Curs 5 Metode imunochimice de analiza ANTICORPII:o imunoglobulina capabila de a se combina specific cu un antigen ANTIGENUL :orice substanta/corp care produce

un raspuns al sistemului imunitar Definitia antigenului Convenional, antigenele se definesc ca substane straine, care, consecutiv introducerii in organismul uman sau animal pe o cale parenterala (alta decat cea digestiva), declaneaza sinteza anticorpilor cu care se combina specific. Calea digestiva de administrare a antigenelor nu exclude totdeauna posibilitatea declanarii raspunsului imun. Pentru agenii infecioi care se multiplica in tractul digestiv, administrarea orala asigura o buna imunizare. - Unele substane nonself sunt in mod eronat considerate ca neantigenice, deoarece, dei in vivo stimuleaza reactivitatea imunitara i induc sinteza unei cantitai mici de anticorpi, in vitro nu produc reacii vizibile antigen-anticorp. - Faa de unele antigene, organismele nu declaneaza raspunsul imun, ci manifesta o stare de tolerana. - Unele molecule in stare nativa nu induc un raspuns imun, ci numai dupa cuplarea covalenta cu o molecula purtator. Molecula nativa ii pastreaza proprietatea de a se combina specific cu anticorpii sintetizai. Astfel de molecule se numesc haptene. Poza ppt Haptena este un antigen incomplet, are specificitate dar nu are imunogenitate. Afinitatea anticorpilor

A +A b A b g A g

[ Ab Ag ] Ka = [ Ab][ Ag ]
Proprietatile legaturii Anticorp-Antigen Ne -covalente Reversibile Forte intermoleculare Interactiuni coulombice (legaturi de hidrogen) Interactiuni hidrofobe Legaturi van der Waals Variatia clonala Proprietati principale: specificitatea si reversibilitatea. Interactiunea primara se datoreaza legarii efective Ag-Ac si depinde in mod direct de cantitatea si afinitatea Ac. Reactiile Ag-Ac in care reactantii se afla in interactiune primara pot fi puse in evidenta prin nefelometrie. Interactiuni secundare - apar la circa 30 min dupa cea primara. Datorita faptului ca Ag poate avea mai multi epitopi iar Ag are minim 2 paratopi, complexele primare mici solubile interactioneaza intre ele formand complexe secundare, produsul final fiind o retea 3D insolubila. Pot fi evidentiate prin: imunofluorescenta, chemiluminiscenta, enzimatic si izotopic etc. Clasificarea metodelor imunochimice Metodele Precipitare Imunodifuzie Imunoelectroforeza Imprastierea luminii Nefelometrie Turbidimetrie Denumirea metodei Necompetitiva Locul unu Locul doi Competitiva Heterogene Omogene

Reactia de precipitare n cazul reaciei de precipitare, Ag este o macromolecul solubil. Reacia de precipitare poate avea loc n mediul solid (difuzia n gel) sau n mediul lichid. Formarea precipiatului depinde de: cantitatea i concentraia Ag, calitatea i concentraia Ac, temperatura, molaritatea, pH-ul, volumul de reacie, coninutul n lipide al antiserului etc. Compoziia precipitatului imun, proporia de combinare a Ag cu Ac sunt variabile n funcie de zona n care a avut loc precipitarea: exces de Ag, echivalen sau exces de Ac.

Imunodifuzie radiala simpla (Mancini) Presupune difuzia unui reactant (n faza lichid) ntr-un gel n care este nglobat cellalt reactant. n aceast tehnic Ac trebuie s fie n stare pur. Dimensiunea haloului de precipitare este direct proporional cu concentraia Ag ce difuzeaz i invers proporional cu concentraia i nlimea de gel n care sunt nglobai. Imunodifuzia dubla (Ouchterlony) Imunodifuzie dubla Ouchterlony (de asemenea, cunoscuta sub numele de imunodifuzie in gel de agar sau dubla imunodifuzie pasiva) este o metoda simpla, considerat a fi standardul pentru detectarea de antigene nucleare extractibile (ENAs). Antigenul si anticorpul difuzeaza radial din godeuri practicate la distante convenabile in stratul de gel. In zona dintre godeuri unde reactantii au realizat cantitati echivalente, apare o linie de precipitare. Metoda este utilizata pentru caracterizarea antigenului dintr-un amestec. Electroimunodifuzia EID a fost imaginat de Laurell (1965). Se realizeaz prin electroforeza Ag n strat de gel ce conine Ac monospecifici. Preciptatul Ag-Ac apare sub form de rachete (conuri) a cror nlime este direct proporional cu concentraia Ag i invers proporional cu cea a Ac. Reacia are sensibilitate mai mare dect IDRS. n cazul Ig se utilizeaz ca suport agarul sau agaroza. IgG migreaz anodic n gelul de agar. IgA i IgM migreaz ctre anod n gelul de agaroz. Reacia prezint unele dificulti la efectuare. Imunoelectroforeza Imunoelectroforeza reprezint asocierea electroforezei cu dubla difuzie. n prima etap are loc electroforeza proteinelor, urmat de dubla difuzie cu un antiser corespunztor. Reacia Ag-Ac se vizualizeaz prin linii de precipitare corespunztoare sistemelor Ag-Ac din reacie. Imunoelectroforeza (IEF) ofer numai informaii calitative n diagnosticul gamei patiilor monoclonale. Metoda ilustraz n cazul componente monoclonale a Ig, clasa i tipul de Ig patologice. Metoda se folosete pentru studiul puritii unui Ag sau Ac. Combina electroforeza proteinei serice cu detectia imunometrica Electroforeza impiedica separarea Imunoprecipitarea ajuta detectia

Imunofixarea electroforetica Cuprinde un grup de tehnici imunochimice care au comun EF probei n gel, combinat cu imobilizarea (fixarea) unui reactant de ctre cellalt (imobilizarea Ag de ctre ac cunoscut, fie invers). Precipitatele se evideniaz dup colorare. Metoda se utilizeaz pentru stabilirea clasei i tipului de Ig monoclonal pentru diagnosticul imunochimic al bolii lanurilor grele i pentru diagnosticul deiferenial al hiper-gama-globulinemiilor monoclonale. Metodele cu particule care implica complexe solubile Proprietatea fizica cheie este dimensiunea Masurarea se bazeaza pe modul in care anticorpi lungi/complexele de antigen interactioneaza cu lumina (radiatia electromagnetica) Principiul fundamental pe care masurarea se face este dispersia luminii Doua metode analitice se bazeaza pe disperia luminii: Nefelometria si Turbidimetria Turbidimetria si nefelometria

Aceste metode se bazeaza pe fenomenele de absorbtie/difuzie ce au loc la trecerea luminii printr-o solutie opalescenta (tulbure). Permit determinarea concentratiilor solutiilor

N F A T

A = lumina absorbita de suspensia respectiva F = fascicol de lumina N = fascicolul de lumina difuzat, se masoara nefelometric T = fascicolul care strabate suspensia, se masoara turbidimetric Turbidimetria se utilizeaza in cazul solutiilor dense lumina este puternic difuzata Nefelometria cand lumina difuzata este slaba Turbidimetria (S) unei suspensii pentru concentratii mici I S = log 0 I t I0 = intensitatea luminii incidente It = intensitatea luminii transmise S = Cl

l = grosimea stratului = coeficient molar de turbidimetrie C = concentratia Dependenta lineara a turbiditatii de concentratie sta la baza determinarilor cantitative turbidimetrice Marcarea radioizotopilor Advantaje Flexibilitate Sensibilitate Dimensiune Dezavantaje Toxicitate Perioada de viata Eliminarea costurilor