate fermentate toti constituentii
laptelui se regasesc in produsul final, cu exceptia celor metabolizati partial de
bacterii pe cand in branzeturi o parte din componentii laptelui au fost
indepartati odata cu zerul.

Compozitia si proprietatile laptelui

Cresterea microorganismelor utile si calitatea produsului fermentat sunt

influentate de compozitia si tipul laptelui folosit. Laptele de vaca are in medie
3,2% proteine, 4,8% lactoza, 3,9% lipide, 0,9% minerale, vitamine si restul apa.
Dintre proteine, cazeina in sistem coloidal sub forma de cazeinat de calciu este
prezenta in cantitate mai mare ca restul proteinelor, albumine si globuline.
Lactoza este principalul zahar in stare dizolvata, iar lipidele sunt dispersate sub
forma de globule de diferite dimensiuni in emulsie. Mineralele sunt dizolvate in
solutie si legate de cazeina coloidala. Vitaminele hidrosolubile sunt prezente in
faza apoasa iar cele liposolubile in grasimi. Componentele solide, aproximativ
12,8% sunt denumite solide totale ST, iar ST fara lipide reprezinta solide
negrase, 8,9%. Zerul contine in principal componente hidrosolubile, unele
grasimi si apa. Cresterea microorganismelor utile poate fi inhibata de unele
componente prezentein mod natural in lapte sau prin
contaminare. Substantele antimicrobiene naturale
sunt aglutininele si sistemul lactoperoxidaza-
izotiocianat. Aglutininele determina aglomerarea celulelor bacteriene starter si
le incetinesc metabolismul si cresterea; sistemul lactoperoxidaza-izotiocianat
inhiba de asemenea cresterea culturilor starter. Aceste substante antimicrobiene
sunt distruse prin tratament termic, de aceea cauzeaza probleme numai cand se
foloseste lapte proaspat. Laptele poate de asemenea sa contina antibiotice
utilizate fie in furajare fie pentru tratamentul unor infectii ca mastitele. Aceste
antibiotice pot afecta cresterea culturilor starter. Uneori in lapte pot exista
lipaze si proteaze termostabile sintetizate de unele bacterii psihrotrofe, ca
speciile de
Pseudomonas in timpul procesului de refrigerare inainte de pasteurizare.
Prezenta acestor enzime poate cauza scaderea cantitatii de branza obtinute,
proteoliza, rancezire. Toate aceste aspecte trebuie luate in consideratie inainte
de procesul de fermentatie.

Produse lactate fermentate

Exista numeroase tipuri de produse lactate fermentate in diferite zone

ale lumii, din care numai o mica parte sunt fermentate in conditii controlate, cu
microorganisme starter. Microflora predominanta a acestor produse este
reprezentata de mai multe specii de bacterii lactice si unele drojdii. Cele mai
cunoscute tipuri de produse lactate fermentate sunt prezentate mai jos.

Produsul lactat fermentat Cultura starter

Lapte batut Lactococcus, uneori impreuna cu

Leuconostoc cremoris

Iaurt Streptococcus thermophilus si

Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus; unele tipuri de iaurt pot
contine Lab. acidophilus, casei,
rhamnosus si Bifidobacterium spp

Lapte acidofil Lab. Acidophilus

Lapte Bifidus Bifidobacterium spp.

Kefir Drojdii si specii de

Leuconostoc, Lactobacillus si
Lactococcus
 Kumiss Lab. delbrueckii subsp. bulgaricus si
drojdii

Microbiologia fermentarii iaurtului

Iaurtul este o masa semisolida rezultata prin coagularea laptelui

(degresat sau cu grasime) in prezenta bacteriilor din culturile starter. Iaurtul are
un gust acru caracteristic si o aroma datorata efectelor combinate ale
urmatorilor compusi: acetaldehida, lactat, diacetil si acetat. In comert exista mai
multe tipuri de iaurt: iaurt simplu, cu fructe, aromatizat si colorat, de baut,
indulcit, inghetat, uscat, cu continut scazut de lactoza sau carbonatat.
Producerea iaurtului se face in general in sarje, dar se cunoaste si
procedeul continuu. Un exemplu de proces pentru iaurtul cu continut scazut de
grasime este urmatorul:
1. Omogenizarea laptelui (12% ST- solide totale) + adaugare de
stabilizator (1%) (pentru structura dorita a gelului)
2. Incalzire la 85C (pasteurizare) timp de 30 minute si racire la 43C.
Pasteurizarea are drept scop distrugerea formelor vegetative ale
microorganismelor precum si destabilizarea usoara a cazeinei pentru
formarea gelului;
3. Adaugarea culturii starter, incubare la 43C pana la pH 4,8 un timp
de aproximativ 6 ore. Bacteriile starter pot fi adaugate in stare
congelata sau proaspata (2-3%);
4. Racire rapida la 30C in aproximativ 30 minute pentru incetinirea
cresterii bacteriilor starter, agitare si pompare in masina de umplere
5. Ambalare in recipienti si racire fortata cu aer la 4C pentru stoparea
cresterii microorganismelor
6. Pastrare 24 ore, timp in care pH scade la 4,3.
 Cultura starter
Cultura starter poate fi utilizata atat in forma congelata cat si
proaspata, in vrac. Bacteriile utilizate sunt Lactobacillus delbrueckii
ssp. bulgaricus si Streptococcus thermophilus. Se mai pot folosi si
amestecuri ale acestor doua specii cu alte bacterii ca L. acidophilus,
Bifidobacterium spp., L.rhamnosus, L. casei, care totusi nu au o
crestere optima in combinatie cu L. bulgaricus si S. thermophilus si de
aceea se introduc in numar mare dupa fermentatie si inainte de
ambalare. Cu toate acestea pot sa nu supravietuiasca in iaurt alaturi de
cultura starter initiala.
Pentru un bun iaurt, proportia dintre Streptococcus: Lactobacillus
trebuie sa fie de 1:1 numar de celule iar in produsul final raportul nu
trebuie sa depaseasca 3:2. Pentru cresterea optima a celor doua specii,
fermentatia trebuie sa se desfasoare la 43°C, temperatura la care atat
compusii acizi cat si cei de aroma sunt produsi la nivelul dorit. Daca
temperatura creste peste 43°C, va predomina specia de Lactobacillus,
producand mai mult acid si mai putina aroma: sub valoarea de 43°C
este favorizata cresterea speciei de Streptococcus formand un
produs mai putin acid dar cu mai multa aroma.
Cele doua specii au o crestere simbiotica in lapte. Initial specia
de Streptococcus creste rapid in prezenta oxigenului dizolvat si
produce acid formic si CO2. Conditiile de anaerobioza, acidul formic si
CO2 stimuleaza cresterea speciei de Lactobacillus, care sintetizeaza
exoproteinaze si peptidaze care produc peptide si aminoacizi din
proteinele din lapte. Unii aminoacizi ca glicina, valina, histidina,
leucina si metionina sunt necesare pentru cresterea Streptococcus sp.
lipsit de enzime proteolitice. Aceasta specie va creste rapid pana cand
pH ul scade la valori mai mici de 5,5, dupa care viteza de crestere
scade. Totusi cresterea speciilor Lactobacillus sp. continua destul de
rapid pana la racirea laptelui la 30°C cand pH ajunge la 4,3. La
temperatura de 4C cresterea este stopata pentru ambele specii.
 CURS 4

Branzeturi
Branza este produsa prin coagularea cazeinei din lapte in prezenta
acidului lactic produs de bacteriile lactice, cu sau fara enzima renina, urmata de
colectarea cazeinei si alte operatii cum este maturarea. Se considera ca
producerea branzei a fost descoperita in mod accidental in Orientul Mijlociu in
anii 7000 i.c. In prezent se cunosc in lume o mare varietate de tipuri de
branzeturi, pentru care se utilizeaza mai mult de 20% din totalul de lapte
produs. O clasificare a tipurilor de branzeturi in functie de culturile starter si
flora secundara folosite este prezentata mai jos:

1. Branza nematurata
Branza nematurata moale
Branza proaspata de vaci se obtine folosind starteri ca
Lactococcus lactis ssp. lactis si cremoris si Leuconostoc mesenteroides ssp.
cremoris.
Mozzarella – este fermentata cu Streptococcus thermophilus si
Lab. delbrueckii ssp. bulgaricus.

2. Branza maturata
Branza maturata moale
Branza Brie obtinuta cu bacteriile starter Lac. lactis , fungi din genul
Penicillium si drojdii ca flora secundara.
Branza maturata semitare
Branza Gouda fermentata cu bacteriile starter Lac. lactis si
Leuconostoc; ca flora secundara se poate folosi Propionbacterium.
Branza albastra fermentata cu Lac. lactis, Leuconostoc; ca flora
secundara se utilizeaza Penicillium roqueforti, drojdii si micrococi.
Branza maturata tare
Branza Cheddar cu bacterii starter din specia Lac. lactis, iar ca flora
secundara unii lactobacili si pediococi.
 Branza elvetiana cu starteri din speciile Str. thermophilus, Lab.
helveticus, Propionbacterium; ca flora secundara pot fi folositi enterococi.

Microbiologia branzei proaspete de vaci

Branza proaspata de vaci este produsa din lapte degresat sau cu continut
redus de grasime si are o textura moale cu aproximativ 80% apa. Este o branza
nefermentata cu aroma de unt datorata diacetilului. Producerea acestui tip de
branza are la baza urmatoarele etape:
1 Pasteurizarea laptelui, racirea la 22C, adaugarea culturilor starter si
incubare timp de 12 ore la pH 4,7.
2. Dupa formarea casului, se taie in cuburi si se mentine la 51C timp de
50 minute sau mai mult.
3. Scurgerea zerului
4. Adaugarea sarii si a agentilor de conservare
5. Ambalare si refrigerare

PRODUSE FERMENTATE DIN CARNE

Produsele fermentate din carne sunt preparate prin amestecarea

urmatoarelor ingrediente: carne, grasime, sare, zahar, agenti de maturare si
condimente.Dupa operatia de amestecare urmeaza introducerea amestecului in
membrane si fermentarea fie naturala fie controlata, caz in care trebuie
adaugate in amestec culturi bacteriene starter. Acizii produsi de culturile starter
in timpul fermentatiei si agentii de maturare au rolul de a impiedica cresterea
bacteriilor patogene si de alterare prezente in carne. In functie de tipul lor,
produsele fermentate din carne pot fi uscate pentru reducerea aw, afumate sau
tratate termic pentru a fi sigure pentru consum.
Produsele fermentate din carne isi au originea probabil in tarile
mediteraneene de unde cunoasterea prepararii lor s-a raspandit in Europa si in
America de Nord. Cele mai consumate produse in aceste zone par a fi carnatii
uscati si semiuscati obtinuti de obicei de micii fabricanti cu bacterii starter prin
fermentatie controlata. Culturile starter utilizate pot fi sub forma congelata sau
liofilizata pentru inocularea directa in amestecul de carne. Carnatii uscati si
semiuscati includ mai multe tipuri ca pepperoni, salam Genoa, salam de vara,
salam uscat, beef sticks, thuringer, salam italian. Majoritatea sunt preparate din
carne de vita sau porc, dar in ultimii ani au inceput sa se produca si din pui si
curcan.

Microbiologia carnatilor semiuscati

Carnatii semiuscati includ carnatii de vara, thuringer si salamul
semiuscat. Compozitia medie este 30% grasime, 20% proteine, 3% minerale
(sare) si 47% apa. Au in general un gust usor acru, cu o aroma placuta rezultata
din efectul combinat al lactatului, acetatului si diacetilului, alaturi de unii
compusi de proteoliza si lipoliza. Utilizarea condimentelor contribuie la
imbogatirea aromei iar preparatele care contin nitriti au o culoare roz
caracteristica.
Etapele procesului de obtinere a carnatilor semiuscati sunt:
1. Obtinerea amestecului omogen de carne, saruri, glucoza, agenti de
maturare, condimente si culturi starter;
2. Umplerea membranelor, fermentare la 29 – 43 C si umiditate
relativa 80-90%;
3. Incubare pana la valori de pH mai mici de 5,2-4,6, incalzire la 60C
temperatura interna si racire la 10C;
4. Pastrare la 5-10C timp de 3-4 zile, ambalare sub vid; preparatele se
consuma direct.
Agentii de maturare contin nitriti astfel incat concentratia finala in
produs sa fie de 100 ppm. Fermentatia dureaza de obicei 8-12 ore, pana cand
pH-ul scade la valoarea dorita. Fermentatia poate avea loc in incinte de
afumare.

Culturile starter utilizate in fermentatia controlata pot fi in stare

congelata sau uscata, pentru a se ajunge la o concentratie finala de 10 6-7 celule/g
amestec. Culturile starter nu trebuie amestecate direct cu sarurile, agentii de
maturare si
condimentele care le pot distruge si de aceea ele sunt introduse imediat in
carne. Starterii difera in functie de temperatura de fermentatie si de pH-ul final
al produsului dorit. In cazul temperaturilor mari si pH scazut se prefera
Pediococcus acidilactici; pentru temperaturi mici si pH crescut este utilizat
Lab. plantarum, iar specia Pediococcus pentosaceus poate fi folosita in ambele
situatii. Ca flora secundara se adauga Micrococcus spp. sau Staphilococcus
carnosus care au efecte benefice asupra culorii produsului. De asemenea, la
prepararea carnatilor fermentati natural, se utilizeaza Lab. sake, Lab. curvatus
si Leuconostoc spp.
PRODUSE VEGETALE FERMENTATE

Aproape toate materiile vegetale pot fi fermentate in mod natural,

deoarece au pe suprafata lor numeroase bacterii lactice. In prezent se cunosc
multe tipuri de produse vegetale fermentate obtinute in special la scara mica,
dar si la nivel industrial. Cele mai utilizate vegetale pentru fermentatie sunt
varza, maslinele, castravetii, morcovii, telina, fasolea, porumbul, tomatele,
conopida, ardeii, ceapa, lamaile, sfecla, napii, ridichile. Majoritatea sunt
fermentate in mod natural, dar unele, cum sunt castravetii sunt fermentate
controlat.

Varza murata
Varza poate fi pusa la fermentat intreaga sau maruntita. Procesul de obtinere
are trei etape principale:
1. Spalare, maruntire fina si uniforma
2. Presarea verzei pentru eliminarea aerului si adaugarea sarii in straturi
(2,25%);
3. Acoperirea la suprafata pentru eliminarea aerului si fermentarea la 18C
timp de 2 luni.

Maruntirea are drept scop eliberarea zaharurilor fermentescibile (3-6%) din

celulele verzei iar presarea creaza conditiile de anaerobioza care inhiba
cresterea aerobilor. Sarea stimuleaza cresterea unor bacterii lactice si impiedica
dezvoltarea bacteriilor nedorite si actiunea enzimelor pectolitice care inmoaie
varza. Temperatura de 18C determina o crestere rapida a bacteriilor lactice utile
si incetineste dezvoltarea bacteriilor nedorite. In varza exista de asemenea
inhibitori naturali care au efect asupra bacteriilor de alterare.
PREPARATE PROBIOTICE

Definitia termenului de probiotic deriva din limba greaca si inseamna

“pentru viata”. La inceput, acest termen a fost folosit pentru a denumi o
substanta microbiana care stimula cresterea altor microorganisme (Lilley si
Stillwell, 1965) sau un extract tisular care favorizeaza cresterea microbiana
(Sperty 1971), dar nu a fost acceptat. In 1974 Parker a fost primul autor care a
utilizat termenul de probiotic pentru s defini organisme si substante care
contribuie la echilibrul florei intestinale. Fuller (1989) a definit probioticele ca
suplimente continand microorganisme care influenteaza in mod benefic
sanatatea organismelor gazda, echilibrand flora intestinala. Cea mai acceptata
definitie din ultima perioada este ca probioticele sunt “organisme vii
administrate in anumite cantitati, care confera efecte benefice pentru sanatatea
gazdei” (FAO/WHO, 2002).
Originea probioticelor datează din 1903, când în studiile lui,
Metchinikoff descrie efectele benefice ale folosirii lactobacililor din iaurt. Cele
mai cunoscute probiotice s-au obţinut pe substraturi de origine animală (lapte
de la diferite specii), domeniul probioticelor de origine vegetală fiind mult mai
puţin dezvoltat.
În 1974 termenul de probiotic a fost utilizat de Parker pentru a defini
“organismele sau substanţele care contribuie la echilibrul microbian al
intestinului”. Sunt culturi individuale sau mixte de microorganisme vii şi
nepatogene, susceptibile să influenţeze favorabil sănătatea fiinţei umane sau
animalului care le ingerează.La om, acţiunea preparatelor probiotice se
manifestă în cavitatea bucală sau în tubul digestiv (sub formă de alimente sau
capsule), în căile respiratorii (ca aerosoli) sau în cele genito – urinare (prin
aplicaţii locale). Probioticele sunt microorganisme benefice care intră în
alcătuirea florei intestinale.

Modul de acţiune a probioticelor

  probioticele inhibă proliferarea bacteriilor patogene prin producerea de
acizi organici şi prin reducerea pH-ului;
 prin enzimele proprii, probiotiocele măresc utilizarea digestivă a hranei
precum şi procesele de detoxifiere;
 probioticele întăresc sistemului imunitar acţionând ca barieră pentru
tubul digestiv, fiind demonstrat că administrarea de preparate cu
Lactobacillus poate stimula producţia de gamma globuline, gamma
interferoni şi intensifică activitatea macrofagelor responsabile de
îndepărtarea agenţilor patogeni din organism;
 probioticele stimulează producţia de vitamine aparţinând în general
grupului B şi determină creşterea activităţii lactazei, sucrazei şi
maltazei;
 proliferează în tractul digestiv şi sunt în competiţie cu bacteriile patogene.

Procesul de productie si depozitarea produselor probiotice necesita

mentinerea unui numar garantat de celule viabile pana la expirarea termenului
de utilizare. Numarul de celule vii depinde de tulpinile probiotice utilizate si de
efectele benefice scontate dar, ca regula generala trebuie sa se asigure un minim
de 109 unitati formatoare de colonii (UFC)/consum (Forssten, Sindelar, &
Ouwehand, 2011). Cele mai disponibile tulpini probiotice apartin genurilor
Bifidobacterium si Lactobacillus, alte specii microbiene fiind utilizate dar mult
mai rar.

Matricea produsului alimentar are un rol important in stabilitatea

probioticelor (Forssten et al., 2011), de care fabricantii trebuie sa tina seama.
Totusi, acest rol este mai putin cunoscut. Asa de exemplu, bacteriile probiotice
care apartin genurilor Bifidobacterium si Lactobacillus cresc bine in lapte care
este si mediul lor natural.
In produsele lactate probiotice, bacteriile sunt de obicei insotite de
culturi starter ca Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus si/sau
Staphylococcus thermophilus. Includerea culturilor starter in produsul probiotic
se face din mai multe motive: culturile starter confera textura si aroma
produselor si in plus bacteriile probiotice cresc mult mai bine in simbioza cu
bacteriile starter.
Pe langa produsele lactate fermentate, bacteriile probiotice pot fi incluse
in laptele nefermentat, produs comercializat sub denumirea de lapte acidofil
dulce “sweet acidophilus milk”. In plus, probioticele pot fi introduse in
branzeturi, fiind stabile in timpul maturarii acestora. Prin optimizarea
tehnologiei de fermentatie este posibila producerea de branza de buna calitate
cu continut crescut de bacterii probiotice, astfel incat o portie standard de
branza sa asigure un numar de cel putin 106 UFC (Ibrahim et al., 2010).
In afara de produsele lactate, in tarile din Asia sunt comune alimentele
din soia fermentata care pot fi suplimentate cu probiotice si sunt numite iaurt de
soia “soy yogurts”, consumate in special de categoriile vegetariene sau vegane
de polulatie.
De asemenea, legumele, cerealele si fructele fermentate, desi nu sunt
considerate probiotice, au o influenta benefica asupra sanatatii, in mod
asemanator. Au fost efectuate studii care au demonstrat ca aceste preparate pot
fi matrice favorabile pentru dezvoltarea si stabilitatea bacteriilor probiotice.
Fermentatia lactica a cerealelor contribuie de altfel si la imbunatatirea aromei,
reduce actiunea acidului fitic (care leaga ionii de minerale, Fe si Zn in special)
si produce vitamine predominant din grupul B. (Nout, 2009).
Bacteriile probiotice au fost introduse cu succes in inghetata bazata pe
iaurt ca materie prima, care are de fapt un proces de productie asemanator
iaurtului probiotic. (Davidson, Duncan, Hackney, Eigel, & Boling, 2000).
Cel mai comun format pentru probiotice sunt in ultima vreme
suplimentele alimentare. De asemenea, bacteriile probiotice au fost incluse si in
sucurile de fructe si ciocolata (Vriens, 2009).
 In ultima perioada au inceput sa fie utilizate tulpini noi pentru obtinerea
de preparate cu probiotice cum sunt speciile de Propionbacterium si
Lactococcus sau chiar Roseburia si Clostridium intalnite in fermentatia butirica.
In plus, se anticipeaza folosirea bacteriilor probiotice modificate genetic, ca de
exemplu tulpini de Lactococcus lactis producatoare de interleukina 10,
important antiinflamator si imunosupresor, pentru tratamentul bolii Crohn
(Braat et al., 2006).
 Preparate prebiotice

Efectul benefic al probioticelor depinde de prezenta lor in numar mare in

tractul gastrointestinal, fie prin consumul acestor bacterii in numar mare, fie
prin stimularea cresterii lor rapide cu nutrienti corespunzatori. De exemplu,
pentru stimularea cresterii bacteriilor din genul Bifidobacterium se pot utiliza
surse selective de carbon si energie care nu sunt metabolizati de bacteriile din
intestinul subtire si din colon, dar care sunt o sursa de nutrienti pentru
bifidobacterii. Acesti nutrienti au fost denumiti prebiotice si definesc
ingrediente alimentare nedigerabile cu efect benefic asupra gazdei prin
stimularea cresterii sau activitatii uneia sau mai multor bacterii din colon, cu
actiune pozitiva asupra sanatatii. Asemenea prebiotice sunt lactuloza,
lactitolul, fructooligozaharidele, galactooligozaharidele, lactosucroza si
inulina.
In legatura cu probioticele si prebioticele poate fi considerat si termenul de
simbiotic, pentru a denumi un produs care contine probiotice si prebiotice
impreuna, care determina o crestere mai buna a tulpinilor selectionate.
FERMENTAŢIA ALCOOLICĂ
Fermentaţia alcoolică reprezintă procesul anaerob prin care glucidele
fermentescibile sunt metabolizate prin reacţii de oxido-reducere sub acţiunea
echipamentului enzimatic al drojdiilor în alcool etilic şi CO2 ca produşi
principali şi alcooli superiori, aldehide şi alţi compuşi ca produşi secundari.
Ecuatia fermentatiei alcoolice este urmatoarea:

C6H12O6+2ADP+2Pi→2CH3-CH2OH +2CO2+2ATP

Agenţii tipici ai fermentaţiei alcoolice sunt drojdiile genului

Saccharomyces, care pot produce alcool etilic în concentraţii mai mari de 8%.
Bacteriile pot de asemenea să fermenteze substraturile dulci, dar produc
cantităţi mai mici de alcool şi pe alte căi metabolice. Dintre acestea fac parte
Zymomonas mobilis, Bacillus macerans, Clostridium acetonoetilicus etc.
Unele mucegaiuri produc fermentaţia substraturilor dulci, cum sunt cele din
familia Mucoraceae, Aspergillus oryzae, Penicillium glaucum şi altele. Dintre
mucegaiuri, Monascus purpureus este utilizat de secole in tarile asiatice pentru
producerea vinului de orez.

Drojdiile care produc fermentarea substraturilor dulci se caracterizează

prin următoarele proprietăţi:

Puterea alcooligenă care se referă la concentraţia de alcool ce se poate

produce în mediile cu zaharuri, drojdiile de vin şi spirt putând determina o
acumulare de alcool de 16-18 grade alcoolice, în timp ce speciile cu putere
alcooligenă slabă sunt inhibate la o concentraţie în alcool de 4-6%. Această
proprietate este în strânsă legătură cu alcoolorezistenţa, care se referă la
capacitatea drojdiei de a continua fermentaţia la o concentraţie de peste 8%
alcool.

Sulfitorezistenţa reprezintă proprietatea drojdiilor utilizate în industria

fermentativă de a se adapta la concentraţii de 200-300 mg SO2/litru.
 Alte proprietăţi ale drojdiilor sunt capacitatea de floculare şi pulverulenţă,
osmotoleranţa, frigofilia şi caracterul killer (care se referă la capacitatea unor
tulpini de drojdie de a produce o toxină cu efect inhibitor asupra altor drojdii
sensibile).

Fermentaţia alcoolică este influenţată de o serie de factori care pot fi de

natura biologică, când se referă la natura microorganismelor care produc
fermentaţia şi factori fizico-chimici care depind de mediul supus fermenţiei şi
de condiţiile externe.

Factori biologici

S-a stabilit că fermentaţia alcoolică este datorată enzimelor elaborate de

celula de drojdie, numite complex zimazic, format din 15 enzime care
catalizează procesele de oxidoreducere ale zaharurilor şi în final producerea de
alcool etilic.

Natura enzimatică a fermentaţiei alcoolice

După ce Pasteur a descris fermentaţia alcoolică ca fiind un proces

biologic complex, Buchner, în 1897, a demonstrat natura enzimatică a acesteia.

Degradarea hidraţilor de carbon şi transformarea lor în alcool etilic

presupune un mecanism cuprinzând reacţii enzimatice succesive, reacţii ce au
loc în prezenţa şi cu aportul adenozin şi tiamin fosfaţilor şi coenzimei A,
precum şi a unor vitamine hidrosolubile ca B1, B2, B5, B6, PP, ş.a.

Principalele enzime implicate în secvenţele succesive ale acestui

mecanism sunt:
 - în etapa de fosforilare şi formare a trizofosfaţilor:
hexokinaza, fosfoglucoizomeraza, fosfofructokinaza, aldolaza, ş.a.;

- în etapa de dehidrogenare a aldehidei fosfoglicerice:

glicerofosfatdehidrogenaza, fosfogliceratkinaza, ş.a.;

- în etapa de producere a acidului piruvic: glicerofosfatmutaza, enolaza;

-în etapa formării alcoolului etilic: alcooldehidrogenaza.

Un alt factor biologic care influenţează fermentaţia alcoolică este spectrul

de fermentare a zaharurilor, fiecare tulpină de drojdie fiind capabilă să
fermenteze un număr limitat de glucide. În general drojdiile din specia
Saccharomyces cerevisiae pot fermenta D-glucoza, D-manoza, D-
fructofuranoza, D-galactoza, zaharoza, maltoza, rafinoza. Dizaharidele,
trizaharidele, polizaharidele pot fi fermentate numai după ce sunt hidrolizate de
enzimele drojdiilor sau de enzime adăugate intenţionat pentru disponibilizarea
substratului necesar fermentaţiei.

Factori fizico-chimici

Compoziţia mediului de fermentare: diferitele componente ale mediului de

cultură pot fi metabolizate în mod diferit în funcţie de substanţele existente sau
adăugate.

Concentraţia de zahăr: la concentraţii de până la 5-12% concentraţia de zahăr

influenţează direct proporţional viteza de fermentare, la concentraţii mai mari
drojdiile sensibile fiind inhibate. Drojdiile utilizate în procesele industriale
fermentative au o osmotoleranţă bună şi de aceea suportă concentraţii relativ
ridicate de zaharuri (în mustul de struguri zahărul poate ajunge la o concentraţie
de 25% când strugurii sunt dulci)

Concentraţia în alcool: drojdiile slab rezistente la acest factor sunt inhibate la

4-6 grade alcoolice, iar fermentarea este produsă în aceste condiţii de tulpinile
alcoolorezistente.

pH-ul: în funcţie de pH, fermentaţia se desfăşoară în două forme: 1)

fermentaţie alcoolică propriu-zisă, la valori de 3,5-5 unităţi de pH cand produşii
principali sunt alcoolul etilic şi CO2 şi 2) fermentare la pH alcalin, când în afară
de alcool etilic şi CO2 se formează în cantitate mare glicerol (până la 30% din
zaharul fermentat).

Temperatura: fermentaţia alcoolică poate avea loc între 0-35 oC. De exemplu,
în funcţie de procesul fermentativ, temperaturile optime sunt: 28-30 oC pentru
drojdia de spirt şi de panificaţie (Saccharomyces cerevisiae), 6-12 oC pentru
drojdia de bere (Saccharomyces carlsbergensis) şi de 15-20 oC pentru drojdiile
de vin (Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus)

În fermentaţia alcoolică rezultă o serie de produşi secundari din diferite clase:

- glicerolul se acumulează în mod normal în concentraţii de 3% şi are rol

benefic asupra catifelajului vinului în care se formează

- aldehidele dintre care cea mai importantă, aldehida acetică, influenţează direct
gustul produsului final

- acizii conferă aciditatea vinului şi pot fi acid acetic, formic, propionic, butiric,
lactic, succinic.

Obtinerea aluatului in panificatie

Painea este unul din cele mai vechi alimente si este produsa cu ajutorul
microorganismelor. Utilizarea drojdiei la cresterea aluatului este pictata in
frescele din Egiptul antic.
In fabricarea painii, drojdia este crescuta in conditii aerobe, in scopul obtinerii
unui volum maxim de CO2 si acumulare minima de alcool, deci printr-un
proces in care sa fie preponderenta calea metabolica a respiratiei celulare.
Fermentatia painii implica mai multe etape: alfa- si beta amilaza prezente in
aluatul umed elibereaza maltoza si glucoza din amidon. Apoi se adauga o
tulpina de Saccharomyces cerevisiae care contine maltaza, invertaza si
complexul zimazic. CO2 produs de drojdie determina textura afanata a painii
iar cantitatile mici de produse de fermentatie contribuie la gustul si aroma
produsului. De obicei brutarii adauga drojdie suficienta pentru ca aluatul sa
creasca in maxim 2 ore, deoarece in timp mai indelungat se pot dezvolta
bacterii si mucegaiuri de contaminare care altereaza painea. Prin utilizarea unor
combinatii de microorganisme pot fi obtinute tipuri speciale de aluaturi mai
acide. Drojdia Saccharomyces exiguus impreuna cu specii de Lactobacillus
produce o aroma caracteristica acestor aluaturi. Produsele de panifinatie pot fi
contaminate cu specii de Bacillus care produc boala intinderii painii, care
altereaza calitatile senzoriale.

FERMENTAŢIA PROPIONICĂ
Fermentaţia propionică este un proces biochimic anaerob, prin care
substratul fermentescibil, acidul lactic, este transformat prin reacţii enzimatice
datorate enzimelor specifice bacteriilor propionice, în acid propionic, acid
acetic şi CO2. Bacteriile care produc fermentaţia propionică aparţin genului
Propionbacterium, dar şi genurilor Clostridium şi Veillonella.

3CH3-CHOH-COOH→2CH3-CH2-COOH+CH3-COOH+CO2+H2O
 Fermentaţia propionică are importanţă specială în producerea
brânzeturilor maturate cu pastă tare şi goluri interioare (tip Schweitzer), cărora
le imprimă, în afara incluziunilor alveolare, caracteristici organoleptice
specifice şi o valoare nutritivă ridicată. Totodată, bacteriile propionice
produc, la maturarea pâinii, o fermentaţie suplimentară, transformând acidul
lactic în acid propionic şi dioxid de carbon, îmbunătăţind gustul şi creşterea în
volum a pâinii. Printre cele mai importante din punct de vedere al utilităţii în
domeniul agroalimentar, se amintesc: Propionibacterium freudenreichii van
Niels sinonim cu Bacterium acidi propionici, Propionbacterium shermanii,
bacterii utile în sectoarele produselor lactate şi de panificaţie şi
Propionibacterium rubrum van Niels, bacterie ce formează petele roşii pe
brânzeturi, Clostridium propionicum
Neillonela, ş.a., fără importanţă industrială.
Fiziologic, bacteriile propionice pot folosi ca substrat de fermentaţie
diverse hexoze (glucoză, lactoză, maltoză), acizi organici (lactic, malic),
glicerină, iar ca surse de azot – peptone, peptide, aminoacizi. Sunt bacterii
mezofile, cu temperatura optimă în jur de 30 oC, acţionând în medii neutre, slab
acide (pH optim 6,5-7). Valori de temperatură de peste 60 oC le inactivează, ca
de altfel şi concentraţii de clorură de sodiu mai mari de 4%.
FERMENTAŢIA MALO-LACTICĂ
Fermentaţia malo-lactică este un proces biochimic datorat
microorganismelor, sub acţiunea cărora acidul malic, aflat în fructele necoapte,
este transformat în acid lactic şi dioxid de carbon. Prin acest proces, aciditatea
crescută a fructelor se reduce cu peste 30%, datorită faptului că o parte din
acidul malic se transformă în dioxid de carbon (0.33g CO2/g acid malic).
Agenţii fermentaţiei malo-lactice. Având o deosebită importanţă în
vinificarea strugurilor necopţi sau cu aciditate ridicată, această fermentaţie este
produsă de unele bacterii lactice din genurile: Lactobacillus, Leuconostoc şi
Pedicoccus cum sunt Bacterium gracile, Micrococcus malolacticus, M.
multivorax, M. variococcus, Streptococcus malolacticus, S. mucilaginosus vini,
Pedicoccus vini.
Mecanismul fermentaţiei malo-lactice
Secvenţele succesive de transformare a acidului malic în acid lactic şi
dioxid de carbon sunt următoarele:
Acidul malic, în prezenţa difosfopiridin nucleotidei (DPN) şi a ionilor de
magneziu se transformă, sub acţiunea enzimei malat-dehidrogenaza în acid
oxal- acetic;
Acidul oxal-acetic este decarboxilat în acid piruvic, agentul de reacţie fiind
enzima oxal-acetat decarboxilaza;
Acidul piruvic este redus de lactatdehidrogenaza în acid lactic şi dioxid de
carbon.
Importanţa fermentaţiei malo-lactice
În anii în care strugurii nu se coc suficient iar vinurile au o aciditate
ridicată, prin reducerea acidităţii datorită acestei fermentaţii, vinurile devin mai
catifelate şi mai agreabile la gust. Ca principiu, se poate spune că o fermentare
lactică dirijată prin selecţionarea naturală a unor bacterii lactice
heterofermentative va avea ca efect favorizarea reducerii conţinutului de acid
malic. Aceasta este posibilă prin: tragerea mai rapidă a vinului de pe drojdie,
agitarea mai energică a drojdiei, sulfitarea mustului, menţinerea temperaturii în
domeniul optim al bacteriilor heterofermentative, diluarea mustului şi
suplimentarea concentraţiei de zaharuri, adăugarea unui vin cu pH sub 3,6
mustului ce fermentează etc.
FERMENTAŢIA BUTIRICĂ
Fermentaţia butirică reprezintă un proces biologic anaerob prin care
bacteriile butirice metabolizează diverse surse de carbon, în special
hidrocarbonaţi, transformându-le în acid butiric şi gaze - CO2 si H2. În funcţie
de specie şi condiţii de fermentare se mai pot forma pe căi derivate de la
fermentaţia butirică propriu-zisa diverşi solvenţi: butanol, propanol, etanol,
acetonă.

C6H12O6+3ADP+3Pi→CH3-CH2-CH2-COOH+2CO2+2H2+3ATP
Bacteriile butirice aparţin în marea lor majoritate, (cca. 100 de specii)
genului Clostridium din familia Bacillaceae, fiind raspandite in sol prin materii
de dejectie. Bacteriile butirice se gasesc în pământ, cereale, produse lactate,
conserve, materii fecale etc., efectul prezenţei lor fiind, în majoritatea cazurilor,
nedorit. Produselor agricole şi alimentare le depreciază calitatea (produc
bombajul conservelor şi balonarea târzie a brânzeturilor, imprimă un gust
specific neplăcut unor băuturi alcoolice etc.). Morfologic, bacteriile
butirice se prezintă sub formă de bastonaşe care sporulează uşor.
Înainte de sporulare ele se măresc şi iau forma de măciucă sau de fus,
iar unele specii formează în interiorul celulei, înainte de a sporula, o substanţă
de rezervă, cunoscută sub numele de granuloză (asemănătoare cu amidonul),
sintagma ce a stat la originea denumirii unor specii: Granulobacter. Bacteriile
butirice se caracterizează prin capacitatea de formare a endosporilor
deformanţi, având dimensiuni mai mari decât celula vegetativă în care au
apărut. Endosporii sunt o formă de rezistenţă îndelungată în condiţii de mediu
foarte diferite, a cărei distrugere nu se poate realiza decât prin sterilizare (121
o
C timp de 4-10 minute, în mediu cu vapori de apă). Bacteriile butirice sunt
bacterii mezofile sau termofile şi necesită un pH apropiat de neutru. Unele
specii ale genului sunt patogene, ca de exemplu Clostridium botulinum,
Clostridium perfringens şi altele.
Bacteriile butirice au un echipament enzimatic foarte diversificat,
permiţându-le să folosească ca mediu de dezvoltare substrate poliglucidice,
proteice, pectine cu macromolecule complexe, dar şi compuşi chimici mai
simpli ca de exemplu monoglucide, acizi organici (lactic, propionic), alcooli
(glicerina), compuşi cu azot etc.
În raport cu produsul finit al fermentaţiei, bacteriile butirice pot fi
clasificate după cum urmează:
1. Bacterii butirice propriu-zise (zaharolitice), din care câteva specii sunt mai
importante: Clostridium saccharobutiricum, Cl. tyrobutiricum, Cl.
pasteurianus, Cl. nigricans;
2. Bacterii butirice producătoare de solvenţi ce metabolizează de asemenea
compuşii hidrocarbonaţi, dar produc după fermentaţia butirică, alcool etilic,
acetonă, alcooli propilic, butilic, pentilic. Din aceasta grupa fac parte
Clostridium buthyricum, Cl. acetoaethylicum, Bacillus macerans;
3. Bacterii peptonolitice, reprezentând o grupă de bacterii de putrefacţie, ce
foloseşte ca substrat peptone, peptide, aminoacizi şi alţi compuşi organici
conţinând azot (de exemplu ureea), dintre care menţionăm: Clostridium
sporogenes, Cl. hystoliticum, Cl. stiklandi (bacterii alterante ce produc
bombarea conservelor), Cl. botulinum, Cl. perfringens (agenţi ce produc toxine
grave pentru om şi animale).
4. Bacterii producătoare de acid propionic, cum este C. propionicum, care
folosesc alanina şi treonina ca substrat pe care îl fermentează la acid propionic
şi acid acetic.
5. Bacterii producătoare de acid acetic reprezentate de Cl. aceticum.

Fermentaţia butirică este folosită la fabricarea acidului butiric având ca

materie primă plămezi amidonoase zaharificate. Procesul se desfăţoara la 35-
40 oC, timp de 8-10 zile, în prezenţă de carbonat de calciu.
De asemenea, bacteriile genului Clostridium pot produce fermentaţii
derivate de la fermentaţia butirică, cu acumularea în mediu a unor solvenţi ca
acetona, alcool etilic, butanol, propanol.

CURS 5

FERMENTAŢII OXIDATIVE (AEROBE)

Fermentaţiile oxidative sunt reacţii biochimice de natură enzimatică, prin
care, în prezenţa oxigenului molecular din aer, substanţele substratului sunt
transformate în acizi organici.
Spre deosebire de respiraţia aerobă, în care oxidarea substanţelor este completă
(producându-se CO2, apă şi energie), în fermentaţia aerobă oxidarea este
limitată şi se opreşte la formarea unor produşi intermediari (acizi).

FERMENTAŢIA ACETICĂ
Fermentaţia acetică este un proces aerob prin care substratul (alcoolul etilic)
este oxidat în prezenţa oxigenului din aer, sub acţiunea echipamentului
enzimatic al bacteriilor acetice, în acid acetic ca produs principal al
fermentaţiei.

CH3-CH2-OH+O2→CH3-COOH+H2O

Principalii agenţi ai acestei fermentaţii sunt bacteriile acetice din

genurile Acetobacter şi Gluconobacter, cuprinse în familia Pseudomonadaceae,
ordinul Pseudomonadales. Sunt bacterii strict aerobe, nesporulate şi gram
negative. Acestea au formă de bastonaşe, uneori cu capete rotunjite sau umflate,
alteori uşor curbate, care se dezvoltă sub formă de voal strălucitor, transparent
şi fragil la suprafaţa lichidului. Alte specii ca A. xylinum şi A. xilinoides
formează un strat gelatinos de natură beta glucanică în vin oţetit sau oţet.
În cea mai mare parte, bacteriile acetice sunt mezofile, având
temperatura optimă în jurul valorii de 30 oC şi produc fermentaţia acetică într-
un domeniu larg de temperaturi, între 0-35 oC. Aceste bacterii sunt tolerante la
acid, concentraţii de până la 2 grade acetice activând creşterea celulară.
Valoarea optimă de pH este de 5,5.
 Echipamentul enzimatic al bacteriilor acetice se caracterizează prin
prezenţa unor dehidrogenaze foarte active localizate în sisteme membranare
cuplate cu lanţul citocromic şi enzime ale ciclului Krebs, care catalizează
reacţii de oxido-reducere pentru o categorie însemnată de compuşi.
Bacteriile acetice utilizează ca surse de carbon alcoolul etilic pe care il
transformă în acid acetic şi glucoza pe care o oxidează la acid gluconic.
Bacteriile din genul Acetobacter pot oxida şi acetaţii după ce alcoolul etilic este
consumat din mediu. Ca surse de azot pot utiliza sărurile de amoniu,
aminoacizii şi peptidele. Pentru dezvoltare bacteriile acetice necesită prezenţa
factorilor de creştere în mediu, cum sunt vitaminele tiamina, niacina, acidul
pantotenic.
După mediul în care se dezvoltă, Hannenberg şi Lazar clasifică bacteriile
acetice în:
Bacterii acetice izolate din plămezi amidonoase (Gluconobacter suboxidans,
Acetobacter industrium);
Bacterii acetice izolate din bere (Acetobacter kutzingianum, A. pasteurianum);
Bacterii acetice izolate din vin (A. ascendens, A. teurianum);
Bacterii acetice industriale (Bacterium acetigenum).

Mecanismul fermentaţiei acetice

Alcoolul etilic este oxidat la aldehidă acetică în prezenţa alcool-
dehidrogenazei. Prin legarea chimică a unui mol de apă se formează
acetaldehida hidratată care în prezenţa aldehid- dehidrogenazei trece în acid
acetic.
Principalul aspect practic legat de fermentaţia acetică este obţinerea
oţetului din diferite materii prime: soluţii alcoolice, vin, cidru, malţ, bere, orez.
Oţetul este folosit la marinarea unor produse culinare şi pentru conservarea
legumelor şi fructelor. De asemenea, fermentarea boabelor de cacao, prin care
acestea capătă aromă şi alte caracteristici organoleptice specifice este de tip
acetic. Bacteriile acetice din specia A. xilinum pot fi folosite pentru obţinerea de
beta-glucani folosiţi la fabricarea de membrane filtrante pe bază de acetat de
celuloză. Prin oxidarea sorbitolului se formează L-sorboza, materie primă în
sinteza acidului L-ascorbic (vitamina C).
 O importanţă deosebită o prezintă cunoaşterea caracteristicilor
microorganismelor acetice şi a mecanismului fermentaţiei acetice pentru
prevenirea şi combaterea oţetirii vinului.
În vinurile slabe se dezvoltă bacterii acetice (mai importante fiind:
Acetobacter ascendens, A. orlenense, A. pasteurianus, A. vini acetati, A.
xylinoides, A. xylinum), care oxidează, treptat, alcoolul din vin. Condiţiile
favorizante ale oţetirii vinurilor sunt următoarele: conţinut de alcool sub 12%,
aciditate volatilă peste 1,4 g/L (în cazul vinurilor albe), respectiv 1,7 g/L (la
vinurile rosii), accesul aerului, temperaturi ambiante de 19 – 38 oC. Oţetirea
vinului poate fi prevenită, în acest scop folosindu-se acidul sulfuros liber, ca
antiseptic. Un rol important în răspândirea bacteriilor acetice îl are musculiţa
oţetului (Drosophyla melanogaster).

Oțetul este produsul final al unui dublu proces biochimic:

fermentație alcoolica și oxidare acetică.
Prima fază din procesul biochimic este o fermentație acoolică în care
zahărul este transformat în acool. A doua fază este o oxidare acetică care are ca
scop transformarea acoolului în acid acetic sub acțiunea oxigenului și a
bacteriilor.
 Start

Materii prime

Preparare substrat
Apă Nutrienţi
hidroalcoolic

Substrat hidroalcoolic

Oxidare acetică

Maturare

Fig.1. Schema tehnologică generală de fabricare a oţetului

FERMENTAŢIA CITRICĂ

Fermentaţia citrică este un proces oxidativ complex prin care substratul

glucidic (zaharoza) este metabolizat la compuşi intermediari de oxidare cu
acumulare în mediu a acidului citric ca produs principal.
Fermentaţia citrică este produsă de tulpini selecţionate de Aspergillus niger
var. citricus, care produc activ citrat sintetaza. Drojdia Candida oleophilla
poate produce de asemenea acid citric, când este cultivată în medii cu parafine.
 În condiţii normale, mucegaiurile nu acumulează acizi organici deoarece
aceştia sunt metabolizaţi în ciclul Krebs. Pentru fermentaţia citrică mediul cu
melasă trebuie suplimentat cu ferocianură de potasiu pentru precipitarea
urmelor de metale ca magneziu, fier, zinc, cupru. Acidul citric se obţine prin
cultivarea tulpinii de Aspergillus niger var citricus în suprafaţă pe medii cu
melasă tratată cu ferocianură de potasiu, la 30-35 oC, timp de 6-8 zile. De
asemenea, acidul citric se poate obţine şi în culturi submerse în bioreactoare cu
aerare în scopul reducerii duratei de fermentare. Acidul citric are largi utilizări
în industria alimentară la fabricarea băuturilor răcoritoare şi a produselor
zaharoase. Este un aditiv cu valoare de conservant, are proprietăţi antioxidante
şi rol de anticoagulant al sângelui. Intră în compoziţia pulberilor efervescente în
industria farmaceutică, iar citratul de sodiu poate înlocui fosfaţii la fabricarea
detergenţilor.

FERMENTAŢIA FUMARICĂ, SUCCINICĂ ŞI

MALICĂ
Sub acţiunea unor micromicete din genurile Mucor, Aspergillus şi
Rhisopus, glucidele se transformă în acid succinic, acid fumaric şi acid malic.
Dacă se cultivă Mucor stolonifer pe un mediu glucidic sau de acid
acetic, în prezenţa carbonatului de calciu, se obţine acid succinic şi fumaric, cu
un randament de aproape 70%. Acidul fumaric se transformă treptat sub
acţiunea enzimei fumaraza în acid malic.
CURS

BIOSINTEZA METABOLITILOR MICROBIENI

Semnificaţia biologică a metaboliţilor primari şi secundari

Ca rezultat al activităţii lor metabolice, microorganismele sintetizează
mai multe categorii de produşi care includ, pe lângă constituenţii structurali ai
celulei, enzime intra- şi extracelulare, compuşi de rezervă energetică (glicogen,
poli-beta-hidroxibutirat), produşi finali de metabolism, cărora li se adaugă o
serie de compuşi cu importanţă practică incluzând metaboliţi primari,
metaboliţi secundari şi produşi de bioconversie (bioderivaţi).

Metaboliţii primari
Metabolismul primar este identic la toate organismele vii şi este
reprezentat de mai multe căi metabolice mediate de enzime, prin care celula
produce energie, intermediari şi precursori de biosinteză care sunt apoi
transformaţi în macromolecule specifice celulei. Metaboliţii primari sunt
reprezentaţi de compuşi care au legătură cu sintezele din celula microbiană în
faza de creştere. Aceştia includ aminoacizi, nucleotide şi produşi finali de
fermentaţie ca alcoolul etilic şi acizii organici. De asemenea, microorganismele
sintetizează ca metaboliţi primari o serie de enzime de uz industrial, cel mai
adesea exoenzime, în timpul creşterii. Metaboliţii primari sunt sintetizaţi în faza
de creştere exponenţială a celulelor (trofofaza), ca rezultat al metabolismului
oxidativ sau fermentativ.

Metaboliţii secundari
Pe lângă metaboliţii primari, cu rol major în menţinerea viabilităţii
microorganismului (proteine, hidraţi de carbon şi grăsimi), sunt sintetizaţi şi o
serie de compuşi care includ terpene, steroizi, antociani, antrachinone, fenoli şi
polifenoli, care aparţin aşa numitului metabolism secundar. Metaboliţii
secundari se acumulează de obicei în perioada de limitare a nutrienţilor sau de
acumulare a deşeurilor celulare, care urmează fazei de creştere. Aceşti compuşi
nu au legătură cu sinteza materiei organice celulare şi cu creşterea, cei mai
mulţi fiind antibiotice şi micotoxine. Metaboliţii secundari sunt prezenţi
numai la anumite specii şi pot fi identificaţi numai într-un anumit stadiu al
creşterii şi dezvoltării în cadrul unei specii, sau pot fi activaţi numai pe
parcursul perioadelor de stres, cauzate de exemplu de sărăcirea nutrienţilor.
Sinteza lor pare fără semnificaţie directă pentru celula sintetizatoare, dar poate
fi decisivă pentru dezvoltarea şi funcţionarea microorganismului ca întreg. Cu
toate că sinteza lor nu constituie o
parte indispensabilă a programului expresiei genice şi dezvoltării, aceşti
metaboliţi nu reprezintă simpli produşi catabolici, deoarece au o structură foarte
diversificată şi pot fi adesea reincluşi în procesele metabolice. Metabolitii
secundari aparţin unor clase numeroase de compuşi organici: glucide aminate,
chinone, cumarine, alcaloizi, derivaţi indolici, glicozide, lactone, macrolide,
naftalene, nucleozide, terpenoizi şi tetracicline. Mulţi metaboliţi secundari au
aplicaţii practice, fiind utilizaţi antibioticele, unele toxine, pigmentii
microbieni, biostimulatorii pentru creşterea plantelor. Adeseori metaboliţii
secundari formează un amestec de produşi cu structură asemenătoare
aparţinând aceleiaşi familii de substanţe chimice. Streptomyces griseus
produce, de exemplu, 40 de antibiotice.
Semnificaţia producerii metaboliţilor secundari (antibiotice, micotoxine,
pigmenţi) în funcţionarea celulară este încă neclară. Cu toate acestea, este
unanim acceptat că, deşi necunoscută încă, funcţia lor în organismul respectiv,
trebuie să existe. Asa este de exemplu producţia de pigment la bacteria
Pseudomonas fluorescens. În anumite condiţii bacteria produce cantităţi
ridicate de pigment galben - verde fluorescent. Până de curând rolul lui
fiziologic nu era cunoscut, apoi s-a demonstrat că acest compus are proprietatea
de chelare a fierului; deci este nevoie de el atunci când celula respectivă
evoluează în medii cu disponibilitate scăzută în fier, iar pigmentul reţine chiar
şi urmele de fier pentru a favoriza creşterea.
Delimitarea între metabolismul primar şi secundar este incertă, întrucât
mulţi dintre intermediarii metabolismului primar îndeplinesc roluri similare şi
în cadrul metabolismului secundar. Astfel, unii aminoacizi sunt în mod cert
metaboliţi secundari, în timp ce sterolii sunt compuşi structurali esenţiali ai
multor microorganisme şi în consecinţă trebuie consideraţi metaboliţi primari.
Suprapunerea rolurilor multor compuşi asigură o interrelaţie strânsă între
metabolismul primar şi secundar, iar interpretarea delimitării dintre aceste
procese trebuie făcută cu prudenţă.
 Fig. 8.1 Sinteza metaboliţilor primari şi secundari în faza exponenţială şi staţionară de
creştere

La modul general metabolismul primar este acelaşi în toate celulele, pe

când cel secundar este în funcţie de tipul de celulă. De obicei este uşor de
clasificat un metabolit celular ca primar sau secundar; totuşi, deoarece reacţiile
intracelulare sunt puternic interconectate, în anumite cazuri clasificarea nu mai
este evidentă. Deşi se enunţă în principiu ideea că metaboliţii primari se
formează în conexiune cu creşterea celulară, totuşi acidul lactic, acceptat la
modul general ca metabolit primar, este produs de bacteriile lactice în condiţii
caracterizate prin absenţa creşterii. Această situaţie este valabilă şi pentru mulţi
alţi metaboliţi primari (de obicei în conexiune cu nevoia de a produce energie
de menţinere celulară).
 De aceea metaboliţii primari pot fi definiţi ca bioproduşi formaţi în
reacţii necesare pentru creşterea celulară, iar metaboliţii secundari sunt
sintetizaţi prin reacţii sau căi metabolice care nu sunt esenţiale pentru creştere.
În tabelul 8.1 este prezentată lista unor metaboliţi primari şi secundari
de interes economic.

Tabel 8.1 Metaboliţi primari şi secundari de interes economic

Metabolit Microorganism
Produse industriale
Etanol (din glucoză) Saccharomyces cerevisiae
Etanol (din lactoză) Kluyveromyces fragilis
Acetonă şi butanol Clostridium
2,3 butandiol acetobutylicum
Enzime Enterobacter, Serratia
Aspergillus, Bacillus, Mucor, Trichoderma
Produse agricole
Giberelline Giberella fujikuroi
Aditivi alimentari
Aminoacizi (lizină) Corynebacterium
Acizi organici (acid citric) glutamicum Aspergillus niger
Nucleotide Corynebacterium
Vitamine glutamicum Ashbya,
Polizaharide Blakeslea
Xanthomonas
Produse medicale
Antibiotice Penicillium, Streptomyces, Bacillus
Alcaloizi Claviceps purpurea
Inulina, hormoni de creştere, somatostatina, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae
interferon obţinute prin inginerie genetică
Biocombustibili
Hidrogen Microorganisme fotosintezante
Metan Metanobacterium
Etanol Zymomonas

În sinteza antibioticelor şi a altor metaboliţi secundari natura şi

concentraţia nutrientului limitant joacă un rol important. Concentraţiile ridicate
de glucoză, amoniac (ca şi alte surse de azot uşor utilizabile) şi fosfat au fost
descrise ca factori ce reprimă sinteza diferitelor antibiotice. De aceea, pentru
producerea antibioticelor sunt utilizate frecvent o serie de glucide şi mai puţin
glucoza împreună cu surse insolubile de azot (extract / hidrolizat de soia). Peste
anumite concentraţii, un factor cheie de represie este şi concentraţia de fosfat
extracelular, care reprimă sinteza enzimelor implicate în formarea
antibioticelor. În cultura discontinuă formarea antibioticelor debutează de
obicei la sfârşitul fazei exponenţiale, când viteza de creştere a culturii este în
declin, aceasta întrucât în zona vitezei maxime de creştere μmax, dezvoltarea
culturii este virtual fără restricţii şi toate reacţiile metabolismului primar se
produc la o viteză ridicată în detrimentul reacţiilor metabolismului secundar.
În general producţia oricărui metabolit este influenţată de următorii
factori de mediu:
- condiţiile de creştere
- natura sursei de carbon;
- natura şi concentraţia nutrientului limitant de creştere;
- controlul metabolismului de consum al sursei de carbon;
- permeabilitatea membranei celulare în raport cu dimensiunea bioproduşilor;
- tipul de microorganism (ceea ce înseamnă căi generale / căi specifice
metabolice).
Un grup important de bioproduşi industriali de ultimă generaţie este
constituit de proteinele recombinante produse în urma modificărilor celulelor
prin tehnici ADN recombinant. Deoarece proteinele recombinante nu sunt în
mod necesar implicate în funcţionarea şi metabolismul celular de bază, acest
grup de produse ar putea fi considerate ca metaboliţi secundari.
Antibiotice
Mai multe microorganisme produc antibiotice în mediul de cultură, ca
metaboliţi secundari. Antibioticele sunt produse de unele bacterii din genul
Streptomyces şi de unii fungi filamentoşi dintre care cel mai utilizat este genul
Penicillium. Penicilina produsă de Penicillium chrysogenum este un exemplu
de metabolit secundar obţinut prin cultivarea mucegaiului în medii cu lactoză
(care este hidrolizată lent eliberând glucoza) în combinaţie cu o sursă limitată
de azot,
condiţii care favorizează acumularea de antibiotic după sfârşitul fazei de
creştere exponenţiale. S-a constatat că glucoza (monozaharid consumat rapid)
prezentă în mediul de cultură determină cantităţi sporite de biomasa fungică,
dar o sinteză scăzută de penicilină. Concentraţii optime de penicilină se pot
obţine, de asemenea, dacă se alimentează mediul în mod continuu cu cantităţi
reduse de glucoză. Dacă se doreşte obţinerea unei peniciline anume, se adaugă
în mediu precursorul specific. De exemplu, mediul este suplimentat cu acid
fenilacetic pentru biosinteza penicilinei G, care are în moleculă un lanţ benzil.
Streptomicina este un alt metabolit secundar produs de bacteria Streptomyces
griseus, cultivată în mediu conţinând extract de soia ca sursă complexă de azot
şi glucoza ca sursă de carbon. La sfârşitul fazei exponenţiale nivelul
concentraţiei de antibiotic începe să crească în condiţii de limitare a sursei de
azot.
Se cunosc în prezent peste 6000 de antibiotice, din care 4000 sunt
produse de actinomicete, iar 300 sunt descoperite în fiecare an.
Aminoacizi
Aminoacizii ca lizina şi acidul glutamic sunt utilizaţi în industria
alimentară ca suplimente nutritive sau ca potenţiatori de gust şi aroma
(glutamatul de sodiu). Producţia de acid glutamic şi alţi câţiva aminoacizi se
face cu tulpini mutante de Corynebacterium glutamicum care au o capacitate
scăzută sau absentă de a transforma intermediarul cetoglutarat din ciclul Krebs
în succinil-CoA. Biosinteza are loc în mediu cu concentraţie scăzută de biotină
şi adiţie de derivaţi ai acizilor graşi, având ca rezultat o creştere a
permeabilităţii membranei celulare şi excreţia de acid glutamic în cantitate
mare. Lizina, un aminoacid folosit ca supliment în pâine şi cereale este obţinută
de asemenea cu o mutantă de Corynebacterium glutamicum, cu calea de sinteză
de homoserină blocată.
Acizi organici
Principalii acizi organici obţinuţi prin sinteza microbiană sunt acidul
citric, acetic, lactic, fumaric şi gluconic, în producţia cărora un rol important îl
are nivelul urmelor de metale din mediul de cultură. În prezent cea mai mare
cantitate de acid citric este obţinută cu ajutorul unor tulpini de Aspergillus niger var.
citricus, în condiţii de limitare a urmelor de mangan şi fier în mediu.

Compuşi speciali utilizaţi în medicină şi sănătate

În ultimii 30-40 de ani, în afară de biosinteza de antibiotice, aminoacizi sau acizi
organici, microorganismele au fost utilizate pentru producţia de compuşi speciali
nonantibiotice. Acestea includ hormoni, agenţi antitumorali, ionofori şi substanţe cu
influenţă diversă asupra bacteriilor, fungilor, protozoarelor, insectelor şi plantelor, în
toate cazurile fiind necesar un control strict al condiţiilor de cultivare.
Biopolimeri
Biopolimerii sunt produşi ai metabolismului microbian care sunt utilizaţi pentru
modificarea caracteristicilor de curgere a lichidelor sau ca agenţi de gelifiere, în
farmacie şi industria alimentară. Polizaharidele bacteriene sunt folosite ca stabilizatori,
pentru dispersarea particulelor, agenţi film-forming sau pentru a menţine retenţia de apă
în diferite produse. Din categoria biopolimerilor fac parte dextranul utilizat ca
înlocuitor de plasmă sanguină şi absorbant, poliesterii derivaţi din Pseudomonas
oleovorans pentru plastice speciale, microfibrilele de celuloză produse de Acetobacter,
scleroglucanul, xantanul produs de Xanthomonas campestris etc. Ciclodextrinele sunt
molecule ciclice care pot lega anumite substanţe modificându-le proprietăţile fizice. De
exemplu, ciclodextrinele cresc solubilitatea unor compuşi farmaceutici, reduc gustul lor
amar şi maschează mirosul neplăcut.
Biosurfactanţi
Biosurfactanţii de origine microbiană suscită un interes crescut în ultima
perioadă din cauza potenţialului lor de biodegradare în mediul natural. Aceşti compuşi
sunt utilizaţi pentru emulsifiere, ca detergenţi, agenţi de dispersie şi solubilizare,
caracteristici importante în bioremediere, tratarea deversărilor de petrol, recuperarea
uleiurilor (EOR-enhanced oil recovery). Din categoria biosurfactanţilor microbieni, cei
mai răspândiţi sunt glicolipidele, care au regiuni distincte hidrofile şi hidrofobe.
 EVIDENŢIEREA METABOLISMULUI GLUCIDIC
AL MICROOGANISMELOR

Glucidele (monozaharide, dizaharide, polizaharide) pot fi degradate de drojdii, bacterii si

mucegaiuri urmând una din cele două căi principale: oxidarea (în aerobioză) sau fermentaţia (în
anaerobioză).
Drojdiile produc fermentarea unui numar limitat de glucide, pe care le transforma in
alcool etilic si dioxid de carbon in conditii de anaerobioza. De exemplu, toate tulpinile de
Saccharomyces cerevisiae pot fermenta D-glucoza, D-manoza, si D-fructofuranoza (fara a putea
folosi D- fructopiranoza). Aceleasi zaharuri sunt asimilate cu formare de biomasa in conditii
aerobe.
Majoritatea tulpinilor de drojdie pot utiliza aerob sau anaerob D-galactoza, zaharoza,
maltoza, rafinoza.
Diglucidele sunt mai intai hidrolizate de enzimele din drojdii in monozaharide, care sunt
apoi metabolizate:
Maltoza (maltaza) 2 Glucoza
Zaharoza (invertaza) Glucoza + Fructoza
Celobioza (celobiaza) 2 Glucoza
Lactoza (lactaza) Glucoza + Galactoza
Datorita importantei alcoolului de fermentatie pentru industrie, pe langa glucidele
fermentescibile se pot folosi substraturi naturale cu continut ridicat de polizaharide (amidon,
celuloza) care sunt hidrolizate in prealabil pana la monozaharide.

Principiul metodei: Metoda se bazează pe virarea culorii unui indicator de pH datorită

metabolizării zahărului de către tulpina microbiana studiata.

Materiale utilizate:
- cultura de drojdie (Saccharomyces cerevisiae)
- eprubete cu dop de vată
- ac (fir) de inoculare
- bec de gaz
- baie de apă la fierbere
- parafină sterilă
- mediul de cultură: (se va utiliza mediul Hugh - Leifson)
- peptonă….............................2g
- extract de drojdie..................1g
- NaCl…................................5g
 - K2HPO4..........................................0,2g
- albastru de bromtimol......0,08g
- agar-agar…......................2,5g
- zahărul adăugat…..............10g
- apă distilată….................1000ml
Sursa de carbon a fost reprezrntată de o serie de momozaharide, dizaharide şi trizaharide pentru
care s-au efectuat soluţii cu o concentraţie de 10% care au fost sterilizate separat în eprubete.
Au fost testate următoarele surse de carbon: monozaharide (glucoză, fructoză, galactoză,manoză),
dizaharide (zaharoză, lactoză), trizaharide (rafinoza).
- termostat
- autoclav

Mod de lucru: Mediul de cultură repartizat câte 10 mL în eprubete, se sterilizează separat de

zahărul ce trebuie testat, la 121oC timp de 15 minute. Dacă mediul a fost preparat mai înainte, se
regenerează prin topire într-o baie de apă la fierbere, se adaugă zahărul ce trebuie testat, după
care se solidifică. Zaharul nu se sterilizeaza impreuna cu mediul de cultura, deoarece pot avea
loc reactii secundare. Ar fi de preferat ca solutia de zahar sa se sterilizeze prin microfiltrare, prin
filtre de 0,2 micrometri (diametrul porilor).
Se inoculează tuburile prin înţepare în profunzime, cu firul metalic, până la baza mediului
din cultura de studiat. Pentru fiecare zahăr se vor realiza câte două tuburi, din care unul se va
acoperi cu un strat de ulei de parafină sterilă (5 mm înălţime).
Tuburile se vor incuba la 30 sau 37 oC timp de 48 ore sau mai mult, după care se va
observa modificarea culorii mediului de cultură (care a avut iniţial culoarea verde), existând
următoarele posibilităţi;

A. Culoare galbenă în ambele tuburi (cu sau fără ulei):

 fermentarea zahărului (culoarea galbena a aparut datorita virarii culorii indicatorului)

B. Culoare galbenă (în suprafaţă) în tubul fără ulei:

 oxidarea zahărului
Fermentarea unui zahăr poate fi însoţită de o degajare de gaz.

C. Culoare verde în ambele tuburi (cu sau fără ulei):

 zahărul nu a fost metabolizat

D. Culoare albastră în tubul fără ulei şi verde în tubul cu

ulei:
 alcalinizare (anaeroba) datorată utilizării peptonei in tubul fara ulei
 Culturile de drojdii în plăci Petri au fost obţinute pe mediul malt extract agar prin metoda
striurilor.Tulpinile de drojdii prezintă următoarele caracteristici:

Candida utilis:
Tulpina de Candida utilis formează pe acest mediu colonii de culoare alb crem cu aspect
mat şi dimensiuni cuprinse între 2 – 5 mm, după cinci zile de dezvoltare la temperatura de
30C. Coloniile au profil umbonat, margini uniforme şi reversul este alb- gălbui.
Pe preparatele microscopice se pot observa celulele de formă alungită cu diametrul mic de
6.75 m şi diametrul mare de 13.5-18m cu obiectivul de 20. Deoarece unele celule erau
înmugurite s-a evidenţiat şi asocierea celulelor în lanţuri (2-3 celule) formâmd pseudomicelii.

Figura Aspectul culturii de Candida utilis

Saccharomyces cerevisiae
În plăci Petri pe mediul cu extract de malt, după cinci zile de termostatare la 30 C
tulpina fomează coloni de culoare albă, cu aspect cremos, profil lenticular şi dimensiuni de 1-
2 mm. Reversul este de culoare alb – crem şi prezintă miros caracteristic de drojdie.
La microscop se observă celule ovale cu diametrul mic de 4.5 - 6.7 m şi diametrul mare
între 9 - 22.5 m, unele înmugurite unipolar, mugurele având diametrul de 4.5 m. Cu
obiectivul de 40 se observă învelişul celular, citoplasma, nucleul şi unele incluziuni
(glicogen, lipidice). Nu formează pseudomicelii.
 Figura 3.2. Aspectul culturii de Saccharomyces cerevisiae

Kluyveromyces fragilis
Formează în placa Petri colonii circulare de culoare crem cu aspect mat şi diametrul cuprins
între 1 -3 mm. Profilul coloniilor este crescut, iar reversul crem. Marginile sunt uniforme.
Pe preparatul microscopic se observă celule ovale cu diametrul mic de 4.5 m şi diametrul
mare de 9 m, unele înmugurite. Nu formează pseudomicelii.

Figura. Aspectul culturii de Kluyveromyces fragilis

 Evidenţierea metabolismului glucidic
Pentru evidenţierea surselor de carbon metabolizate de către tulpinile de drojdii, folosite la
obţinerea de biomasă proteică s-a utilizat metoda mentionata, conform căreia
microorganismele au fost însămânţate în tuburi pe mediul Hugh Leifson suplimentat cu
monozaharide (fructoză, glucoză, manoză, galactoză), dizaharide (fructoză, lactoză),
trizaharide (rafinoză).
Conform metodei zahărul metabolizat şi fermentat s-a evidenţiat prin virarea culorii
indicatorului de pH (albastru de brom timol) din albastru în galben.
a) Evidenţierea metabolismului glucidic pentru tulpina de Candida utilis
Tulpina de Candida utilis dezvoltată pe mediul de cultură menţionat a determinat apariţia
culorii galbene pentru tuburile conţinând glucoză, fructoză, manoză şi zaharoză, verzi în
cazul galactozei, lactozei şi rafinozei, după cum se poate observa în figura urmatoare.

Figura Evidentierea metabolismului glucidic - Candida utilis

În cazul zaharurilor fermentate care au produs virajul în galben al indicatorului de pH s-a

observat de asemenea dezvoltarea drojdiei atât la suprafaţa agarului cât si dealungul
înţepăturii. precum şi apariţia unor mici bule de gaz în masa de agar. Aceste surse de carbon
pot fi introduse ca atare sau prezente în unele subproduse agroalimentare reprezentând
substratele optime pentru obţinerea de biomasă proteică.
 În cazul galactozei apariţia culorii verzi sugerează o metabolizare mai scăzută a acestei
surse de carbon. Lipsa enzimelor hidrolitice specifice (- galactozidază şi lactază) face ca
rafinoza şi lactoza să nu poată fi utilizat pentru cultivarea tulpinii.
b) Evidenţierea metabolismului glucidic pentru tulpina de Saccharomyces cerevisiae
Cultivarea tulpini de Saccharomyces cerevisiae cultivată pe mediul cu extract de malt a
determinat apariţia culorii galbene în eprubetele în care, ca sursă de carbon s-a folosit manoză,
fructoză; galben – verzui în eprubetele în care s-a aflat glucoză, zaharoză, galactoză; albastru
pentru lactoză, după cum se poate vedea din figura urmatoare.

Fig. Evidentierea metabolismului glucidic - Saccharomyces cerevisiae

c) Evidenţierea metabolismului glucidic pentru tulpina de Kluiveromyces fragilis

Kluiveromyces fragilis a determinat apariţia culorii galbene în eprubetele în care s-a folosit ca
sursă de carbon zaharoză, fructoză şi manoză, glucoză şi galactoză şi culorii albastre-verzi în
eprubetele care conţin rafinoză şi lactoză (figura ).
 

 Figura Evidentierea metabolismului glucidic - Kluiveromyces fragilis

Fermentatia lactica. Culturi de bacterii lactice

Materiale şi metode utilizate

Materiale utilizate

Materialul biologic
Pentru caracterizarea şi cultivarea unor bacterii lactice utilizate la obţinerea de preparate
probiotice s-au utilizat următoarele tulpini:
 Lactobacillus acidophilus

 Lactobacillus delbrueckii

 L. rhamnosus

Medii de cultură utilizate

Mediul pentru întreţinerea şi conservarea tulpinii:
- Mediu MRS lichid cu compoziţia următoare:
- peptonă...............................10g/L
- extract de carne..................5g/L
- extract de drojdie...............4g/L
- acetat de sodium................5g/L
- glucoză..............................20g/L
- fosfat bipotasic.................2g/L
 - citrat de sodium...............2g/L
- twen 80…..........................1mL
- sulfat de magneziu…........0,2mL
- sulfat de mangan..............0,04 mL
- apă distilată......................500 ml
- pH-ul =6,2-6,5
- autoclavare la 0,5 atm/ 30 min.
- Mediu MRS agarizat are aceeaşi compoziţie, în plus se adaugă 15% agar.

Mediul pentru evidenţierea metabolismului glucidic:

- Mediul HUGH-LEIFSON cu următoarea compoziţie:
- peptonă...............................2g/L
- extract de drojdie...............1g/L
- NaCl...................................5g/L
- K2HPO4.............................................0,2g/L
- albastru de bromtimol.........0,08g/L
- agar-agar..............................2,5g/L
- zahărul adăugat....................10g/L
- apă distilată.....................1000 mL

Mediul pentru cultivarea în submers a bacteriilor

lactice:
- Mediul MRS lichid pentru care a fost modificată concentraţia de glucoză :
0,5%, 1%, 2% şi 3% şi pH-ul 4,5; 6,5 şi 8.
- Mediul cu melasă şi săruri cu următoarea compoziţie:
- Melasă............................45 g/L
- K2HPO4.....................................1,2 g/L
- (NH4)2SO4...............................0,6 g/L
Apă distilată..................1000 mL
 Metode utilizate
Metoda de întreţinere şi conservare
Culturile izolate din diferite produse lactate au fost însămânţate pe mediul MRS broth, în
eprubete şi termostatate timp de 48 ore la 37oC, după care se observă tulburarea mediului de
cultură datorită multiplicării celulare.
Pentru conservarea lor, culturile au fost păstrate la frigider la temperatura de 4-5o C maxim o
săptamână, după care au fost reîmprospătate prin trecere pe mediul steril.
Metoda de evidenţiere a metabolismului glucidic cu mediul de cultură Hugh-
Leifson Glucidele (monozaharide, dizaharide, polizaharide) pot fi degradate de bacterii
urmând una
din cele două căi principale: oxidarea (în aerobioză) sau fermentaţia (în anaerobioză).
Tuburile se vor incuba la 37 oC timp de 24 ore sau mai mult, după care se va observa
modificarea culorii mediului de cultură (care a avut iniţial culoarea albastră). Se consideră că în
eprubetele în care indicatorul de pH şi-a modificat culoarea de la albastru la galben s-a produs
fermentaţia lactică a zaharului respectiv. Au fost utilizate următoarele zaharuri în concentraţie
finală de 1%: galactoză, lactoză, fructoză, maltoză, glucoză, zaharoză.

Metoda de cultivare pe incubatorul rotativ

Pentru cultivarea şi multiplicarea bacteriilor lactice au fost utilizate două medii de cultură şi
anume: mediul MRS lichid cu diferite concentraţii de glucoză ca unică sursă de carbon (0,5%,
1%, 2% si 3%), valori diferite de pH (4,5, 6,5 şi 8) şi cantităţi diferite de inocul ( 0,1 mL, 0,5 Ml,
1 ml, 3 ml).

Alte metode:

Determinarea absorbanţei la lungimea de undă de 600 nm la spectrofotometru;

Observaţia caracterelor microscopice ale bacteriilor lactice.

Aparatură:
1. Incubatorul rotativ tip Thermoshake
2. Microscopul optic
3. Spectrofotometru
4. Termostat
 5. Autoclav
6. Etuva

Rezultate
Caractere morfologice ale bacteriilor lactice izolate
Caracterele morfologice ale culturilor mixte de bacterii lactice au fost evidenţiate pe mediul
MRS lichid şi agarizat, după o dezvoltare de câteva zile la 37oC.
Pentru toate bacteriile lactice s-a observat tulbularea mediului lichid după 48 de ore de
termostatare urmată de depunere de sediment în următoarele zile. Pe mediul MRS agarizat
bacteriile lactice formează colonii de culoare albă sau crem cu aspect lucios şi diametrul de
aproximativ 1-2 mm.

Evidenţierea metabolismului glucidic pentru culturile de

bacterii lactice.
Evidenţierea metabolismului glucidic s-a efectuat conform metodei mentionate pe mediul
Hugh-Leifson. In urma fermentarii zaharului din eprubeta se formeaza acid lactic care scade
valoarea pH, iar indicatorul (albastru de bromtimol) isi schimba culoarea din albastru in
galben.

Fig 4. Aspectul culturilor pe mediul Hugh-Leifson după 48

ore
 Dezvoltarea culturilor de bacterii lactice pe incubatorul rotativ

Mediile de cultură folosite au fost mediul MRS lichid cu diferite concentraţii de glucoză şi
valori diferite de pH precum şi un mediu cu melasă şi săruri.
Culturile au fost dezvoltate pe un incubator rotativ prezentat în figura 5 la temperatura de
37oC precum şi static , la temperatura camerei ( aproximativ 20oC ).

Fig. 5. Aspectul culturilor de bacterii

lactice pe incubatorul rotativ.

Mediile de cultura au fost repartizate câte 200 de mL în baloane Ellermeyer de 500 mL şi au

fost sterilizate prin autoclavare timp de 20 minute la 121oC. După racirea mediilor acestea au fost
inoculate cu câte 1 mL inocul lichid din eprubete, reprezentând 0,5% inocul (Vol/Vol).
S-au recoltat probe în care s-a determinat absorbanţa la 600 nm ca un indicator al densităţii
celulare şi valoarea pH. Aceste marimi au fost reprezentate grafic în funcţie de durata de
dezvoltare.
Tab. . Valorile absorbantelor lichidului de cultura

Timp,h L.acidophilius L.delbrueckii L.rhamnosus

2 0.0162 0.0231 0.0336
4 0.226 0.348 0.860
5 0.404 0.538 1.487
6 0.241 x 10 0.095 x 10 0.110 x 10
24 0.892 x 10 0.648 x 10 0.611 x 10
26 0.885 x 10 0.703 x 10 1.127 x 10
 Tab. . Valorile pH in mediul de cultura

L.acidophilius
Timp, h L.delbrueckii L.rhamnosus

2 6,5 6,5 6,5

4 6,5 6,2 6,2
5 6,5 6 6
6 6,2 5,8 5,8
24 4 4 4
26 4 4 4

S-a urmărit în continuare studiul influenţei concentraţiei sursei de carbon, si a valorii iniţiale a
pH-ului asupra dezvoltării culturii de bacterii lactice.
Tab.5 Valorile SU% (refractometric) in mediul de cultura

Timp,h L. acidophilius L.delbrueckii L.rhamnosus

2 3.4 3.4 3,4
4 3,3 3.3 3,3
5 3.2 3.2 3,2
6 3.2 3 3
24 2,4 2 2.6
26 2.2 2 2.6

Tab. 6. Valorile absorbanţelor în mediile de cultura cu diferite concentraţii de glucoză pentru

tulpina de Lactobacillus acidophilus
Absorbanţa la 600 nm
glucoză
Timp, h 0,5% glucoză 1% glucoză 2% glucoză 3%
0 0,153 0,112 0,146 0,136
2 0,177 0,171 0,18 0,177
4 0,455 0,397 0,416 0,395
6 1,208 1,123 1,085 0,895
8 2,38 2,42 2,32 2,05
23 4,01 5,96 8,04 7,35
25 3,99 6,1 8,2 7,75
27 3,98 6,2 8,36 7,6
 Absorbanţa la 600 nm pentru medii cu diferite concentraţii de
glucoză

9
8 Absorbanţa la 600 nm
7 glucoză 0,5%
Abs. 600 nm

6 Absorbanţa la 600 nm
5 glucoză 1%
4 Absorbanţa la 600 nm
3 glucoza 2%
2 Absorbanţa la 600 nm
1 glucoză 3%
0
0 5 10 15 20 25 30
Timp, h

Fig. 9. Variaţia absorbanţei cu timpul de dezvoltare pentru diferite concentraţii de glucoză.

pentru tulpina de Lactobacillus acidophilus

Dependenţa dezvoltării culturilor lactice de pH iniţial

Influenţa pH iniţial in mediul de cultură a fost studiată prin modificarea pH prin adăugare de
HCl pentru 4,5 unităţi şi o soluţie NaOH de concentratie 10% pentru valoarea 8 a pH-ului.
Dezvoltarea culturilor a avut loc la 37oC, 150 rpm, timp de 27 ore.

Tab. . Valorile absorbanţelor la 600 nm pentru diferite valori ale pH-ului iniţial pentru tulpina de
Lactobacillus acidophilus

Absorbanţa la 600 nm
Timp, h
pH iniţial 4,5 pH iniţial 6,5 pH iniţial 8
0 0,147 0,146 0,118
2 0,202 0,18 0,248
4 0,252 0,416 0,954
6 0,354 1,085 2,005
8 0,51 2,32 3,03
23 4,91 8,04 7,33
25 5,71 8,2 7,75
27 5,65 8,36 8,05
 Absorbanţa la 600 nm pentru diferite valori de pH

9
8
7
Abs. 600 nm

6
pH iniţial 4,5
5
pH iniţial 6,5
4
pH iniţial 8
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30
Timp, h

Fig. 11. Variaţia absorbanţei pentru diferite valori de pH iniţial cu timpul de dezvoltare pentru
tulpina de Lactobacillus acidophilus

Din datele obţinute se poate observă o mai bună dezvoltare pentru mediile de cultură cu pH 8
şi 6,5 precum şi o inhibiţie a dezvoltării celulelor la pH acid.

Fermentatia lactica. Culturi de bacterii lactice

Materiale şi metode utilizate

Materiale utilizate

Materialul biologic
Pentru caracterizarea şi cultivarea unor bacterii lactice utilizate la obţinerea de preparate
probiotice s-au utilizat următoarele tulpini:
 Lactobacillus acidophilus

 Lactobacillus delbrueckii
  L. rhamnosus

Medii de cultură utilizate

Mediul pentru întreţinerea şi conservarea tulpinii:
- Mediu MRS lichid cu compoziţia următoare:
- peptonă...............................10g/L
- extract de carne..................5g/L
- extract de drojdie...............4g/L
- acetat de sodium................5g/L
- glucoză..............................20g/L
- fosfat bipotasic.................2g/L
 - citrat de sodium...............2g/L
- twen 80…..........................1mL
- sulfat de magneziu…........0,2mL
- sulfat de mangan..............0,04 mL
- apă distilată......................500 ml
- pH-ul =6,2-6,5
- autoclavare la 0,5 atm/ 30 min.
- Mediu MRS agarizat are aceeaşi compoziţie, în plus se adaugă 15% agar.

Mediul pentru evidenţierea metabolismului glucidic:

- Mediul HUGH-LEIFSON cu următoarea compoziţie:
- peptonă...............................2g/L
- extract de drojdie...............1g/L
- NaCl...................................5g/L
- K2HPO4.............................................0,2g/L
- albastru de bromtimol.........0,08g/L
- agar-agar..............................2,5g/L
- zahărul adăugat....................10g/L
- apă distilată.....................1000 mL

Mediul pentru cultivarea în submers a bacteriilor

lactice:
- Mediul MRS lichid pentru care a fost modificată concentraţia de glucoză :
0,5%, 1%, 2% şi 3% şi pH-ul 4,5; 6,5 şi 8.
- Mediul cu melasă şi săruri cu următoarea compoziţie:
- Melasă............................45 g/L
- K2HPO4.....................................1,2 g/L
- (NH4)2SO4...............................0,6 g/L
Apă distilată..................1000 mL
 Metode utilizate
Metoda de întreţinere şi conservare
Culturile izolate din diferite produse lactate au fost însămânţate pe mediul MRS broth, în
eprubete şi termostatate timp de 48 ore la 37oC, după care se observă tulburarea mediului de
cultură datorită multiplicării celulare.
Pentru conservarea lor, culturile au fost păstrate la frigider la temperatura de 4-5o C maxim o
săptamână, după care au fost reîmprospătate prin trecere pe mediul steril.
Metoda de evidenţiere a metabolismului glucidic cu mediul de cultură Hugh-
Leifson Glucidele (monozaharide, dizaharide, polizaharide) pot fi degradate de bacterii
urmând una
din cele două căi principale: oxidarea (în aerobioză) sau fermentaţia (în anaerobioză).
Tuburile se vor incuba la 37 oC timp de 24 ore sau mai mult, după care se va observa
modificarea culorii mediului de cultură (care a avut iniţial culoarea albastră). Se consideră că în
eprubetele în care indicatorul de pH şi-a modificat culoarea de la albastru la galben s-a produs
fermentaţia lactică a zaharului respectiv. Au fost utilizate următoarele zaharuri în concentraţie
finală de 1%: galactoză, lactoză, fructoză, maltoză, glucoză, zaharoză.

Metoda de cultivare pe incubatorul rotativ

Pentru cultivarea şi multiplicarea bacteriilor lactice au fost utilizate două medii de cultură şi
anume: mediul MRS lichid cu diferite concentraţii de glucoză ca unică sursă de carbon (0,5%,
1%, 2% si 3%), valori diferite de pH (4,5, 6,5 şi 8) şi cantităţi diferite de inocul ( 0,1 mL, 0,5 Ml,
1 ml, 3 ml).

Alte metode:

Determinarea absorbanţei la lungimea de undă de 600 nm la spectrofotometru;

Observaţia caracterelor microscopice ale bacteriilor lactice.

Aparatură:
7. Incubatorul rotativ tip Thermoshake
8. Microscopul optic
9. Spectrofotometru
10. Termostat
 11. Autoclav
12. Etuva

Rezultate
Caractere morfologice ale bacteriilor lactice izolate
Caracterele morfologice ale culturilor mixte de bacterii lactice au fost evidenţiate pe mediul
MRS lichid şi agarizat, după o dezvoltare de câteva zile la 37oC.
Pentru toate bacteriile lactice s-a observat tulbularea mediului lichid după 48 de ore de
termostatare urmată de depunere de sediment în următoarele zile. Pe mediul MRS agarizat
bacteriile lactice formează colonii de culoare albă sau crem cu aspect lucios şi diametrul de
aproximativ 1-2 mm.

Evidenţierea metabolismului glucidic pentru culturile de

bacterii lactice.
Evidenţierea metabolismului glucidic s-a efectuat conform metodei mentionate pe mediul
Hugh-Leifson. In urma fermentarii zaharului din eprubeta se formeaza acid lactic care scade
valoarea pH, iar indicatorul (albastru de bromtimol) isi schimba culoarea din albastru in
galben.

Fig 4. Aspectul culturilor pe mediul Hugh-Leifson după 48

ore
 Dezvoltarea culturilor de bacterii lactice pe incubatorul rotativ

Mediile de cultură folosite au fost mediul MRS lichid cu diferite concentraţii de glucoză şi
valori diferite de pH precum şi un mediu cu melasă şi săruri.
Culturile au fost dezvoltate pe un incubator rotativ prezentat în figura 5 la temperatura de
37oC precum şi static , la temperatura camerei ( aproximativ 20oC ).

Fig. 5. Aspectul culturilor de bacterii

lactice pe incubatorul rotativ.

Mediile de cultura au fost repartizate câte 200 de mL în baloane Ellermeyer de 500 mL şi au

fost sterilizate prin autoclavare timp de 20 minute la 121oC. După racirea mediilor acestea au fost
inoculate cu câte 1 mL inocul lichid din eprubete, reprezentând 0,5% inocul (Vol/Vol).
S-au recoltat probe în care s-a determinat absorbanţa la 600 nm ca un indicator al densităţii
celulare şi valoarea pH. Aceste marimi au fost reprezentate grafic în funcţie de durata de
dezvoltare.
Tab. . Valorile absorbantelor lichidului de cultura

Timp,h L.acidophilius L.delbrueckii L.rhamnosus

2 0.0162 0.0231 0.0336
4 0.226 0.348 0.860
5 0.404 0.538 1.487
6 0.241 x 10 0.095 x 10 0.110 x 10
24 0.892 x 10 0.648 x 10 0.611 x 10
26 0.885 x 10 0.703 x 10 1.127 x 10
 Tab. . Valorile pH in mediul de cultura

L.acidophilius
Timp, h L.delbrueckii L.rhamnosus

2 6,5 6,5 6,5

4 6,5 6,2 6,2
5 6,5 6 6
6 6,2 5,8 5,8
24 4 4 4
26 4 4 4

S-a urmărit în continuare studiul influenţei concentraţiei sursei de carbon, si a valorii iniţiale a
pH-ului asupra dezvoltării culturii de bacterii lactice.
Tab.5 Valorile SU% (refractometric) in mediul de cultura

Timp,h L. acidophilius L.delbrueckii L.rhamnosus

2 3.4 3.4 3,4
4 3,3 3.3 3,3
5 3.2 3.2 3,2
6 3.2 3 3
24 2,4 2 2.6
26 2.2 2 2.6

Tab. 6. Valorile absorbanţelor în mediile de cultura cu diferite concentraţii de glucoză pentru

tulpina de Lactobacillus acidophilus
Absorbanţa la 600 nm
glucoză
Timp, h 0,5% glucoză 1% glucoză 2% glucoză 3%
0 0,153 0,112 0,146 0,136
2 0,177 0,171 0,18 0,177
4 0,455 0,397 0,416 0,395
6 1,208 1,123 1,085 0,895
8 2,38 2,42 2,32 2,05
23 4,01 5,96 8,04 7,35
25 3,99 6,1 8,2 7,75
27 3,98 6,2 8,36 7,6
 Absorbanţa la 600 nm pentru medii cu diferite concentraţii de
glucoză

9
8 Absorbanţa la 600 nm
7 glucoză 0,5%
Abs. 600 nm

6 Absorbanţa la 600 nm
5 glucoză 1%
4 Absorbanţa la 600 nm
3 glucoza 2%
2 Absorbanţa la 600 nm
1 glucoză 3%
0
0 5 10 15 20 25 30
Timp, h

Fig. 9. Variaţia absorbanţei cu timpul de dezvoltare pentru diferite concentraţii de glucoză.

pentru tulpina de Lactobacillus acidophilus

Dependenţa dezvoltării culturilor lactice de pH iniţial

Influenţa pH iniţial in mediul de cultură a fost studiată prin modificarea pH prin adăugare de
HCl pentru 4,5 unităţi şi o soluţie NaOH de concentratie 10% pentru valoarea 8 a pH-ului.
Dezvoltarea culturilor a avut loc la 37oC, 150 rpm, timp de 27 ore.

Tab. . Valorile absorbanţelor la 600 nm pentru diferite valori ale pH-ului iniţial pentru tulpina de
Lactobacillus acidophilus

Absorbanţa la 600 nm
Timp, h
pH iniţial 4,5 pH iniţial 6,5 pH iniţial 8
0 0,147 0,146 0,118
2 0,202 0,18 0,248
4 0,252 0,416 0,954
6 0,354 1,085 2,005
8 0,51 2,32 3,03
23 4,91 8,04 7,33
25 5,71 8,2 7,75
27 5,65 8,36 8,05
 Absorbanţa la 600 nm pentru diferite valori de pH

9
8
7
Abs. 600 nm

6
pH iniţial 4,5
5
pH iniţial 6,5
4
pH iniţial 8
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30
Timp, h

Fig. 11. Variaţia absorbanţei pentru diferite valori de pH iniţial cu timpul de dezvoltare pentru
tulpina de Lactobacillus acidophilus

Din datele obţinute se poate observă o mai bună dezvoltare pentru mediile de cultură cu pH 8
şi 6,5 precum şi o inhibiţie a dezvoltării celulelor la pH acid.

Fermentatia lactica. Culturi de bacterii lactice

Materiale şi metode utilizate

Materiale utilizate

Materialul biologic
Pentru caracterizarea şi cultivarea unor bacterii lactice utilizate la obţinerea de preparate
probiotice s-au utilizat următoarele tulpini:
 Lactobacillus acidophilus

 Lactobacillus delbrueckii
  L. rhamnosus

Medii de cultură utilizate

Mediul pentru întreţinerea şi conservarea tulpinii:
- Mediu MRS lichid cu compoziţia următoare:
- peptonă...............................10g/L
- extract de carne..................5g/L
- extract de drojdie...............4g/L
- acetat de sodium................5g/L
- glucoză..............................20g/L
- fosfat bipotasic.................2g/L
 - citrat de sodium...............2g/L
- twen 80…..........................1mL
- sulfat de magneziu…........0,2mL
- sulfat de mangan..............0,04 mL
- apă distilată......................500 ml
- pH-ul =6,2-6,5
- autoclavare la 0,5 atm/ 30 min.
- Mediu MRS agarizat are aceeaşi compoziţie, în plus se adaugă 15% agar.
Mediul pentru evidenţierea metabolismului glucidic:
- Mediul HUGH-LEIFSON cu următoarea compoziţie:
- peptonă...............................2g/L
- extract de drojdie...............1g/L
- NaCl...................................5g/L
- K2HPO4.............................................0,2g/L
- albastru de bromtimol.........0,08g/L
- agar-agar..............................2,5g/L
- zahărul adăugat....................10g/L
- apă distilată.....................1000 mL
Mediul pentru cultivarea în submers a bacteriilor lactice:
- Mediul MRS lichid pentru care a fost modificată concentraţia de glucoză :
0,5%, 1%, 2% şi 3% şi pH-ul 4,5; 6,5 şi 8.
- Mediul cu melasă şi săruri cu următoarea compoziţie:
- Melasă............................45 g/L
- K2HPO4.....................................1,2 g/L
- (NH4)2SO4...............................0,6 g/L
Apă distilată..................1000 mL
 Metode utilizate
Metoda de întreţinere şi conservare
Culturile izolate din diferite produse lactate au fost însămânţate pe mediul MRS broth, în
eprubete şi termostatate timp de 48 ore la 37oC, după care se observă tulburarea mediului de
cultură datorită multiplicării celulare.
Pentru conservarea lor, culturile au fost păstrate la frigider la temperatura de 4-5o C maxim o
săptamână, după care au fost reîmprospătate prin trecere pe mediul steril.
Metoda de evidenţiere a metabolismului glucidic cu mediul de cultură Hugh-
Leifson Glucidele (monozaharide, dizaharide, polizaharide) pot fi degradate de bacterii
urmând una
din cele două căi principale: oxidarea (în aerobioză) sau fermentaţia (în anaerobioză).
Tuburile se vor incuba la 37 oC timp de 24 ore sau mai mult, după care se va observa
modificarea culorii mediului de cultură (care a avut iniţial culoarea albastră). Se consideră că în
eprubetele în care indicatorul de pH şi-a modificat culoarea de la albastru la galben s-a produs
fermentaţia lactică a zaharului respectiv. Au fost utilizate următoarele zaharuri în concentraţie
finală de 1%: galactoză, lactoză, fructoză, maltoză, glucoză, zaharoză.

Metoda de cultivare pe incubatorul rotativ

Pentru cultivarea şi multiplicarea bacteriilor lactice au fost utilizate două medii de cultură şi
anume: mediul MRS lichid cu diferite concentraţii de glucoză ca unică sursă de carbon (0,5%,
1%, 2% si 3%), valori diferite de pH (4,5, 6,5 şi 8) şi cantităţi diferite de inocul ( 0,1 mL, 0,5 Ml,
1 ml, 3 ml).

Alte metode:

Determinarea absorbanţei la lungimea de undă de 600 nm la spectrofotometru;

Observaţia caracterelor microscopice ale bacteriilor lactice.

Aparatură:
13. Incubatorul rotativ tip Thermoshake
14. Microscopul optic
15. Spectrofotometru
16. Termostat
 17. Autoclav
18. Etuva

Rezultate

Caractere morfologice ale bacteriilor lactice izolate

Caracterele morfologice ale culturilor mixte de bacterii lactice au fost evidenţiate pe mediul
MRS lichid şi agarizat, după o dezvoltare de câteva zile la 37oC.
Pentru toate bacteriile lactice s-a observat tulbularea mediului lichid după 48 de ore de
termostatare urmată de depunere de sediment în următoarele zile. Pe mediul MRS agarizat
bacteriile lactice formează colonii de culoare albă sau crem cu aspect lucios şi diametrul de
aproximativ 1-2 mm.

Evidenţierea metabolismului glucidic pentru culturile de bacterii lactice.

Evidenţierea metabolismului glucidic s-a efectuat conform metodei mentionate pe mediul
Hugh-Leifson. In urma fermentarii zaharului din eprubeta se formeaza acid lactic care scade
valoarea pH, iar indicatorul (albastru de bromtimol) isi schimba culoarea din albastru in
galben.

Fig 4. Aspectul culturilor pe mediul Hugh-Leifson după 48

ore
 Dezvoltarea culturilor de bacterii lactice pe incubatorul rotativ

Mediile de cultură folosite au fost mediul MRS lichid cu diferite concentraţii de glucoză şi
valori diferite de pH precum şi un mediu cu melasă şi săruri.
Culturile au fost dezvoltate pe un incubator rotativ prezentat în figura 5 la temperatura de
37oC precum şi static , la temperatura camerei ( aproximativ 20oC ).

Fig. 5. Aspectul culturilor de bacterii

lactice pe incubatorul rotativ.

Mediile de cultura au fost repartizate câte 200 de mL în baloane Ellermeyer de 500 mL şi au

fost sterilizate prin autoclavare timp de 20 minute la 121oC. După racirea mediilor acestea au fost
inoculate cu câte 1 mL inocul lichid din eprubete, reprezentând 0,5% inocul (Vol/Vol).
S-au recoltat probe în care s-a determinat absorbanţa la 600 nm ca un indicator al densităţii
celulare şi valoarea pH. Aceste marimi au fost reprezentate grafic în funcţie de durata de
dezvoltare.
Tab. . Valorile absorbantelor lichidului de cultura

Timp,h L.acidophilius L.delbrueckii L.rhamnosus

2 0.0162 0.0231 0.0336
4 0.226 0.348 0.860
5 0.404 0.538 1.487
6 0.241 x 10 0.095 x 10 0.110 x 10
24 0.892 x 10 0.648 x 10 0.611 x 10
26 0.885 x 10 0.703 x 10 1.127 x 10
 Tab. . Valorile pH in mediul de cultura

L.acidophilius
Timp, h L.delbrueckii L.rhamnosus

2 6,5 6,5 6,5

4 6,5 6,2 6,2
5 6,5 6 6
6 6,2 5,8 5,8
24 4 4 4
26 4 4 4

S-a urmărit în continuare studiul influenţei concentraţiei sursei de carbon, si a valorii iniţiale a
pH-ului asupra dezvoltării culturii de bacterii lactice.
Tab.5 Valorile SU% (refractometric) in mediul de cultura

Timp,h L. acidophilius L.delbrueckii L.rhamnosus

2 3.4 3.4 3,4
4 3,3 3.3 3,3
5 3.2 3.2 3,2
6 3.2 3 3
24 2,4 2 2.6
26 2.2 2 2.6

Tab. 6. Valorile absorbanţelor în mediile de cultura cu diferite concentraţii de glucoză pentru

tulpina de Lactobacillus acidophilus
Absorbanţa la 600 nm
glucoză
Timp, h 0,5% glucoză 1% glucoză 2% glucoză 3%
0 0,153 0,112 0,146 0,136
2 0,177 0,171 0,18 0,177
4 0,455 0,397 0,416 0,395
6 1,208 1,123 1,085 0,895
8 2,38 2,42 2,32 2,05
23 4,01 5,96 8,04 7,35
25 3,99 6,1 8,2 7,75
27 3,98 6,2 8,36 7,6
 Absorbanţa la 600 nm pentru medii cu diferite concentraţii de
glucoză

9
8 Absorbanţa la 600 nm
7 glucoză 0,5%
Abs. 600 nm

6 Absorbanţa la 600 nm
5 glucoză 1%
4 Absorbanţa la 600 nm
3 glucoza 2%
2 Absorbanţa la 600 nm
1 glucoză 3%
0
0 5 10 15 20 25 30
Timp, h

Fig. 9. Variaţia absorbanţei cu timpul de dezvoltare pentru diferite concentraţii de glucoză.

pentru tulpina de Lactobacillus acidophilus

Dependenţa dezvoltării culturilor lactice de pH iniţial

Influenţa pH iniţial in mediul de cultură a fost studiată prin modificarea pH prin adăugare de
HCl pentru 4,5 unităţi şi o soluţie NaOH de concentratie 10% pentru valoarea 8 a pH-ului.
Dezvoltarea culturilor a avut loc la 37oC, 150 rpm, timp de 27 ore.

Tab. . Valorile absorbanţelor la 600 nm pentru diferite valori ale pH-ului iniţial pentru tulpina de
Lactobacillus acidophilus

Absorbanţa la 600 nm
Timp, h
pH iniţial 4,5 pH iniţial 6,5 pH iniţial 8
0 0,147 0,146 0,118
2 0,202 0,18 0,248
4 0,252 0,416 0,954
6 0,354 1,085 2,005
8 0,51 2,32 3,03
23 4,91 8,04 7,33
25 5,71 8,2 7,75
27 5,65 8,36 8,05
 Absorbanţa la 600 nm pentru diferite valori de pH

9
8
7
Abs. 600 nm

6
pH iniţial 4,5
5
pH iniţial 6,5
4
pH iniţial 8
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30
Timp, h

Fig. 11. Variaţia absorbanţei pentru diferite valori de pH iniţial cu timpul de dezvoltare pentru
tulpina de Lactobacillus acidophilus

Din datele obţinute se poate observă o mai bună dezvoltare pentru mediile de cultură cu pH 8
şi 6,5 precum şi o inhibiţie a dezvoltării celulelor la pH acid.

Fermentatia lactica. Culturi de bacterii lactice

Materiale şi metode utilizate

Materiale utilizate

Materialul biologic
Pentru caracterizarea şi cultivarea unor bacterii lactice utilizate la obţinerea de preparate
probiotice s-au utilizat următoarele tulpini:
 Lactobacillus acidophilus

 Lactobacillus delbrueckii
  L. rhamnosus

Medii de cultură utilizate

Mediul pentru întreţinerea şi conservarea tulpinii:
- Mediu MRS lichid cu compoziţia următoare:
- peptonă...............................10g/L
- extract de carne..................5g/L
- extract de drojdie...............4g/L
- acetat de sodium................5g/L
- glucoză..............................20g/L
- fosfat bipotasic.................2g/L
 - citrat de sodium...............2g/L
- twen 80…..........................1mL
- sulfat de magneziu…........0,2mL
- sulfat de mangan..............0,04 mL
- apă distilată......................500 ml
- pH-ul =6,2-6,5
- autoclavare la 0,5 atm/ 30 min.
- Mediu MRS agarizat are aceeaşi compoziţie, în plus se adaugă 15% agar.

Mediul pentru evidenţierea metabolismului glucidic:

- Mediul HUGH-LEIFSON cu următoarea compoziţie:
- peptonă...............................2g/L
- extract de drojdie...............1g/L
- NaCl...................................5g/L
- K2HPO4.............................................0,2g/L
- albastru de bromtimol.........0,08g/L
- agar-agar..............................2,5g/L
- zahărul adăugat....................10g/L
- apă distilată.....................1000 mL

Mediul pentru cultivarea în submers a bacteriilor

lactice:
- Mediul MRS lichid pentru care a fost modificată concentraţia de glucoză :
0,5%, 1%, 2% şi 3% şi pH-ul 4,5; 6,5 şi 8.
- Mediul cu melasă şi săruri cu următoarea compoziţie:
- Melasă............................45 g/L
- K2HPO4.....................................1,2 g/L
- (NH4)2SO4...............................0,6 g/L
Apă distilată..................1000 mL
 Metode utilizate
Metoda de întreţinere şi conservare
Culturile izolate din diferite produse lactate au fost însămânţate pe mediul MRS broth, în
eprubete şi termostatate timp de 48 ore la 37oC, după care se observă tulburarea mediului de
cultură datorită multiplicării celulare.
Pentru conservarea lor, culturile au fost păstrate la frigider la temperatura de 4-5o C maxim o
săptamână, după care au fost reîmprospătate prin trecere pe mediul steril.
Metoda de evidenţiere a metabolismului glucidic cu mediul de cultură Hugh-
Leifson Glucidele (monozaharide, dizaharide, polizaharide) pot fi degradate de bacterii
urmând una
din cele două căi principale: oxidarea (în aerobioză) sau fermentaţia (în anaerobioză).
Tuburile se vor incuba la 37 oC timp de 24 ore sau mai mult, după care se va observa
modificarea culorii mediului de cultură (care a avut iniţial culoarea albastră). Se consideră că în
eprubetele în care indicatorul de pH şi-a modificat culoarea de la albastru la galben s-a produs
fermentaţia lactică a zaharului respectiv. Au fost utilizate următoarele zaharuri în concentraţie
finală de 1%: galactoză, lactoză, fructoză, maltoză, glucoză, zaharoză.

Metoda de cultivare pe incubatorul rotativ

Pentru cultivarea şi multiplicarea bacteriilor lactice au fost utilizate două medii de cultură şi
anume: mediul MRS lichid cu diferite concentraţii de glucoză ca unică sursă de carbon (0,5%,
1%, 2% si 3%), valori diferite de pH (4,5, 6,5 şi 8) şi cantităţi diferite de inocul ( 0,1 mL, 0,5 Ml,
1 ml, 3 ml).

Alte metode:

Determinarea absorbanţei la lungimea de undă de 600 nm la spectrofotometru;

Observaţia caracterelor microscopice ale bacteriilor lactice.

Aparatură:
19. Incubatorul rotativ tip Thermoshake
20. Microscopul optic
21. Spectrofotometru
22. Termostat
 23. Autoclav
24. Etuva

Rezultate
Caractere morfologice ale bacteriilor lactice izolate
Caracterele morfologice ale culturilor mixte de bacterii lactice au fost evidenţiate pe mediul
MRS lichid şi agarizat, după o dezvoltare de câteva zile la 37oC.
Pentru toate bacteriile lactice s-a observat tulbularea mediului lichid după 48 de ore de
termostatare urmată de depunere de sediment în următoarele zile. Pe mediul MRS agarizat
bacteriile lactice formează colonii de culoare albă sau crem cu aspect lucios şi diametrul de
aproximativ 1-2 mm.

Evidenţierea metabolismului glucidic pentru culturile de

bacterii lactice.
Evidenţierea metabolismului glucidic s-a efectuat conform metodei mentionate pe mediul
Hugh-Leifson. In urma fermentarii zaharului din eprubeta se formeaza acid lactic care scade
valoarea pH, iar indicatorul (albastru de bromtimol) isi schimba culoarea din albastru in
galben.

Fig 4. Aspectul culturilor pe mediul Hugh-Leifson după 48

ore
 Dezvoltarea culturilor de bacterii lactice pe incubatorul rotativ

Mediile de cultură folosite au fost mediul MRS lichid cu diferite concentraţii de glucoză şi
valori diferite de pH precum şi un mediu cu melasă şi săruri.
Culturile au fost dezvoltate pe un incubator rotativ prezentat în figura 5 la temperatura de
37oC precum şi static , la temperatura camerei ( aproximativ 20oC ).

Fig. 5. Aspectul culturilor de bacterii

lactice pe incubatorul rotativ.

Mediile de cultura au fost repartizate câte 200 de mL în baloane Ellermeyer de 500 mL şi au

fost sterilizate prin autoclavare timp de 20 minute la 121oC. După racirea mediilor acestea au fost
inoculate cu câte 1 mL inocul lichid din eprubete, reprezentând 0,5% inocul (Vol/Vol).
S-au recoltat probe în care s-a determinat absorbanţa la 600 nm ca un indicator al densităţii
celulare şi valoarea pH. Aceste marimi au fost reprezentate grafic în funcţie de durata de
dezvoltare.
Tab. . Valorile absorbantelor lichidului de cultura

Timp,h L.acidophilius L.delbrueckii L.rhamnosus

2 0.0162 0.0231 0.0336
4 0.226 0.348 0.860
5 0.404 0.538 1.487
6 0.241 x 10 0.095 x 10 0.110 x 10
24 0.892 x 10 0.648 x 10 0.611 x 10
26 0.885 x 10 0.703 x 10 1.127 x 10
 Tab. . Valorile pH in mediul de cultura

L.acidophilius
Timp, h L.delbrueckii L.rhamnosus

2 6,5 6,5 6,5

4 6,5 6,2 6,2
5 6,5 6 6
6 6,2 5,8 5,8
24 4 4 4
26 4 4 4

S-a urmărit în continuare studiul influenţei concentraţiei sursei de carbon, si a valorii iniţiale a
pH-ului asupra dezvoltării culturii de bacterii lactice.
Tab.5 Valorile SU% (refractometric) in mediul de cultura

Timp,h L. acidophilius L.delbrueckii L.rhamnosus

2 3.4 3.4 3,4
4 3,3 3.3 3,3
5 3.2 3.2 3,2
6 3.2 3 3
24 2,4 2 2.6
26 2.2 2 2.6

Tab. 6. Valorile absorbanţelor în mediile de cultura cu diferite concentraţii de glucoză pentru

tulpina de Lactobacillus acidophilus
Absorbanţa la 600 nm
glucoză
Timp, h 0,5% glucoză 1% glucoză 2% glucoză 3%
0 0,153 0,112 0,146 0,136
2 0,177 0,171 0,18 0,177
4 0,455 0,397 0,416 0,395
6 1,208 1,123 1,085 0,895
8 2,38 2,42 2,32 2,05
23 4,01 5,96 8,04 7,35
25 3,99 6,1 8,2 7,75
27 3,98 6,2 8,36 7,6
 Absorbanţa la 600 nm pentru medii cu diferite concentraţii de
glucoză

9
8 Absorbanţa la 600 nm
7 glucoză 0,5%
Abs. 600 nm

6 Absorbanţa la 600 nm
5 glucoză 1%
4 Absorbanţa la 600 nm
3 glucoza 2%
2 Absorbanţa la 600 nm
1 glucoză 3%
0
0 5 10 15 20 25 30
Timp, h

Fig. 9. Variaţia absorbanţei cu timpul de dezvoltare pentru diferite concentraţii de glucoză.

pentru tulpina de Lactobacillus acidophilus

Dependenţa dezvoltării culturilor lactice de pH iniţial

Influenţa pH iniţial in mediul de cultură a fost studiată prin modificarea pH prin adăugare de
HCl pentru 4,5 unităţi şi o soluţie NaOH de concentratie 10% pentru valoarea 8 a pH-ului.
Dezvoltarea culturilor a avut loc la 37oC, 150 rpm, timp de 27 ore.

Tab. . Valorile absorbanţelor la 600 nm pentru diferite valori ale pH-ului iniţial pentru tulpina de
Lactobacillus acidophilus

Absorbanţa la 600 nm
Timp, h
pH iniţial 4,5 pH iniţial 6,5 pH iniţial 8
0 0,147 0,146 0,118
2 0,202 0,18 0,248
4 0,252 0,416 0,954
6 0,354 1,085 2,005
8 0,51 2,32 3,03
23 4,91 8,04 7,33
25 5,71 8,2 7,75
27 5,65 8,36 8,05
 Absorbanţa la 600 nm pentru diferite valori de pH

9
8
7
Abs. 600 nm

6
pH iniţial 4,5
5
pH iniţial 6,5
4
pH iniţial 8
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30
Timp, h

Fig. 11. Variaţia absorbanţei pentru diferite valori de pH iniţial cu timpul de dezvoltare pentru
tulpina de Lactobacillus acidophilus

Din datele obţinute se poate observă o mai bună dezvoltare pentru mediile de cultură cu
pH 8 şi 6,5 precum şi o inhibiţie a dezvoltării celulelor la pH acid.

EVIDENŢIEREA MICROORGANISMELOR
PRODUCĂTOARE DE ENZIME AMILOLITICE

Principalele enzime microbiene care hidrolizează amidonul sunt -amilaza, -amilaza şi

glucoamilaza, enzime extracelulare produse de bacterii, mucegaiuri şi de drojdii. Bacteriile din
genul Bacillus ( B. subtillis, B. licheniformis, B. macerans, B. stearothermophillus) sunt
producătoare de amilaze active la 50-60 oC, termostabile şi folosite pentru obţinerea amilazelor
industriale. Alte specii de Bacillus cum sunt: B. cereus, B. megaterium, B. polymixa sunt
producătoare de -amilază, enzimă zaharogenă, care prin hidroliza legăturilor glucozidice
eliberează molecule de maltoză.
Mucegaiurile produc mai ales -amilaza şi glucoamilaza (Aspergillus, Mucor şi
Rhizopus), deosebindu-se prin raportul între aceste două enzime sintetizate. Dintre drojdii, cei
mai importanţi din acest punct de vedere sunt reprezentanţii genurilor Saccharomycopsis,
Tricosporon, Candida. Tipuri de amilaze
Amilazele sunt clasificate in functie de modul de hidroliza a restului glicozidic.
α- Amilaza (EC 3.2.1.1)
Sunt endoamilaze capabile sa hidrolizeze legaturile α,1-4 glicozidice din interiorul moleculei de
amiloza si amilopectina. Aceasta enzima este cunoscuta si sub numele de endoamilaza si a fost
gasita in numeroase microorganisme, bacterii si fungi. Produsele final al α-amilazelor sunt
oligozaharidele de diferite lungimi si configuratii si dextrinele limita (oligozaharide ramificate).
Sunt calciu- metaloenzime. Ele hidrolizeaza la intamplare lantul de amidon, eliberand in final
maltotrioza si maltoza din amiloza sau maltoza, glucoza si dextrina limita din amilopectina. Este
produsa indeosebi de genul Bacillus.

β- Amilaza (E.C. 3.2.1.2)

Aceste amilaze sunt exoamilaze, care scindeaza exclusiv legaturile α,1-4 glicozidice si elibereaza
maltoza si beta-dextrina limita.
Amiloglucozidaza (glucoamilaza) (E.C. 3.2.1.3) elibereaza glucoza de la capatul terminal al
amilozei si amilopectinei si din oligozaharide.

γ-Amilaza (EC 3.2.1.3)

γ-amilaza sau amilaza de deramificare scindeaza legaturile α,(1-6) glicozidice.
Principiul metodei: evidenţierea enzimelor amilolitice produse de către coloniile microbiene
poate fi efectuată utilizând un mediu de cultură solidificat, conţinând amidon. Sub acţiunea
amilazelor ce difuzează în gelul de agar, amidonul este scindat hidrolitic şi, în urma adaosului de
solutie Lugol (I2 / KI), zona din jurul coloniilor producătoare nu se mai colorează în brun.
Valoarea raportului între diametrul zonei de hidroliză şi diametrul coloniei sau indicele
amilolitic, este o măsură a cantităţii de enzimă produsă de microorganismul testat.

Materiale utilizate:
- cultura microbiană
- plăci Petri
- mediul de cultură: - extract de drojdie.......................4 g
- amidon solubil.......................10 g
- K2HPO4..................................................1 g
- Mg SO4.7H2O....................0,5 g
- agar-agar..............................20 g
- apă distilată......................1000 ml
- I2
- KI
- ac de inoculare
- termostat
- lampă bactericidă
- bec de gaz
- autoclav

Mod de lucru: Mediul se sterilizează în autoclav timp de 15 minute, la 121oC, după care se
toarnă în cutii Petri şi se lasă să se solidifice. Plăcile sunt apoi însămânţate prin înţepare centrală
sau din diluţii decimale ale microorganismului de testat.Termostatarea se face timp de 72 ore
pentru bacterii şi 5 zile pentru mucegaiuri. Pentru determinarea diametrului zonei de liză a
amidonului, peste mediul din plăci se toarnă soluţie Lugol şi se măsoară diametrul coloniei şi cel
al zonei rămase necolorate. Se calculează indicele amilolitic astfel:

zona de hidroliză a amidonului

colonie

Figura 11. Evidenţierea microorganismelor producătoare de enzime amilolitice

diametrul zonei de liza a amidonului

IA  diametrul coloniei
 In imagine se observa colonia de mucegai, de culoare alb-galben. Mediul de cultura s-a
colorat in violet din cauza reactiei dintre iod si amidonul din mediu. In jurul coloniei se observa
o zona incolora, datorata absentei amidonului, care a fost hidrolizat la glucoza (care nu se
coloreaza cu iodul).
Alte exemple: