Micetele. Taxonomia și nomenclatura.

Ultrastructura micetelor. Metodele de

evidenţiere. Cultivarea micetelor.
Diagnosticul de laborator al micozelor.
Examenul micologic
 Regatul fungic cuprinde un grup divers și bogat de
organisme, de la drojdii microscopice la ciuperci.
 Din cele peste 100.000 de specii de fungi, doar aproximativ
200 sunt patogene pentru oameni și animale.
 Obiectul de studiu al Micologiei medicale reprezintă fungii
microscopici care provoacă stări patologice la om.
 În ultimii ani infecțiile fungice umane devin din ce în ce
mai frecvente, în special printre pacienții
imunocompromiși.
Prin urmare, este important să înțelegem caracteristicile
microbiologice, patogeneza și clinica acestor boli.
 Micetele sunt eucariote cu un nivel mai ridicat de
complexitate biologică decât bacteriile.
 Pot fi unicelulare sau pot să se diferențieze și devin
multicelulare prin dezvoltarea unor filamente lungi,
ramificate.
 Sunt purtătoare de spori, reproducându-se atât sexuat,
cât și asexuat.
 Le lipsește clorofila plantelor, de aceea trebuie să
dobândească substanțe nutritive din mediul extern.
 Bolile cauzate de fungi se numesc micoze. Aceste
infecții variază foarte mult în manifestările lor, dar au
tendința de a prezenta caracteristici subacute sau
cronice, adesea recidivând în timp.
 Clasificarea sistematică:
- Regnul Fungi
- Phylum Ascomycota, Zygomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota,
Glomeromycota.
Genurile importante din punct de vedere medical sunt incluse în
Ascomycota (80%), cu câteva în Basidiomycota și Zygomycota.
 Clasificarea morfologică (mucegaiuri, levuri, ciuperci levuriforme, fungi
dimorfi; septarea hifelor; tipul sporilor, etc)
 Clasificarea medicală (dermatofiți, fungi oportuniști, agenți patogeni
sistemici)
 Clasificarea molecular-genetică
 Unitatea structurală și funcțională a fungilor este celula, cu o structură
specifică și o compoziție particulară.
 Dimensiunea fungilor variază enorm. O singură celulă fără septuri
transversale poate varia de la dimensiunea bacteriană (2-4 μm) la o
structură vizibilă macroscopic.
 Celula fungică are caracteristici eucariote tipice, inclusiv un nucleu cu un
nucleol, membrană nucleară și cromozomi liniari.
 Citoplasma conține un citoschelet cu microfilamente de actină și
microtubuli care conțin tubulină.
 Ribozomi și organite, cum ar fi mitocondriile, reticulul endoplasmatic și
aparatul Golgi.
Are dimensiunile cuprinse între 10-15 µm.
Caracteristici:
1) Absența capsulei (singura excepție:
Cryptococcus neoformans).
2) Perete celular este mai îngroșat și mai
rigid, absentează peptidoglicanul și acizii
teichoici.
3) Conține: polizaharide (75%- chitină,
celuloză) + proteine ​(20%) + lipide (5%).
4) În unele ciuperci se atestă prezența
melaninei.
5) Membrana celulara prezintă componenți
sterolici.
6) În zona citoplasmatică există organite
membranare-reticul endoplasmatic,
mitocondrii, ribozomi 80S, nucleu bine
definit, aparat Golgi, vacuole și diferite
incluziuni (ex: volutină).
7) Absența facilităților de locomoție (flageli,
cili, pseudopode). 8) Disponibilizează de
puține sisteme (spre deosebire de bacterii)
pentru a ataca celulele gazdă.
 Celulele fungice au un perete celular rigid exterior
membranei citoplasmatice.
 Structura chimică a peretelui celular din fungi este
semnificativ diferită de cea a celulelor bacteriene:
- nu conține peptidoglican, glicerol, acizi teichoici
sau lipopolizaharide.
- conține polizaharide complexe, cum ar fi manani,
glucani și chitine în asociere strânsă între ele și cu
proteine ​structurale.
 Manoproteinele sunt importante imunogene, inducând producerea
anticorpilor specifici. Variațiile potențiale ale compoziției permit
fungilor să evite detectarea lor de către gazda infectată.
 Alfa și beta-glucanii sunt polimeri ai glucozei prezenți pe toată
suprafața celulei
 Chitina, compusă din lanțuri lungi de N-acetilglucozamină, oferă un
suport structural rigid celulei fungice
 Pe lângă rolul lor structural, acești carbohidrați din peretele celular
îndeplinesc funcții celulare complexe, de multe ori acționând
simultan și inhibând diferite procese ale răspunsului imun al gazdei.
 Pe lângă peretele celular, o altă diferență importantă față de
celulele mamiferelor și ale bacteriilor este compoziția
sterolică a membranei citoplasmatice.
 În celulele mamiferelor, sterolul membranar dominant este
colesterolul; în fungi este ergosterolul, bacteriile nu conțin
steroli în membrana citoplasmatică.
 Fungii sunt de obicei haploizi în conținutul lor de ADN,
deși nucleele diploide se formează prin fuziune nucleară în
procesul de reproducere sexuată.
Fungii care cauzează infecții la om pot fi diferențiați pe
baza caracterelor morfostructurale în:

 Fungi filamentoși (mucegaiuri)

 Levuri și ciuperci levuriforme
 Fungi dimorfi
 Fungii filamentoși (mucegaiurile) constau din celule filamentoase
tubulare unite între ele; aceste filamente se numesc hife.
 Hifele au funcții multiple asociate cu creșterea, nutriția și
reproducerea.
 La majoritatea tipurilor de mucegai hifele conțin pereți transversali
numiți septuri, care le împart în unități celulare uninucleate distincte -
hife septate.
 Structura acestor septuri variază între specii și poate conține pori și
pereți incompleti care permit mișcarea nutrienților, a organitelor și a
nucleelor între celulele adiacente.
 La unele clase de fungi hifele nu conțin septuri și apar ca celule
lungi, continue, cu multe nuclee - hife neseptate/coenocitice.
 Când condițiile de mediu sunt adecvate, hifele cresc pentru a forma o
masă filamentoasă numită miceliu (tal), vizibilă cu ochiul liber.
Miceliile fungilor filamentoși constau din hife interconectate care cresc
la vârfurile lor și se ramifică subapic.
 Creșterea apicală poate atinge viteze mai mari de 1 µm / s.
 Porțiunea miceliului care crește în mediu sau substrat organic și
asigură obținerea substanțelor nutritive se numește miceliu vegetativ;
porțiunea ce crește pe suprafața mediului este miceliul aerian,
constituit din hife reproductive (fertile), care poartă spori de
reproducere.
 Reprezentanți – Mucor, Aspergillus, Penicillium.
 Genul Mucor (Clasa Phycomycetes)
Implică organisme pluricelulare, mai este numit și mucegaiul clavelat.
Hifele au un aspect filamentos și tubular (lungimea de 5-50 µm; diametrul 2-10 µm) - creșterea lor este în
sens apical, până la câțiva centimetri în înălțime.
 Unele hife sunt împărțite în compartimente de pereți transverși și poroși.
 Hifele septate au cel puțin 1 nucleu per compartiment.
1. Hifele aseptate, prezintă nuclei liberi în protoplasmă.
 Creșterea și ramificarea hifelor formează miceliu, organizat într-o parte vegetativă (hife vegetative
sau hife de substrat, sunt anucleate, localizate pe / în substrat pentru a obține nutrienții) și într-o
partea reproductivă- hife aeriene.
 Fungii Mucor se multiplică și pe cale
sexuată. Ei sunt larg răspândiți în
natură. Deseori sunt decelați în pîine,
legume, pe suprafețele obiectelor
umede, în gunoiul de grajd, sol, apă.
 Peste 15 specii patogene de Mucor
pot cauza boli la om- mucoromicoze:
leziuni în plămâni și ficat, care prin
evoluția clinică simulează
tuberculoza, keratite, otomicoze,
dermatomicoze, procese infecțioase
generalizate.
 Ascomicetele sunt niște fungi cu bursă având
miceliul multicelular. Se multiplică prin ascospori
(sexuat) și prin conidii (asexuat).
 Din clasa dată face parte genul Aspergillus.
 Fungii din acest gen au un miceliu septat și
conidiospor unicelular, pe capătul lui superior se
situează în evantai o serie de stergime scurte, de la
care deviază lanțuri de spori- conidii. În examenul
microscopic al aspergiilor, amplasarea exosporilor
în partea fructificantă, amintește jeturi de apă
turnată din stropitoare, de aici și denumirea de
mucegai stropit.
 Peretele celular ai acestor ciuperci este o
structură complexă compusă în principal din
polizaharide. Principalele polizaharide
implicate include:
 α- glucani (în principal α-1,3-glucan, dar și
cantități mici de α-1,4-glucan),
 β-glucani (β-1,3- glucan cu ramuri
β-1,6- ), galactomannan și chitină).
Galactomannoproteinele,
 proteinele ancorate,
 proteinele de suprafață și alte proteine ​
se găsesc, de asemenea, în peretele celular.
 A. Oryzae
 A. Niger A. Flavus formează
Prezintă conidiofor cu conidioforii drepţi
cap conidial sferic şi şi capul conidial
două rânduri de sferic cu un
fialide dispuse pe singur rând de
toată suprafaţa fialide. Este
veziculei.
numită
„arsenalul
enzimelor”
 Penicillium este o ciupercă saprofită, cunoscută în mod
obișnuit ca mucegai albastru sau verde.
 Corpul vegetativ este micelial.
 Miceliul este ramificat în profuzie cu hife septate, compuse
din celule cu pereți subțiri care conțin de la unul până la
mai mulți nuclei. Fiecare sept are un por central, prin care
se menține continuitatea citoplasmatică.
 Unele micelii cresc mai adânc în substrat pentru a absorbi
materialul alimentar, iar altele rămân pe substrat și cresc o
pâslă miceliană. În partea superioară conidioforul este
ramificat.
 La capetele lui se formează sterigme de la care deviază serii
de conidii moniliforme.
 Levurile sunt ciuperci unicelulare care cresc de obicei într-o formă
celulară sferică sau ovală, dar în funcție de specie se pot întâlni forme
elipsoidale, triunghiulare, fuziforme. Se înmulțesc prin înmugurire sau
diviziune binară.
 La înmugurire celula-mamă formează o excrescență exterioară (mugure).
Pe măsură ce mugurele se alungește, nucleul celulei se divide și un nucleu
migrează în mugure. Peretele celular formează ulterior un sept între
mugure și celula-mamă, iar mugurele se desprinde în cele din urmă. O
celulă de drojdie poate produce în timp până la 24 de celule fiice prin
înmugurire.
 Ciupercile levuriforme (ex.: Candida) au aceleași caractere ca și
drojdiile, dar produc muguri ce nu reușesc să se desprindă; acești muguri
formează un scurt lanț de celule numit pseudohifă (pseudomiceliu).
 Unii fungi, mai ales speciile patogene, prezintă dimorfism - două
forme de creștere.
 Fungii dimorfi pot crește fie ca fungi filamentoși, fie ca levuri.
Formele asemănătoare mucegaiului produc hife vegetative și aeriene;
formele de drojdie se reproduc prin înmugurire. Dimorfismul în
fungii patogeni este dependent de temperatură: la 35-37 ° C fungul
este levuriform și la 25 °C are aspect de mucegai.
 Dimorfismul din fungi este reversibil și are importanță în virulența
fungilor. De ex: C. albicans se atașează la celulele epiteliale umane
ca o drojdie, dar necesită pseudohife pentru a invada țesuturile.
 Înmulțirea fungilor este un proces extrem de important pentru că el
contribuie esențial la menținerea distribuției lor în biotopuri
specifice.
 Fungii se pot înmulți pe cale:
vegetativă
asexuată
sexuată
Forma asexuată se numește anamorfă, iar elementele sale reproductive
sunt denumite conidii.
Forma sexuată se numește teleomorfă și structurile sale de reproducere
sunt numite spori (de exemplu, ascospori, zigospori, basidiospori).
 Reproducerea asexuată implică divizarea mitotică a
nucleului haploid și este asociată cu producerea prin
înmugurite a conidiilor, asemănătoare sporilor sau,
alternativ, prin separarea elementelor hifale.
 În reproducerea sexuată nucleii haploizi ai celulelor
donatorului și acceptorului fuzionează pentru a forma un
nucleu diploid, care apoi se împarte prin meioză clasică.
Unii dintre cei patru nucleii haploizi rezultați pot fi
recombinați genetic și pot suferi o divizare suplimentară
prin mitoză.
 Sporii asexuați sunt produși de o celulă fungică prin mitoză și diviziunea
celulară ulterioară; nu există nicio fuziune a nucleelor ​celulelor.
 Două tipuri de spori asexuați sunt produse de fungi:
1. Conidiosporul sau conidia, un spor unicelular sau multicelular care nu este
închis într-un sac. Tipuri de conidii:
 Conidii produse în lanț la capătul unui conidiofor. Astfel de spori sunt
produși de Penicillium și Aspergillus.
 Conidii formate din fragmentarea unei hife septate în celule unice, ușor
îngroșate, numite arthroconidii (Coccidioides immitis).
 Blastoconidia se formează din mugurii celulei-mamă. Astfel de spori se
găsesc în unele levuri, cum ar fi Candida albicans și Cryptococcus.
 Chlamydoconidia este un spor cu pereți groși format prin rotunjire și mărire
în cadrul unui segment hifal (Candida albicans )
2. Sporangiosporii, formați într-un sporangiu, la capătul
unei hife aeriene numite sporangiofor.
Sporangiul poate conține sute de sporangiospori. Astfel
de spori sunt produși de Rhizopus, Mucor?.
Sporii asexuați sunt formați de un singur organism.
Când acești spori germinează, devin microorganisme
identice genetic cu celula-mamă.
 Sporii sexuați produși de fungi caracterizează phylul
(ascospori, zigospori, basidiospori).
 Cel mai frecvent spor sexuat este denumit ascospor. Patru
sau opt ascospori pot fi găsiți într-o structură asemănătoare
unui sac - ascusul.
 Organismele care cresc din spori sexuați vor avea
caracteristicile genetice ale ambelor tulpini parentale.
 Identificarea clinică se bazează pe examinarea microscopică
a spori asexuați, deoarece majoritatea fungilor prezintă doar
spori asexuați în medii de cultură.
 Micetele sunt chemoheterotrofe și, asemănător bacteriilor, absorb
substanțele nutritive.
 Diversitatea metabolică printre fungi este mare, dar majoritatea sunt
capabili să crească cu surse foarte simple de carbon și azot.
 În natură, substanțele nutritive pentru fungii care trăiesc liber sunt
derivate din materia organică în descompunere.
 Majoritatea fungilor sunt aerobi stricți, deși unii fungi pot crește în
condiții anaerobe.
 Levurile sunt capabile de creștere anaerobă facultativă, care permite
acestor ciuperci să supraviețuiască în diverse medii. În prezența
oxigenului drojdiile efectuează respirație aerobă pentru a metaboliza
carbohidrații în dioxid de carbon și apă; în lipsa oxigenului fermentează
carbohidrații și produc etanol și dioxid de carbon.
 Fungii cresc de obicei mai bine într-un mediu cu un pH de
aproximativ 5 (bacteriile -7,2 – 7,4)
 Majoritatea fungilor sunt mai rezistenți la presiunea osmotică decât
bacteriile (cresc în medii cu concentrații relativ ridicade de zahăr sau
de sare).
 Fungii pot crește pe substrate cu umiditate redusă, în general prea
scăzută pentru a susține dezvoltarea bacteriilor.
 Fungii necesită mai puțin azot decât bacteriile pentru creștere.
 Fungii sunt capabili să metabolizeze carbohidrați complecși, cum ar
fi lignina (componentă a lemnului).
 Particularitățile metabolice ale numeroșilor fungi face imposibilă
obținerea unui mediu standard pentru toate speciile de interes
medical. Cele mai adaptate medii sunt:
 Sabouraud cu cloramfenicol și gentamicină (inhibă dezvoltarea
bacteriilor contaminante)
 Czapek-Dox agar (mediu semisintetic ce conține zaharoză, săruri de
Fe, Mg, K, nitrat de Na ca unică sursă de azot)
 PDA (potato dextrose agar)
 Medii cromogene (cu substrat fluorogen sau cromogen pentru enzime
fungice), permit izolare și identificarea simultană a levurilor izolate
din diferite prelevate
 Bulion Sabouraud (pentru îmbogățirea și menținerea fungilor)
 Principalele componente ale mediilor de cultură pentru
fungi sunt: substanțele nutritive, factorii inhibitori, agenții
revelatori (pentru mediile diferențiale cromogene), apa și
agenții de solidificare (pentru medii solide).
 Factorii inhibitori sunt substanțe de pot supresa dezvoltarea
unor categorii de microorganisme contaminante,
indezirabile (antibiotice, coloranți – ex.: cristal violet pentru
inhibarea bacteriilor, cicloheximidă pentru inhibarea
dezvoltării fungilor contaminanți).
 Temperatura de incubare este în concordanță cu zona anatomică de
proveniență a probei: 36-37 C pentru prelevatele interne și profunde
sau de 30 C pentru prelevatele superficiale (piele și anexe).
 Aproape toate mucegaiurile sunt aerobe, iar majoritatea levurilor sunt
facultativ anaerobe.
 Pe mediile de cultură fungii de interes medical se dezvoltă în 48-72
ore de incubare, uneori perioada de urmărire poate fi prelungită până
la 7 zile
 Formele morfologice ale creșterea variază de la colonii asemănătoare
superficial cu cele ale bacteriilor la structuri complexe, multicelulare,
pigmentate/colorate.
 Diagnosticul de laborator al infecțiilor fungice poate fi
efectuat prin metode microscopice, micologice, serologice.
 Probele sunt recoltate din locul afectat: prelevate
superficiale – cutanate, sinusale, conjunctivale, unghiale,
auriculare; spută, lavaj bronho-alveolar, urină, mase fecale,
urină, biopsii, etc.
 În caz de suspecție de infecție generalizată se vor colecta și
probe de sânge pentru hemocultură.
 Este obligatoriu pentru orice tip de prelevat, cu excepția sângelui
 Orientează diagnosticul spre o infecția fungică prin evidențierea unor
formațiuni sau elemente caracteristice
 Permite informarea timpurie a clinicianului
 Se efectuează pe prelevate în stare nativă, cu sau fără colorare
prealabilă.
 Pot fi identificate:
 levurile (cu sau fără muguri, intra- sau extracelulare, cu sau fără capsulă),
 fragmente hifale septate sau neseptate, uneori ramificate,
 structurile fructificatoare ale fungilor filamentoși,
 granulele (scleroții) – elemente sferice, dure, de cca 1 mm diametru, formate
la nivelul micetoamelor.
 Preparat între lamă și lamelă, cu soluție de 20% KOH (scuame,
fragmente unghiale, secreții linguale, vaginale). Digestia
keratinei și distrugerea celulelor somatice facilitează observarea
celulelor fungice.
 Decelarea fungilor este ameliorată prin adăugarea unui colorant –
negru clorazol, cerneală Parker sau a unei substanțe fluorescente
cu afinitate pentru glucanul din peretele fungilor (blankophor,
calcofluor – în proporție de 0,1%).
 Preparatul se examinează la microscupul luminiscent când
opacitatea preparatului s-a diminuat vizibil.
 Examenul microscopic
 Într-o picatură de sol. de
bază(KOH,NaOH) 5-10%
se introduce scuamele pielii ,raclajul
unghiilor,țesuturile necrotizate,se
încălzește atent la flacără
timp de 1 min și se acoperă cu
o lamelă.
Materialul de consistență lichidă se
cercetează într-un amestic de alool cu
glicerină (glicerina -4 parți,
alcool etilic-2părți, apă distilată-
4părți) sau în amestec din sol. Lugol
cu glicerină.
 Frotiu colorat Gram. Pune în evidență hifele, pseudohifele,
artrosporii și blastosporii de dimensiuni mari, dar este
inadecvată pentru detecția celulelor levurice de dimensiuni
mici, de ex.: Candida grabrata.
 Preparat colorat cu tuș de India. Pune în evidență levurile
capsulate din genul Cryptococcus în sedimentul LCR,
urinar, etc.
 Frotiu colorat May-Grunwald-Giemsa. Metodă de rutină
pentru depistarea levurilor intracelulare de tip Histoplasma,
dar poate fi utilizată și pentru microscopia directă a
fungilor.
 Frotiu necolorat sau colorat cu albastru de metilen 3%.
Pentru detectarea levurilor din hemoculturi.
 Frotiu pregătit pentru imunofluorescență prin tratare cu
anticorpi monoclonali cuplați cu fluorocromi (în special
pentru detecția Pneumocystis jiroveci în prelevatele
respiratorii)
 Preparat extemporaneu cu bandă adezivă, colorat cu
albastru de metilen în lactofenol: metodă expeditivă de
diagnostic tip ”one-step” al leziunilor cauzate de Pityriazis
versicolor.
 Frotiuri obținute prin etalare sau amprentă (aspiratul
bronșic, lavajul bronhoalveolar, biopsiile), care apoi se
colorează Musto sau cu calcofluor și se examinează pentru
decelarea elementelor particulare, care ar pleda pentru o
zigomicoză, aspergiloză, etc.
I. Izolarea culturii pure de fungi.
Se efectuează prin inocularea prelevatului pe placa
cu mediul solid (Sabouraud, Czapek), incubare la
temperatura optimă (28 – 30 C), 48 ore. La
necesitate se efectuează în prealabil îmbogățirea
fungilor în bulion Sabouraud
Pe Chromagar , un mediu
diferențial pentru speciile
Candida glabrata produce colonii
care pal roz până la violet, spre
deosebire de coloniile
C. albicans , care apar de la verde
la albastru-verde.
II. Acumularea culturii pure (la necesitate)
III. Identificarea culturii pure, bazată pe studierea
caracterelor:
- Morfologice (forma celulelor, morfologia hifelor,
sporilor, etc)
- De cultură (rapiditatea creșterii, caracteristica
coloniilor, pigmentarea mediului sub colonie)
- Biochimice
 Profilul biochimic cuprinde datele obținute prin
efectuarea unei multitudini de teste:
 Capacitatea de fermentare a glucidelor
 Capacitatea de asimilare a surselor de carbon
 Capacitatea de asimilare a surselor de azot
 Testul de asimilare a nitratului de sodiu
 Testul de hidroliză a ureei
 Producerea de fenol-oxidază
 Producerea altor enzime (beta-galactozaminidaza, L-
prolin-aminopeptidaza, etc.)
 Testul de depistare a necesităților nutritive speciale (se ulilizează setul de
medii Trichophyton agar 1-7 pentru identificarea unor specii de
dermatofiți care cer prezența în mediul de cultură a unor factori de
creștere ca vitamine (tiamină, acid nicotinic, inozitol) sau aminoacizi
(histidină).
 Testul de perforare a firului de păr in vitro (diferențierea speciilor de
dermatofiți pe baza producerii organelor perforatoare)
 Testul de cultivare pe boabe de orez (diferențierea Microsporum audouinii
de Microsporum canis)
 Testul de filamentare (identificarea preumtivă a tulpinilor de Candida
albicans și Candida dubliniensis)
 Testul de termotoleranță/termostimulare (diferențierea speciilor de
dermatofiți prin incubarea mediilor inoculate la 25⁰, 30⁰ și 37⁰ C.
 Testul de fluorescență la lumină UV (unii dermatofiți secretă pteridină,
care produce fluorescență verde-gălbuie sau verde-pal).
 Cultivarea și identificarea fungilor prin metode clasice rămâne a fi
”standardul de aur” în diagnosticul infecțiilor micotice.
 În unele cazuri diagnosticul serologic permite o orientare rapidă a
medicului în vederea instituirii unui tratament precoce.
 Diagnosticul serologic vizează atât detectarea antigenelor direct în
produsul biologic (ex.: detectarea Ag Aspergillus, Candida, Ag
polizaharidice capsulare ale Cryptococcus neoformans etc.), cât și
aprecierea calitativă sau cantitativă a anticorpilor prezenți ca răspuns
al unei infecții fungice (histoplasmoza, coccidiomicoza,
aspergiloza).
 Reacții serologice utilizate – reacția de latexaglutinare, ELISA
 Controlul infecțiilor fungice invazive este dificil
(imposibilitatea obținerii probelor adecvate; culturile
devin pozitive în stadii tardive ale bolii)
 Procedurile bazate pe detectarea ADN-ului fungic în
materialul biologic (PCR, Real-Time PCR) permit
diagnosticul precoce și tratamentul infecțiilor fungice.
 Analiza PCR foarte rar oferă un rezultat fals-negativ și
practic nu dă rezultate fals-pozitive.