Metode imunochimice de analiza

ANTICORPII
IgG IgM IgA IgD IgE
ANTICORPII
o o imunoglobulina imunoglobulina capabila capabila de a se de a se combina combina specific cu un specific cu un
antigen antigen
ANTIGENUL
orice substanta/corp care produce un raspuns al
sistemului imunitar
Definitia antigenului
Convenional, antigenele se definesc ca substane straine, care, consecutiv
introducerii in organismul uman sau animal pe o cale parenterala (alta decat cea
digestiva), declaneaza sinteza anticorpilor cu care se combina specific.
Calea digestiva de administrare a antigenelor nu exclude totdeauna posibilitatea
declanarii raspunsului imun. Pentru agenii infecioi care se multiplica in tractul
digestiv, administrarea orala asigura o buna imunizare.
- Unele substane nonself sunt in mod eronat considerate ca neantigenice,
deoarece, dei in vivo stimuleaza reactivitatea imunitara i induc sinteza unei
cantitai mici de anticorpi, in vitro nu produc reacii vizibile antigen-anticorp.
- Faa de unele antigene, organismele nu declaneaza raspunsul imun, ci
manifesta o stare de tolerana.
- Unele molecule in stare nativa nu induc un raspuns imun, ci numai dupa
cuplarea covalenta cu o molecula purtator. Molecula nativa ii pastreaza
proprietatea de a se combina specific cu anticorpii sintetizai. Astfel de molecule
se numesc haptene.
Aminobenzen sulfonat, o Haptena
Haptena este un antigen incomplet, are specificitate
dar nu are imunogenitate.
Haptena este un antigen incomplet, are specificitate
dar nu are imunogenitate.
NH
2
NH
2
NH
2
SO
3
SO
3
SO
3
Orto
Meta Para
Afinitatea anticorpilor
Ag Ab Ag Ab - +
] ][ [
] [
Ag Ab
Ag Ab
K
a
-
=
Proprietatile legaturii Anticorp-Antigen
Ne -covalente
Reversibile
Forte intermoleculare
Interactiuni coulombice (legaturi de hidrogen)
Interactiuni hidrofobe
Legaturi van der Waals
Variatia clonala
Proprietati principale: specificitatea si reversibilitatea.
Interactiunea primara se datoreaza legarii efective Ag-Ac si depinde in mod direct de
cantitatea si afinitatea Ac. Reactiile Ag-Ac in care reactantii se afla in interactiune
primara pot fi puse in evidenta prin nefelometrie.
Interactiuni secundare - apar la circa 30 min dupa cea primara. Datorita faptului ca Ag
poate avea mai multi epitopi iar Ag are minim 2 paratopi, complexele primare mici
solubile interactioneaza intre ele formand complexe secundare, produsul final fiind
o retea 3D insolubila. Pot fi evidentiate prin: imunofluorescenta, chemiluminiscenta,
enzimatic si izotopic etc.
Ne -covalente
Reversibile
Forte intermoleculare
Interactiuni coulombice (legaturi de hidrogen)
Interactiuni hidrofobe
Legaturi van der Waals
Variatia clonala
Proprietati principale: specificitatea si reversibilitatea.
Interactiunea primara se datoreaza legarii efective Ag-Ac si depinde in mod direct de
cantitatea si afinitatea Ac. Reactiile Ag-Ac in care reactantii se afla in interactiune
primara pot fi puse in evidenta prin nefelometrie.
Interactiuni secundare - apar la circa 30 min dupa cea primara. Datorita faptului ca Ag
poate avea mai multi epitopi iar Ag are minim 2 paratopi, complexele primare mici
solubile interactioneaza intre ele formand complexe secundare, produsul final fiind
o retea 3D insolubila. Pot fi evidentiate prin: imunofluorescenta, chemiluminiscenta,
enzimatic si izotopic etc.
Clasificarea metodelor imunochimice
Metodele
Precipitare
Imunodifuzie
Imunoelectroforeza
Imprastierea luminii
Nefelometrie
Turbidimetrie
Metodele
Precipitare
Imunodifuzie
Imunoelectroforeza
Imprastierea luminii
Nefelometrie
Turbidimetrie
Denumirea metodei
Necompetitiva
Locul unu
Locul doi
Competitiva
Heterogene
Omogene
Denumirea metodei
Necompetitiva
Locul unu
Locul doi
Competitiva
Heterogene
Omogene
Reactia de precipitare
n cazul reaciei de precipitare, Ag este o macromolecul
solubil. Reacia de precipitare poate avea loc n mediul
solid (difuzia n gel) sau n mediul lichid. Formarea
precipiatului depinde de: cantitatea i concentraia Ag,
calitatea i concentraia Ac, temperatura, molaritatea, pH-
ul, volumul de reacie, coninutul n lipide al antiserului etc.
Compoziia precipitatului imun, proporia de combinare a
Ag cu Ac sunt variabile n funcie de zona n care a avut loc
precipitarea: exces de Ag, echivalen sau exces de Ac.
n cazul reaciei de precipitare, Ag este o macromolecul
solubil. Reacia de precipitare poate avea loc n mediul
solid (difuzia n gel) sau n mediul lichid. Formarea
precipiatului depinde de: cantitatea i concentraia Ag,
calitatea i concentraia Ac, temperatura, molaritatea, pH-
ul, volumul de reacie, coninutul n lipide al antiserului etc.
Compoziia precipitatului imun, proporia de combinare a
Ag cu Ac sunt variabile n funcie de zona n care a avut loc
precipitarea: exces de Ag, echivalen sau exces de Ac.
Zona de echivalenta
Reactia de precipitare
P
r
e
c
i
p
i
t
a
t
Anticorp/Antigen
etc.
Imunodifuzie radiala simpla (Mancini)
Presupune difuzia unui reactant (n faza lichid) ntr-un gel n
care este nglobat cellalt reactant. n aceast tehnic Ac
trebuie s fie n stare pur. Dimensiunea haloului de
precipitare este direct proporional cu concentraia Ag ce
difuzeaz i invers proporional cu concentraia i nlimea
de gel n care sunt nglobai.
Presupune difuzia unui reactant (n faza lichid) ntr-un gel n
care este nglobat cellalt reactant. n aceast tehnic Ac
trebuie s fie n stare pur. Dimensiunea haloului de
precipitare este direct proporional cu concentraia Ag ce
difuzeaz i invers proporional cu concentraia i nlimea
de gel n care sunt nglobai.
Ag
] [ Ag r
r
Imunodifuzia dubla (Ouchterlony)
Imunodifuzie dubla Ouchterlony (de asemenea, cunoscuta sub numele de
imunodifuzie in gel de agar sau dubla imunodifuzie pasiva) este o metoda
simpla, considerat a fi standardul pentru detectarea de antigene nucleare
extractibile (ENAs).
Antigenul si anticorpul difuzeaza radial din godeuri practicate la distante
convenabile in stratul de gel. In zona dintre godeuri unde reactantii au
realizat cantitati echivalente, apare o linie de precipitare. Metoda este
utilizata pentru caracterizarea antigenului dintr-un amestec.
Imunodifuzie dubla Ouchterlony (de asemenea, cunoscuta sub numele de
imunodifuzie in gel de agar sau dubla imunodifuzie pasiva) este o metoda
simpla, considerat a fi standardul pentru detectarea de antigene nucleare
extractibile (ENAs).
Antigenul si anticorpul difuzeaza radial din godeuri practicate la distante
convenabile in stratul de gel. In zona dintre godeuri unde reactantii au
realizat cantitati echivalente, apare o linie de precipitare. Metoda este
utilizata pentru caracterizarea antigenului dintr-un amestec.
S1
S2
S3 S4
S5
P
Imunodifuzie dubla (Ouchterlony) Imunodifuzia radiala cantitativa
Electroimunodifuzia (EID)
EID a fost imaginat de Laurell (1965). Se realizeaz prin
electroforeza Ag n strat de gel ce conine Ac monospecifici.
Preciptatul Ag-Ac apare sub form de rachete (conuri) a
cror nlime este direct proporional cu concentraia Ag i
invers proporional cu cea a Ac.
Reacia are sensibilitate mai mare dect IDRS. n cazul Ig
se utilizeaz ca suport agarul sau agaroza. IgG migreaz
anodic n gelul de agar. IgA i IgM migreaz ctre anod n gelul
de agaroz.
Reacia prezint unele dificulti la efectuare.
Electroimunodifuzia
+
-
Immunoelectroforeza (IEF)
Imunoelectroforeza reprezint asocierea electroforezei cu dubla
difuzie. n prima etap are loc electroforeza proteinelor, urmat
de dubla difuzie cu un antiser corespunztor. Reacia Ag-Ac se
vizualizeaz prin linii de precipitare corespunztoare sistemelor
Ag-Ac din reacie.
Imunoelectroforeza (IEF) ofer numai informaii calitative n
diagnosticul gamei patiilor monoclonale. Metoda ilustraz n
cazul componente monoclonale a Ig, clasa i tipul de Ig
patologice.
Metoda se folosete pentru studiul puritii unui Ag sau Ac.
Combina electroforeza proteinei serice cu detectia
imunometrica
Electroforeza impiedica separarea
Imunoprecipitarea ajuta detectia
Imunoelectroforeza reprezint asocierea electroforezei cu dubla
difuzie. n prima etap are loc electroforeza proteinelor, urmat
de dubla difuzie cu un antiser corespunztor. Reacia Ag-Ac se
vizualizeaz prin linii de precipitare corespunztoare sistemelor
Ag-Ac din reacie.
Imunoelectroforeza (IEF) ofer numai informaii calitative n
diagnosticul gamei patiilor monoclonale. Metoda ilustraz n
cazul componente monoclonale a Ig, clasa i tipul de Ig
patologice.
Metoda se folosete pentru studiul puritii unui Ag sau Ac.
Combina electroforeza proteinei serice cu detectia
imunometrica
Electroforeza impiedica separarea
Imunoprecipitarea ajuta detectia
Imunoelectroforeza
Specimen
ser o-uman
+
-
Imunoelectroforeza
P
C P C P C
k o
+
-
Imunofixarea electroforetica
Cuprinde un grup de tehnici imunochimice
care au comun EF probei n gel, combinat
cu imobilizarea (fixarea) unui reactant de
ctre cellalt (imobilizarea Ag de ctre ac
cunoscut, fie invers). Precipitatele se
evideniaz dup colorare.
Metoda se utilizeaz pentru
stabilirea clasei i tipului de Ig
monoclonal pentru diagnosticul
imunochimic al bolii lanurilor grele
i pentru diagnosticul deiferenial al
hiper-gama-globulinemiilor
monoclonale.
SPE
IgG IgA
IgM
k
Metoda Alper i Johnson
(1969)
Metodele cu particule care implica
complexe solubile
Proprietatea fizica cheie este dimensiunea
Masurarea se bazeaza pe modul in care anticorpi
lungi/complexele de antigen interactioneaza cu
lumina (radiatia electromagnetica)
Principiul fundamental pe care masurarea se face
este dispersia luminii
Doua metode analitice se bazeaza pe disperia
luminii: Nefelometria si Turbidimetria
Proprietatea fizica cheie este dimensiunea
Masurarea se bazeaza pe modul in care anticorpi
lungi/complexele de antigen interactioneaza cu
lumina (radiatia electromagnetica)
Principiul fundamental pe care masurarea se face
este dispersia luminii
Doua metode analitice se bazeaza pe disperia
luminii: Nefelometria si Turbidimetria
Turbidimetria si nefelometria
Aceste metode se bazeaza pe fenomenele de
absorbtie/difuzie ce au loc la trecerea luminii printr-o solutie
opalescenta (tulbure).
Permit determinarea concentratiilor solutiilor
Aceste metode se bazeaza pe fenomenele de
absorbtie/difuzie ce au loc la trecerea luminii printr-o solutie
opalescenta (tulbure).
Permit determinarea concentratiilor solutiilor
F
N
T
A
A = lumina absorbita de suspensia respectiva
F = fascicol de lumina
N = fascicolul de lumina difuzat, se masoara nefelometric
T = fascicolul care strabate suspensia, se masoara turbidimetric
Turbidimetria si nefelometria
Turbidimetria se utilizeaza in cazul solutiilor dense lumina
este puternic difuzata
Nefelometria cand lumina difuzata este slaba
Turbidimetria (S) unei suspensii pentru concentratii mici
Turbidimetria se utilizeaza in cazul solutiilor dense lumina
este puternic difuzata
Nefelometria cand lumina difuzata este slaba
Turbidimetria (S) unei suspensii pentru concentratii mici
t
I
I
S
0
log =
I
0
= intensitatea luminii incidente
I
t
= intensitatea luminii transmise
l = grosimea stratului
= coeficient molar de turbidimetrie
C = concentratia
C l S =
Dependenta lineara a turbiditatii de concentratie sta
la baza determinarilor cantitative turbidimetrice
I
n
t
e
n
s
i
t
a
t
e
a
d
e
i
m
p
r
a
s
t
i
e
r
e
Timp
Rata nefelometriei
Rata
C
2
C
1
Marcarea radioizotopilor
Advantaje
Flexibilitate
Sensibilitate
Dimensiune
Advantaje
Flexibilitate
Sensibilitate
Dimensiune
Dezavantaje
Toxicitate
Perioada de viata
Eliminarea
costurilor
Dezavantaje
Toxicitate
Perioada de viata
Eliminarea
costurilor
resturile de tirozina din
proteine,
isotopii radioactivi
125 I sau 131 I
RIA
Radio-imuno-analiza
Rosalyn Yalow Rosalyn Yalow si si
Solomon Solomon Berson Berson in 1957 in 1957
au au descris descris primii primii RIA RIA
Contoar de
radiatii gamma
picograme (10
12
g) de antigen
Marcarea enzimelor
Advantaje
Diversitate
Dezvoltare
Adaptabilitate
Advantaje
Diversitate
Dezvoltare
Adaptabilitate
Dezavantaje
Instabilitate
Dimensiune
Heterogenitate
Dezavantaje
Instabilitate
Dimensiune
Heterogenitate
Marcare fluorescenta
Advantaje
Dimenisune
Specificitate
Sensibilitate
Advantaje
Dimenisune
Specificitate
Sensibilitate
Dezavantaje
Complet
Limita de selectie
Fundal/Zgomot
Dezavantaje
Complet
Limita de selectie
Fundal/Zgomot
Marcare chemiluminescenta
+ 2 H
2
O
2
+ OH
-
COO
-
COO
-
O
-
O
-
+ h (
ma x
= 4 3 0 n m )
+ N
2
+ 3 H
2
O
N H
2
L um i n o l
P e r o x i d a s e
O
O
N
N
H
N H
2
H
O
O
*
N H
2
CH
3
N
+
CO
2
H
O O
B r
-
A c r i d i n i um e s t e r
O
-
CO
2
H
+ H
2
O
2
+ OH
-
+
+ CO
2
+ h
O
CH
3
N
Analiza imunochimica in faza heterogena
Care este trasatura distinctiva a imunodozarii in
faza heterogena ?
Necesita separarea de liganzii legati sau liberi
Au metodele heterogene vreun avantaj fata de
metodele omogene?
Da
Care sunt acestea?
Sensibilitatea
Specificitatea
Care este trasatura distinctiva a imunodozarii in
faza heterogena ?
Necesita separarea de liganzii legati sau liberi
Au metodele heterogene vreun avantaj fata de
metodele omogene?
Da
Care sunt acestea?
Sensibilitatea
Specificitatea
Analiza imunochimica in faza heterogena
Competitiv
Exces de antigen
De obicei implica
antigene concurente
marcate
RIA este prototipul
Competitiv
Exces de antigen
De obicei implica
antigene concurente
marcate
RIA este prototipul
Ne-competitiv
Exces de anticorp
Implica de obicei
anticorpi secundar
marcati
ELISA este prototipul
Ne-competitiv
Exces de anticorp
Implica de obicei
anticorpi secundar
marcati
ELISA este prototipul
Metode imunoenzimatice- ELISA
(enzyme linked immunosorbent assay)
Permit detectarea antigenelor libere i a anticorpilor. Este
posibil determinare cantitativ.
La reacii particip:
un reactant imunologic cunoscut ataat de un suport solid
(plci cu godeuri, lame, baghete). Se pot folosi antigene,
anticorpi, anticorpi monoclonali, proteina A) .
un reactant imunologic marcat enzimatic - peroxidaza
substrat specific (cromogenic). Se produce o modificare de
culoare detectabil spectrofotometric (determinare cantitativ)
substane pentru stoparea reaciei (baze sau acizi puternici)
Reaciile au loc n aparate automate, semiautomate.
Permit detectarea antigenelor libere i a anticorpilor. Este
posibil determinare cantitativ.
La reacii particip:
un reactant imunologic cunoscut ataat de un suport solid
(plci cu godeuri, lame, baghete). Se pot folosi antigene,
anticorpi, anticorpi monoclonali, proteina A) .
un reactant imunologic marcat enzimatic - peroxidaza
substrat specific (cromogenic). Se produce o modificare de
culoare detectabil spectrofotometric (determinare cantitativ)
substane pentru stoparea reaciei (baze sau acizi puternici)
Reaciile au loc n aparate automate, semiautomate.
ELISA
Microcelule
E E E E E
Specimen
Al 2-lea anticorp
E
Substrat
S P
ELISA (varianta 1)
microcelule
Analit
Antigen marcat
E
E E E
S P
ELISA (varianta 2)
microcelule
Analit
anticorp marcat
E
E E E E
E
E
E
Analize heterogene automatizate
Metoda ELISA poate fi automatizata
Separarea este un element
cheie n proiectarea testelor imunochimice
heterogene automatizate
Abordari pentru separarea automatizata
Anticorpi imobilizati
Captare/filtrare
Separare magnetica
Metoda ELISA poate fi automatizata
Separarea este un element
cheie n proiectarea testelor imunochimice
heterogene automatizate
Abordari pentru separarea automatizata
Anticorpi imobilizati
Captare/filtrare
Separare magnetica
ELISA aplicatii
Screening-ul donatorilor de sange pentru evidentierea contaminarii:
- HIV-1 si HIV-2 (prezenta anticorpilor anti-HIV)
hepatita C (prezenta anticorpilor)
hepatita B (testarea anticorpilor si antigenilor virali)
ELISA aplicatii
Screening-ul donatorilor de sange pentru evidentierea contaminarii:
- HIV-1 si HIV-2 (prezenta anticorpilor anti-HIV)
hepatita C (prezenta anticorpilor)
hepatita B (testarea anticorpilor si antigenilor virali)
Masurarea nivelului hormonilor
HCG (test de graviditate)
LH (determinarea timpului de ovulatie)
TSH, T3 si T4 ( functiunea tiroidei)
Hormoni (steroizi anabolizanti, HGH) sportivi
Detectarea infectiilor: sifilis, chlamydia,Toxoplasma gondii
Detectarea alergenilor si toxinelor din alimente
Masurarea auto-anticorpilor in bolile autoimmune (lupus erythematosus)
Detectarea drogurilor ilicite (cocaina, opiacee, marijuana)
Metode de imobilizare a anticorpilor
Tuburi filmate (acoperite)
Bile filmate (acoperite)
Metodele anticorpilor in faza solida
Tuburi filmate (acoperite)
Bile filmate (acoperite)
Metodele anticorpilor in faza solida
Metoda cu tuburi filmate
Specimen Antigen marcat
Spalat
Metoda cu bile filmate
Microparticle enzyme immunoassay MEIA
MEIA este o tehnica in care suportul
fazei solide consta din microparticule
foarte mici de lichid in suspensie.
Anticorpii specifici reactiv sunt
covalent legati de microparticule
Antigenul, dac este prezent este ca
un sandwich, intre anticorpii legati
si antigenii specifici, anticorpii
marcati cu enzima.
Complexele antigen-aticorp sunt
detectate prin analiza de fluorescenta
prin interactiunea enzima-substrat.
MEIA este o tehnica in care suportul
fazei solide consta din microparticule
foarte mici de lichid in suspensie.
Anticorpii specifici reactiv sunt
covalent legati de microparticule
Antigenul, dac este prezent este ca
un sandwich, intre anticorpii legati
si antigenii specifici, anticorpii
marcati cu enzima.
Complexele antigen-aticorp sunt
detectate prin analiza de fluorescenta
prin interactiunea enzima-substrat.
E
E E
S P
Matrice fibra de sticla
Anticorp marcat
Teste pentru molecule mici
Analiza de chemiluminescen pentru testosteron
n urma acestei analize se obine o curb:
Metode de separare magnetica
Fe
Fe
Fe
Fe
Fe
Fe
Fe
Fe
Fe
Chemiluminescenta pentru molecule mari
testel e de chemil uminescent pentru imunogl obul ina G- au
fost unele dintre primele teste care a implicat cuplarea
direct a luminolului cu un antigen proteic. Cea mai mic
concentratie standard de imunoglobulin G folosit a fost
5ug/tub.
prepararea anticorpil or marcati- aceast procedur a
reprezentat prima folosire pe scar larg a anticorpilor
marcati ntr-un test cu 2 situri.
Randamentul cuantic al luminolului a fost redus n aceast
reactie la mai putin de 1% din valoarea sa original, datorit
formrii de polimeri si pierderea randamentului prin
modificri structurale.
Metode de separare magnetica
Fe Fe Fe Fe Fe
Aspirat/spalat
Electrochemiluminiscenta imunologica
( sistemul Elecsys )
Fluxul celulei
Fe
Oxidat
Redus Redus
Imunologia imprastierii luminii in faza
solida
Analiza imunochimica in faza omogena
Care este trasatura distinctiva a imunodozarii omogene
Nu necesita separarea liganziilor legati sau liberi
Au metodele omogene vreun avantaj fata de metodele
heterogene?
Da
Care sunt acestea?
Viteza
Adaptabilitate
Care este trasatura distinctiva a imunodozarii omogene
Nu necesita separarea liganziilor legati sau liberi
Au metodele omogene vreun avantaj fata de metodele
heterogene?
Da
Care sunt acestea?
Viteza
Adaptabilitate
Analize imunochimice omogene
Toate imunotestele omogene sunt pe primul loc
Toate imunotestele omogene sunt competitive
Toate imunotestele omogene sunt concepute pentru
antigenii mici
Terapeutic/medicamente
Steroizi/hormonii peptidici
Toate imunotestele omogene sunt pe primul loc
Toate imunotestele omogene sunt competitive
Toate imunotestele omogene sunt concepute pentru
antigenii mici
Terapeutic/medicamente
Steroizi/hormonii peptidici
Proiectarea tipica a analizelor imunochimice in
faza omogena
Fara semnal
Cu
semnal
Tehnica imunologica de amplificare cu
enzime (EMIT)
enzyme multiplied immunoassay technique
Dezvoltata de Corporatia Syva (Palo Alto, CA) in
1970sdetinuta in prezent de Behring Diagnostics.
A oferit o alternativa la RIA sau HPLC pentru
masurarea medicamentelor terapeutice.
A declansat utilizarea pe scara larga a TDM (therapeutic
drug monitoring)
Adaptabila pentru aproape orice analizor de chimie.
Are atat aplicatii cantitative (TDM) cat si calitative
(DAU) applications; Testarea antidrog in criminalistica
este cea mai comuna utilizare a metodei EMIT
Dezvoltata de Corporatia Syva (Palo Alto, CA) in
1970sdetinuta in prezent de Behring Diagnostics.
A oferit o alternativa la RIA sau HPLC pentru
masurarea medicamentelor terapeutice.
A declansat utilizarea pe scara larga a TDM (therapeutic
drug monitoring)
Adaptabila pentru aproape orice analizor de chimie.
Are atat aplicatii cantitative (TDM) cat si calitative
(DAU) applications; Testarea antidrog in criminalistica
este cea mai comuna utilizare a metodei EMIT
Metoda EMIT
Enzima
S
S P
Fara semnal
Cu semnal
Enzima
S
Curba semnalul/ concentratie EMIT
S
e
m
n
a
l
u
l
(
a
c
t
i
v
i
t
a
t
e
a
e
n
z
i
m
e
i
)
Concentratia antigenului
Intervalul de
concentratie functional
Polarizarea de fluorescenta in analiza
imunologica (FPIA)
Dezvoltata de Abbott Diagnostics, aproximativ in acelasi
timp cu EMIT care a fost dezvoltata de Syva
O tehnica, care profit de cresterea polarizarii (de
propagarea non-aleatoare de emisie) din emisiile
de lumin fluorescenta atunci cnd un antigen marcat
fluorescent este legat de un anticorp reactiv.
Ca si EMIT, primele aplicatii au fost pentru medicamente
terapeutice
In prezent este metoda cea mai utilizata pe scara larga
pentru tehnologia TDM
Necesita intrumentul specific
Dezvoltata de Abbott Diagnostics, aproximativ in acelasi
timp cu EMIT care a fost dezvoltata de Syva
O tehnica, care profit de cresterea polarizarii (de
propagarea non-aleatoare de emisie) din emisiile
de lumin fluorescenta atunci cnd un antigen marcat
fluorescent este legat de un anticorp reactiv.
Ca si EMIT, primele aplicatii au fost pentru medicamente
terapeutice
In prezent este metoda cea mai utilizata pe scara larga
pentru tehnologia TDM
Necesita intrumentul specific
Radiatia polarizata
z
y
x
Filtrul polarizatorului
Polarizarea de fluorescenta
O HO OH
C
O
O
Fluoresceina

in
Orientarea radiatiilor polarizate este mentinuta

out
(10
-6
-10
-9
sec)
Polarizarea de fluorescenta
O
H
O
O
H
C
O
O
Frecventa de rotatie ~ 10
10
sec
-1

in
Orientarea radiatiei polarizate NU este mentinuta

out
(10
-6
-10
-9
sec)
Dar. . .
Polarizarea de fluorescenta in analiza
imunochimica
O HO OH
C
O
O
Polarizarea mentinuta
Rotatie lenta
O HO OH
C
O
O
Rotatie rapida
Polarizarea pierduta
Curba semnalul/concentratie FPIA
S
e
m
n
a
l
(
I
|
|
/
I

)
Concentratia antigenului
Intervalul de
concentratie functional
Cloned enzyme donor immunoassay
(CEDIA)
Dezvoltata de Microgenics in anii 1980
(achizitionate BMC, atunci cesionate de Roche)
Ambele aplicatii TDM si DAU sunt disponibile
Adaptabil la orice analizor chimic
Sunt in prezent cereri de patrundere pe piata de
noi aplicatii EMIT and FPIA
Dezvoltata de Microgenics in anii 1980
(achizitionate BMC, atunci cesionate de Roche)
Ambele aplicatii TDM si DAU sunt disponibile
Adaptabil la orice analizor chimic
Sunt in prezent cereri de patrundere pe piata de
noi aplicatii EMIT and FPIA
CEDIA semnalul/concentratie
S
e
m
n
a
l
u
l
(
a
c
t
i
v
i
t
a
t
e
a
e
n
z
i
m
e
i
)
Concentratia antigenului
Intervalul de
concentratie functional
Alte abordari ale analizelor imunologice omogene
Metode fluorescente
Metode electrochimice
Metode enzimatice
Imunologia directionata pe enzime
Metode fluorescente
Metode electrochimice
Metode enzimatice
Imunologia directionata pe enzime
Substrat marcat prin fluorescenta
Enzima
S
S Fluorescenta
Fara semnal
Cu
semnal
Enzima
S
Grupuri imunologice proteice
Enzima
Enzima
P
P
S P
Cu semnal
Fara semnal
Directionarea enzimatica in analiza imunochimica
Ag
E
1
E
2
Substrat
Product 1
Product 2
Anticorpi artificiali
Imunoglobulinele au o durata de viata
limitata.
Necesita intotdeauna refrigerare
Denaturarea afecteaza afinitatea, aviditate
Putem crea anticorpi artificiali mai stabili?
Recunoasterea moleculara a moleculelor
Amprenta moleculara
Imunoglobulinele au o durata de viata
limitata.
Necesita intotdeauna refrigerare
Denaturarea afecteaza afinitatea, aviditate
Putem crea anticorpi artificiali mai stabili?
Recunoasterea moleculara a moleculelor
Amprenta moleculara