Reacii antigen - anticorp, principii de baz. Imunogenicitate. Complementaritate.

Bazele moleculare
ale reaciei Ag-Ac. Tipuri de reacii Ag-Ac
Imunogenitatea este proprietatea unui antigen complet, format din gruparea carrier si epitopi, de a declansa
un raspuns imun, umoral sau celular, ori de cite ori patrunde in organism pe o cale adecvata. Reactia dintre
Ag si Ac necesita interactiunea determinantului antigenic (epitop) cu situsul de combinare al Ac (paratop).
Fortele care conditioneaza interactiunea Ag-Ac sunt:1. Complementaritatea structurala dintre epitop si
paratop reactia este specifica; presupune adaptarea conformationala a celor doua grupari
2.Complementaritatea electrochimica a gruparilor care intra in reactie, consecinta a complementaritatii
structurale Reactia antigen anticorp (Ag - Ac) apare datorita proprietatii esentiale a imunoglobulinelor (Ig)
de a recunoaste determinantul antigenic care a indus formarea lor, de a interactiona cu acesta si de a produce
manifestari vizibile: precipitare aglutinare neutralizare
Interactiunea Ag-Ac produce 3 tipuri de reactii:1. Reactiile primare reprezinta interactiunile initiale,
consecutive legarii celor doi reactanti, pe baza complementaritatii conformationale. Dupa ce structurile
reactante (epitopul antigenic si situsul de combinare al Ac) s-au adaptat conformational, factorul care
conditioneaza valoarea fortelor moleculare stabilizatoare ale complexului Ag-Ac este complementaritatea
electrochimica. Fortele intermoleculare de atractie, care stabilizeaza complexul Ag-Ac sunt generate de
interactiuni necovalente: legaturi de hidrogen, forte Van der Waals, forte electrostatice si legaturi hidrofobe.
Toate sunt forte slabe si pentru ca actiunea lor sa se manifeste, pe cele doua molecule reactante, este
necesara prezenta unor grupari suficient de apropiate. Cu cit energia de legare a reactantilor este mai mare,
cu atit complexele Ag-Ac sunt mai stabile.
Interactiunea celor doua grupari reactante (epitop si paratop) este definita de doi parametri:
a) Afinitatea anticorpilor masoara rezultanta fortei de stabilizare a interactiunii dintre situsul lor de
combinare si determinantul antigenic complementar unic al unei haptene monovalente (forta de
legare dintre epitop si paratop). Afinitatea este rezultanta fortelor de atractie si de respingere care
mediaza interactiunea celor doi reactanti.
b) Aviditatea masoara forta rezultanta a interactiunii dintre o molecula de Ac si un Ag cu epitopi
multipli. Cele mai multe molecule antigenice poseda mai mult decit un determinant antigenic. De
exemplu, bacteriile, polizaharidele etc au pe suprafata un numar mare de epitopi repetitivi. Ag
proteice au epitopi multipli, dar diferiti. Antigenele multivalente leaga un numar echivalent de
molecule de Ac. Aviditatea caracterizeaza energia medie a interactiunii de legare a unui Ag
multivalent, cu Ac specifici.
Asocierea Ag-Ac este conditionata de mai multi factori: titrul Ac specifici;concentratia Ag, clasa si subclasa
de Ig participante la reactie;temperatura: valoarea pH: forta ionica:
Din punct de vedere diagnostic, reactiile Ag-Ac in care reactantii se afla in interactiune primara pot fi puse
in evidenta prin nefelometrie. Interactiunea primara nu devine vizibila (complexele Ag-Ac sunt de
dimensiuni mici, solubile si se pot desprinde usor). In vivo aceste interactiuni sunt necesare si suficiente in
vederea neutralizarii unor exotoxine ciculante (difterica, botulinica), pentru inhibarea activitatii unor bacterii
sau virusuri sau in declansarea unor reactii de hipersensibilitate (tip I)
1. Reactiile secundare ilustreaza fenomenele ce pot sa apara in vitro, ca o consecinta directa dar
neobligatorie a interactiunii primare. In vivo, manifestarile interactiunilor secundare sunt dependente
de natura reactantilor si de conditiile de reactie.
In raport cu starea fizica a Ag, reactiile secundare pot fi:
reactii de aglutinare, produse de Ag particulate (celule bacteriene, eritrocite, Ag solubile adsorbite pe
particule de latex, de colodiu etc);
diagnostic bacteriologic (reactia Huddleson)
diagnostic serologic (reactia Wright)
reactii de precipitare, produse de Ag macromoleculare, care se gasesc in stare coloidala (solubile):
proteine, polizaharide, acizi nucleici, lipide;
precipitare in gel: imunodifuzia radiala simpla Mancini, dubla difuzie Ouchterlony
precipitare in mediu lichid: reactia Ramon, precipitarea in inel Ascoli
reactii de fixare a complementului (C), in care moleculele de Ac, dupa reactia cu Ag, activeaza
cascada de proteine a C seric;
diagnosticul serologic al sifilisului, leptospirozei
1

 diagnosticul serologic al infectilor virale

reactii de neutralizare, al caror rezultat este anularea efectului toxinelor, al activitatii enzimelor sau
anularea infectiozitatii virionolor
reactia ASLO (in diagnosticul serologic al infectiilor streptococice)
intradermoreactii cu mecanism imun umoral
Reactiile imune secundare reprezinta modalitatea fundamentala de investigare, apreciere si evaluare
cantitativa a raspunsului imun, desi acesta este diferit de reactia imuna.
Domeniul imunologiei care studiaza interactiunile Ag-Ac in vitro se numeste Imunoserologie, deoarece
Ac se gasesc in ser si in secretii, serul fiind unul din reactantii obligatorii ai oricarei reactii imune.
2. Reactiile tertiare se produc numai in vivo si sunt o reflectare a consecintelor biologice ale
interactiunii primare: ele pot fi benefice (protectoare) sau defavorabile pentru organism, adica sunt
insotite de manifestari patologice de hipersensibilitate sau de fenomene autoimune.Organismul uman
si animal poate raspunde prin reactie imuna la stimularea antigenica. Raspunsul pozitiv semnifica
sinteza Ac, generarea limfocitelor T activate sau o reactie de hipersensibilitate. Raspunsul imun
protector sau de tipul hipersensibilitatii este insotit de starea de memorie imuna. Raspunsul negativ
nu se exteriorizeaza prin manifestari umorale sau celulare in vivo sau in vitro si este rezultatul
incapacitatii Ag de a functiona ca semnal stimulator al sistemului imunitar.
Aplicatii ale reactiilor serologice:
- serotipia identificarea agentului etiologic izolat dintr-un proces patologic, cu ajutorul serului imun
cu specificitate cunoscuta, existent in laboratoarele de profil si conservat prin inghet la temperatura
scazuta (-25 - 30C);
- serodiagnosticul setul de Ag cunoscute, obtinute printr-o metodologie adecvata se utilizeaza in
reactiile Ag-Ac pentru evidentierea Ac serici (sau din alte umori) si a titrului lor. Se obtin astfel
indicii cu privire la sensibilitatea unui organism fata de un agent infectios, cu privire la eficacitatea
unei vaccinari sau date referitoare la titrul Ac fata de o infectie trecuta sau prezenta.
Reactia Ag-Ac de precipitare consta in unirea Ag solubile cu Ac specifici, rezultind complexe Ag-Ac, care
nu devin insolubile si stabile decit in cazul formarii unei retele tridimensionale, conform teoriei retelei care
presupune: un Ag cel putin trivalent pentru amplasarea Ac, un Ac bivalent si conditii fizice favorabile
precipitarii.
Reactia de precipitare este sensibila si specifica in evidentierea prezentei Ag (pentru realizarea retelei Ag-Ac
este necesar ca in reactie sa intre o anumita cantitate de Ag si Ac, care sa se gaseasca intr-un anumit
raport/proportie, iar Ag care participa la formarea agregatelor sunt intr-o cantitate proportional mai mica, in
raport cu Ac).
Clasificarea reaciilor de precipitare
Reactia Ag-Ac de precipitare poate avea loc in mediu lichid sau solid.
Reactii de precipitare in mediu lichid:
de floculare: titrarea toxinei difterice, determinarea titrului Ac antitoxici VDRL (Veneral Disease Research
Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin), utilizate in diagnosticul serologic al sifilisului
reactii de precipitare in inel:reactia Ascoli, determinarea grupului streptococic
reactii de precipitare in tub capilar:determinarea prezentei proteinei C reactive, determinarea
prezentei
tipului M streptococic (streptococi de grup A)
dozajul nefelometric
Reactii de precipitare in mediu gelifiat:
imunodifuzia radiala simpla (metoda Mancini)
difuzia dubla: metoda Elek, difuzia dubla radiala (Ouchterlony)
Reactii de precipitare in care difuzia in gel este combinata cu migrarea in cimp electric:
Imunoelectroforeza
Contraimunoelectroforeza
Electroforeza urmata de imunofixare
Electroimunodifuzia
Reacii de precipitare n mediu lichid Au la baza unirea Ag cu Ac in mediul lichid, formindu-se complexe
Ag-Ac, care vor precipita atunci cind Ag si Ac se gasesc in anumite proportii.
2

 Reacii de precipitare n amestec Se demonstreaza prezenta sau absenta precipitatului in functie de

concentratiile relative de Ag si Ac. De exemplu, pentru titrarea toxinei difterice (Ramon) se pun in contact,
in amestec in tuburi, cantitati egale din componenta care trebuie titrata (toxina difterica, Ag) cu cantitati
variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Asemanator, prin metoda Dean si Web se poate determina titrul
Ac anti-toxici, cunoscind titrul toxinei.
VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) este un test de floculare, netreponemic (nespecific) utilizat
pentru diagnosticul serologic al sifilisului. Testele de floculare se bazeaza pe faptul ca particulele antigenice
ramin dispersate in serul normal, dar formeaza grunji vizibili atunci cind se combina cu reaginele.
Tehnica:
Rezultatul este negativ daca lichidul nu prezinta flocoane si este asemanator martorului negativ si martorului
Ag. Rezultatul este pozitiv cind se vad flocoane, in lichid clar. Rezultatul negativ nu elimina diagnosticul de
sifilis; pacientul se poate afla in perioada de incubatie sau in faza de sifilis latent (evidentiabil prin TPHA).
RPR este un alt test de floculare, netreponemic (nespecific) utilizat pentru diagnosticul serologic al
sifilisului.
Tehnica:
Se executa pe carduri de material plastic pe care apar mai multe cercuri de 18 mm. Ag este preparat dintr-o
suspensie antigenica tip VDRL modificata (pentru a elimina etapa de inactivare prin caldura). Reactivul
contine si particule de carbune. Ag RPR este amestecat cu serul de cercetat in cercul de pe card. Daca Ac
anti-T. palidum sunt prezenti, se combina cu particulele lipidice din Ag si produc aglutinarea lor. Particulele
de carbune coaglutineaza cu Ac si duc la aparitia unor granule negre pe fondul alb al cardului. In absenta Ac
rezulta un aspect gri uniform. Testul se poate realiza calitativ si cantitativ (dilutii de ser).
Reacii de precipitare n inel
Reacia de precipitare n inel, consta in punerea in contact a Ag si Ac astfel incit sa nu se amestece; reactia
care apare la interfata dintre Ag si Ac se concretizeaza printr-un inel de precipitare albicios.
Aplicatii:
in medicina legala reactia Uhlenhut pentru identificarea originii petelor de singe
in industria alimentara pentru identificarea provenientei unor preparate pe baza de carne
identificarea prezentei Ag carbunos (Ag obtinut de la Bacillus anthracis) reactia Ascoli
- prin Reactia Ascoli.
Reacii de precipitare n mediu solid
Reactia Ag-Ac se vizualizeaza utilizindu-se geloza in care pot sa migreze cei doi reactivi, obtinindu-se un
arc/ linie de precipitare.
Imunodifuzia radiala simpla (IDRS Mancini)
Imunodifuzia radiala simpla (IDRS Mancini) se bazeaza pe difuzia spontana si radiala a Ag din proba de
cercetat, intr-un gel care contine o cantitate constanta de Ac, determinind aparitia unui cerc de precipitare al
carui diametru este direct proportional cu concentratia de Ag din proba. Pentru a obtine un cerc de
precipitare de marime convenabila, concentratia Ac inglobati in gel trebuie sa fie aleasa in functie de titrul
acestora si de concentratia Ag care urmeaza a fi testat.
Aplicatii:
determinarea cantitativa a Ig (IgG, IgM, IgA), fractiunii C3 a complementului, 1- antitripsinei,
siderofilinei etc.
Imunodifuzia radiala dubla (Ouchterlony)
Imunodifuzia dubla se bazeaza pe difuzia Ag si Ac (unul spre celalalt) intr-un gel. Deoarece marimea
moleculelor de Ag si Ac este mai mica decit diametrul porilor gelului, iar distanta parcursa de reactant intrun anumit timp este direct proportionala cu gradientul concentratiei sale si invers proportionala cu greutatea
sa moleculara, migrarea reactantilor unul spre celalalt determina formarea unor linii de precipitare la locul
de intilnire Ag-Ac. In gelul transparent vor aparea linii opace, numarul lor corespunzind numarului
sistemelor Ag-Ac studiate. Metoda certifica prezenta sau absenta proteinei cercetate.
Aplicatii:
determinarea -fetoproteinei, proteina C reactiva, -2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip
kappa si lambda, produsi de degradare ai fibrinogenului

in micologie, pentru determinarea exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces

dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezenta Ac fata de Ag fungice, in diagnosticul serologic al
aspergilozelor invazive
determinarea specificitatii Ac antinucleari sau a altor Ac
Difuzia dubl Elek
Aplicatii:
depistarea capacitatii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae daca tulpina este
toxigena, toxina va difuza in mediu, iar dupa unirea cu Ac anti-toxina, complexele Ag-Ac vor da nastere
unor linii de precipitare
Reacii de precipitare combinate cu migrarea n cmp electric
Electroforeza proteica in gel este folosita pentru decelarea unor proteine patologice. Deplasarea proteinelor
intr-un strat de gel supus actiunii unui cimp electric se va realiza diferentiat, pentru fiecare structura proteica
in parte, in functie de greutatea moleculara si incarcatura electrica a proteinelor. Pentru vizualizare este
necesara fixarea, uscarea si colorarea liniilor de precipitare care corespund fractiunilor proteice din serul
normal sau a unor eventuale proteine patologice.
Imunoelectroforeza Se asociaza electroforeza in gel cu imunodifuzia dubla (realizindu-se separarea prin
electroforeza a proteinelor in mediu gelozat, urmata de o imunodifuzie dubla utilizind un antiser
corespunzator). Reactia Ag-Ac se va vizualiza prin aparitia unor arcuri de precipitare. Este o metoda foarte
utila in studierea puritatii unui Ag (sau Ac).
Aplicatii:
evidentierea prezentei Ag K eliminat in urina in boala pneumococica
Contraimunoelectroforeza este o dubla difuzie in care deplasarea unul fata de celalalt a Ag si Ac este
accelerata de un cimp electric. Aplicatii:
identificarea prezentei AgHBs importanta istorica
identificarea Ag capsulare in LCR la pacientii cu meningita acuta (Haemophilus influenzae,
Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae).
Electroimunodifuzia are la baza electroforeza probelor care contin proteina-Ag, intr-un strat de gel, care
contine o cantitate constanta de Ac monospecifici (anti proteina-Ag), rezultind zone de precipitare in forma
de racheta sau conuri, a caror arie este direct proportionala cu concentratia Ag. Metoda are o sensibilitate
mai mare decit imunodifuzia radiala simpla.
Reactia de aglutinare consta in reactia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafata unor particule
(bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol), determinind aglutinarea acestora prin scaderea fortelor
electrostatice de repulsie dintre particule si formarea unor punti de legatura. Antigenele sunt de natura
corpusculara.
Aglutinarea este mai sensibila decit precipitarea, Ag fiind o particula si nu o molecula solubila. Ac de tip
IgM sunt mai aglutinanti decit Ac de tip IgG (pentru ca au mai multe valente). Exista si Ac neaglutinanti
(incompleti / blocanti) sau care aglutineaza numai la rece.
1. Aglutinarea directa
Aglutinarea directa este aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii, celule) de catre Ac specifici.
Aplicatii:
in diagnosticul bacteriologic: de exemplu pentru identificarea enterobacteriaceelor (Shigella,
Salmonella, E. col, Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae) pe baza structurii antigenice
in diagnosticul serologic al unor boli infectioase (febra tifoida, bruceloza, leptospiroza, rickettsioza)
determinarea grupelor sanguine (AB0)
Aglutinarea directa pe lama in diagnosticul bacteriologic
Aglutinarea directa pe lama reactia Huddleson
Aplicatii: diagnosticul brucelozei
2. Aglutinarea indirecta (pasiva) o reactie in care particule artificiale (globule rosii formolate, particule de
latex, cristale de colesterol, colodiu etc) sau naturale sunt incarcate in vitro cu Ag sau Ac si sunt aglutinate
de catre Ac sau Ag corespondente din proba de cercetat.
Aplicatii:
determinarea factorului reumatoid, CRP
determinarea grupului streptococic, a pneumococilor, meningococilor
identificarea E. coli tip capsular K1, H. influenzae tip capsular b
4

detectarea unor enterotoxine (stafilococice, clostridiene)

detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp) sau virusuri
identificarea unor exotoxine in filtratul de cultura
identificarea E. coli O:157, Legionella pneumophilla, Listeria monocytogenes
Hemaglutinarea pasiva - TPHA (Treponema pallidum hemaglutinatinare)
DETERMINAREA TPHA :
POZITIV: de la 4+ la 1+ INCERT: +/- NEGATIV : -LIMITELE REACTIEI
Tehnica TPHA poate da reactii incrucisate cu alte forme de infectii cu treponeme si reactii fals pozitive cu
probele pacientilor cu mononucleoza infectioasa, lepra sau maladii autoimune.
Reactii fals pozitive pot cauza si serurile lipemice sau icterice.
Ocazional, in unele cazuri de sifilis primar precoce, anticorpii specifici ar putea sa nu fie detectati prin
tehnicile TPHA. Anticorpii specifici pot persista o lunga perioada de timp, chiar daca tratamentul acestei
boli a avut succes.
3. Inhibarea aglutinarii
Reactia consta in inhibarea aglutinarii particulelor incarcate cu Ag, dupa ce in prealabil Ac reactioneaza cu
Ag corespondent.
Aplicatii:
decelarea mioglobinei, diagnosticul imunologic al sarcinii
Aglutinarea in coloana
Metoda permite o mai buna vizualizare a reactiei. Dispozitivul utilizat are 2 compartimente, partea in care se
introduc reactivii (situata superior) si o coloana situata inferior, plina cu microparticule de sticla. Dupa
introducerea hematiilor si a serului de cercetat si incubarea acestora, dispozitivul este centrifugat. In cazul
unei reactii pozitive complexul Ag-Ac se va vizualiza la nivelul coloanei, in timp ce in cazul unei reactii
negative, hematiile se depun in portiunea inferioara a coloanei
Aglutinarea mediata de Ac anti-imunoglobuline
Ac anti-Ig se vor cupla cu particule incarcate cu Ac si vor duce la aparitia unor aglutinate (prin aparitia
complexului imun).
Aplicatii: decelarea factorului reumatoid (tehnica Waaler-Rose).
Reacia de fixare a complementului (RFC). Reactia Bordet - Wasserman
Principiu:
Reacia de fixare a complementului (RFC) se bazeaza pe proprietatea sistemului C de a se fixa pe
complexul imun Ag-Ac. In prima faza a reactiei se introduce serul de cercetat iar daca acest ser contine Ac
specifici fata de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fixarea C, care se va activa pe calea
clasica si nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac antihematie).
In cazul in care serul de cercetat nu contine Ac specifici fata de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui
complex Ag-Ac in prima etapa a RFC. Dupa introducerea in reactie a sistemului hemolitic indicator,
hematiile si Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun, iar C liber se va fixa pe acesta. Dupa
fixare va urma activarea C si respectiv liza hematiilor, hemoliza putind fi examinata cu ochiul liber.
Pentru vizualizarea reactiei este nevoie de utilizarea unui sistem hemolitic indicator; Ag este sub forma
macromoleculara sau corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu devine
vizibil cu ochiul liber, daca nu se adauga sistemul hemolitic.
Aplicatii:
diagnosticul serologic al sifilisului reactia Bordet-Wasserman
diagnosticul serologic al infectiilor produse de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia
spp., Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp, virusuri
Reacia de seroneutralizare
Principiu:
Ag are o anumita proprietate biologica (toxica, enzimatica) care poate fi blocata prin cuplarea cu Ac
specific. Neutralizarea efectului biologic respectiv se poate realiza doar in cazul in care determinantul pentru
toxicitate sau pentru activitatea enzimatica respectiva este acelasi cu determinantul antigenic (epitop). RSN
are nevoie de un artificiu tehnic pentru a permite vizualizarea rezultatelor.
Aplicatii:
diagnosticul microbiologic direct:
5


identificarea Clostridium perfringens prin metoda placilor semineutralizate

testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de seroprotectie)

toxinotipia in cazul suspicionarii unei toxiinfectii alimentare cu Clostridium botulinum

diagnosticul serologic:

reactia ASLO
prevenirea unor boli infectioase prevenibile prin vaccinare si evaluarea eficacitatii vaccinale:

vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, ATPA, ADPA)

titrarea prezentei Ac anti-toxine (difterica, tetanica)

testarea prin IDR (intradermoreactie) a susceptibilitatii fata de o anumita boala infectioasa care are la
baza drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine
tratamentul/ profilaxia unor boli infectioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice omologe sau
utilizarea unor seruri hiperimune heterologe
Reactia ASLO determina titrul Ac antistreptolizina O (SLO).
Aplicatii:
diagnosticul retrospectiv al unei infectii streptococice
confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice
Principiu:
Titrarea Ac anti-SLO se bazeaza pe faptul ca SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de
berbec. In cazul in care in serul de cercetat exista Ac anti-SLO, actiunea hemolitica a SLO este neutralizata.
Combinind dilutii din serul de cercetat cu o cantitate constanta de SLO se poate determina titrul ASLO.
Utilizarea RSN in profilaxia si tratamentul unor boli infectioase
Vaccinarea in scopul obtinerii unei protectii prin seroneutralizare
Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) in faza I, combinata cu anatoxina
difterica si tetanica. Primovaccinarea se incepe cu virsta de 2 luni a nou-nascutului, administrindu-se 3 doze
la interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru mentinerea imunitatii se practica revaccinarea I la 6 luni de la
primo-vaccinare, iar revaccinarea a II-a se practica la 36 luni de viata a copilului respectiv.
Metoda radioimuna (RIA) Principiu
Metoda radioimuna (RIA) foloseste pentru vizualizarea reactiilor Ag-Ac reactivi marcati cu izotopi
radioactivi. Pentru marcarea Ag se pot utiliza izotopi 3H, 125I, 14C. Se introduc in reactie o cantitate
cunoscuta de Ag marcat radioactiv, Ag nemarcat pe care dorim sa il dozam si Ac cunoscuti cu specificitate
fata de Ag. Se va realiza o competitie pentru cuplarea cu Ac intre Ag marcat si Ag nemarcat radioactiv. Dupa
respectarea timpilor din protocolul de lucru se masoara radioactivitatea complexului Ag-Ac si aplicind
formule de calcul corespunzatoare se poate afla cantitatea de Ag nemarcat.
Ag marcat se amesteca cu Ac, la o concentratie care satureaza situsurile de legare ale moleculelor de Ac. Se
masoara scaderea cantitatii de Ag marcat legat de Ac specifici in prezenta probei test, pentru determinarea
cantitatii de Ag nemarcat din proba test (insulina sau Ag HBs).
Ag marcat este o componenta a amestecului de reactie. Proba test poate fi serul sau alte fluide care contin Ag
nemarcat. Cantitatea de Ag marcat se alege asfel incit numarul epitopilor sa depaseasca numarul situsurilor
de legare ale Ac. Aceasta garanteaza ca Ag nemarcat adaugat la amestecul de reactie intra in competitie cu
Ag marcat pentru cantitatea limitata de Ac.
Chiar o cantitate mica de Ag nemarcat adaugata la amestec va determina scaderea cantitatii de Ag marcat.
Scaderea va fi proportionala cu cantitatea de Ag nemarcat adaugat.
Pentru a determina cantitatea de Ag marcat legat, complexul Ag-Ac se precipita pentru a-l separa de Ag liber
(nelegat de Ac) si se masoara radioactivitatea precipitatului.
Cu cit concentratia Ag nemarcat este mai mare, cu atit este mai mica concentratia complexului radioactiv Ag
marcat-Ac si cu atit mai mare concentratia Ag marcat liber. Reactia are loc in solutie si rezulta un amestec de
Ag legat si liber.
RIA este o tehnica obiectiva, cu foarte mare sensibilitate, permite cuantificarea unor cantitati foarte mici de
Ag sau de Ac din proba: hormoni hipofizari, tiroidieni, steroizi, insulina, unele medicamente, alfafetoproteina, Ag carcinoembrionar, IgE, virusuri hepatitice, HIV sau Ac specifici corespunzatori.
Dezavantaje: metoda costisitoare, utilizeaza material radioactiv
Determinarea cantitativa a Ag HBs prin RIA
6

Dozarea IgE prin RIA

Se foloseste testul radioalergosorbent (RAST), utilizat pentru determinarea IgE la pacientii alergici.
Alergenul (extractul de polen) se cupleaza covalent de un imunosorbent (un disc de hirtie). Ulterior se
adauga serul pacientului. Cantitatea de IgE specific fixata pe disc poate sa fie estimata prin adaugarea IgG
de iepure, marcat radioactiv, anti-IgE uman.
Determinarea Ac anti-ADN in LED
Daca serul unui pacient este adaugat in godeurile tapetate cu Ag (in acest caz, ADN), auto-Ac se fixeaza de
godeul de plastic, iar proteinele serice se indeparteaza prin spalare.
Ac serici legati de ADN pot fi estimati prin adugarea IgG de iepure anti-IgG uman, marcat cu I125. Dupa
spalarea reactantului in exces, nelegat, radioactivitatea tubului va estima continutul in auto-Ac al serului
analizat.
Imunofluorescenta poate fi utilizata atit in diagnosticul microbiologic direct (pe produsele patologice
recoltate de la bolnav sau pe cultura pura), cit si in diagnosticul serologic. Unul din reactivi (Ag, Ac sau Ac
anti-Ac) este marcat fluorescent. Fluorocromii se cupleaza cu regiunea Fc a moleculei de Ac si nu interfera
cu capacitatea acesteia de a reactiona cu Ag specific. Molecula fluorescenta cuplata de Ac devine marker si
semnaleaza situsul de legare a Ac cu un Ag celular sau tisular. Anticorpii marcati fluorescent pot fi detectati
prin emisia luminii colorate. Cei mai folositi coloranti fluorescenti sunt fluorosceina, rodamina B, auramina
O, acridin-oranj R sau tripaflavina.
Tehnicile de imunofluorescenta pot fi de tip direct sau indirect.
Imunofluorescenta directa
Principiu:
Ag este necunoscut si se poate afla intr-o cultura, etalat pe frotiu ca atare sau parazitind anumite celule (de
exemplu se poate utiliza o proba recoltata prin biopsie). Produsul care urmeaza a fi analizat este incubat in
prezenta Ac marcati fluorescent, cunoscuti. Complexul Ag-Ac este fluorescent, iar Ag se evidentiaza direct.
Dezavantaj: pentru fiecare Ag de cercetat trebuie preparat serul care contine Ac specifici, marcati
fluorescent; dezavantajele sunt evidente cind diferite Ag trebuie identificate intr-un numar mare de probe.
Aplicatii:
identificarea Ag de Legionella pneumophila, Bordetella pertusis, Mycobacterium
tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Treponema palidum, Cryptococcus neoformans, Histoplasma
capsulatum, Pneumocystis jiroveci
Imunofluorescenta indirecta
Principiu:
Metoda presupune realiarea unui frotiu pornind de la Ag cunoscut. Sectiunile tisulare sau preparatele
celulare se trateaza cu serul de cercetat, iar dupa spalare Ac legati specific de Ag celulare se evidentiaza prin
tratarea cu serul imun anti-Ig marcata cu fluorocromi. Rezulta un complex format din 3 elemente: Ag celular
(tisular) + Ac specific + anti-Ig conjugata.
In prima etapa are loc reactia dintre Ag si Ac specific nemarcat. Legarea lor specifica este vizualizata prin
intermediul unei Ig conjugate, care are activitate de Ac fata de Ac specific din serul de cercetat. In aceasta
reactie, Ac nemarcat are rolul unui reactant dublu: este Ac deoarece se combina specific cu Ag, dar are si
rolul de Ag in raport cu cel de-al doilea Ac marcat (conjugat) cu fluoresceina.
Metoda indirecta este avantajoasa fata de metoda directa, deoarece necesita prepararea unui singur conjugat:
Ac anti-Ig umana sau animala, obtinuti pe iepure, se conjuga cu fluorocromul. Este necesara insa, bateria de
seruri imune specifice umane sau animalefata de Ag agentilor infectiosi.
In scopul marcarii cu fluorocrom, Ac anti-Ig umana trebuie sa aiba un grad cit mai inalt de puritate.
Prima etapa a purificarii Ac este separarea gamaglobulinelor serice prin metoda precipitarii chimice.
Metoda IF indirecte este mai sensibila decit cea directa, dar are dezavantajul ca Ac din serul nemarcat pot sa
dea reactii nespecifice si de aceea se dilueaza.
Metoda IF este sensibila, dar nu este metoda ideala pentru a identifica structurile celulare sau tisulare, din
cauza raportului mic dintre semnal si tinta identificata.
In locul Ac anti-Ig marcati cu substante fluorescente, in IF indirecta se pot folosi alte molecule cuplate cu
fluorocromi sau cu enzime: proteina A de S. aureus, care se leaga cu mare afinitate de regiunea Fc a IgG. A
treia varianta indirecta foloseste avidina conjugata cu fluorocrom, care se leaga mcu mare afinitate de
biotina cu care este marcat Ac secundar anti-izotip.
Avantaje fata de metoda directa:
7

Ac primar nu trebuie conjugat cu fluorocromul

mareste sensibilitatea colorarii pentru ca mai multe molecule de fluorocrom se leaga prin intermediul
Ac secundar, de Ac primar, marind cantitatea de lumina emisa la situsul de legare al Ac primar.
Aplicatii:
diagnosticul serologic al infectiilor produse de Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae,
Leptospira spp., Borrelia burgdorferi, Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii,
Treponema palidum,
Pneumocystis jiroveci
identificarea unor subpopulatii de limfocite T, in special CD4 si CD8
detectarea complexelor imune in bolile autoimune
detectarea componentelor complementului in tesuturi
determinarea hormonilor si a altor produse de sinteza, in situ
localizarea Ag in sectiunile de tesut sau in compartimentele subcelulare
Imunofluorescenta indirecta pentru evidentierea anticorpilor antinucleari (AAN)
Anticorpii antinucleari (AAN) sunt specifici fata de componentele nucleului celular (nucleoproteine si acizi
nucleici) si se sintetizeaza in colagenoze (lupus eritematos diseminat, artrita reumatoida). Prezenta AAN este
de 100% in LED. Evidentierea AAN este un indicator al diagnosticului, al evolutiei si este utila in
monitorizarea terapiei; metoda cea mai folosita este IFA indirecta cu dilutii succesive de ser.
Rezultat negativ: pe un fond usor verzui, se observa mici zone intunecate, ce corespund nucleilor necolorati.
Rezultat pozitiv: pe fondul usor verzui, apar nuclei cu fluorescenta stralucitoare.
ELISA = ENZYME LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY = EIA = ENZYME IMMUNOASSAY
PRINCIPIU:
ELISA = test imunoenzimatic cu elemente marcate, care determina Ac sau Ag prin reactia specifica Ag Ac;
prezenta complexelor Ag Ac poate fi vizualizata si masurata, deoarece unul dintre reactivi este conjugat cu
o enzima, iar dupa adaugarea in mediul de reactie a unui substrat cromogen specific enzimei marker,
densitatea optica a mediului de reactie se va modifica, iar valoarea densitatii optice se poate masura
spectrofotometric.
CLASIFICARI:
In functie de scopul urmarit:
determinari de Ag
determinari de Ac din ser, LCR sau alte lichide biologice
In functie de tipul si ordinea reactivilor introdusi in reactie:
reactii necompetitive
reactii de competitie directe sau indirecte
In functie de complexitatea tehnicii:
clasice
simple / rapide
In functie de modificarea activitatii markerului enzimatic:
reactii in faza omogena
reactii in faza heterogena ( activitatea markerului enzimatic nu este influentata de catre reactia Ag
-Ac) mai frecvent utilizate
AVANTAJE:
1.
Specificitate buna si in unele cazuri chiar foarte buna
2.
Sensibilitate comparabila cu RIA
3.
Preturi competitive
4.
Tehnica de lucru simplificata, automatizare
DETERMINAREA ANTIGENELOR
Cea mai comuna tehnica pentru detectia Ag este ELISA sandwich. Tehnica utilizeaza doua tipuri de Ac, ce
reactioneaza succesiv cu Ag a carui concentratie se determina. O anumita cantitate dintr-un anticorp este
fixata la o serie de suporturi solide (placute de plastic).
APLICABILITATE PRACTICA:
diagnosticul rapid al unor infectii ( ex. Streptococcus pyogenes si Chlamydia trachomatis)
8

diagnosticul unor viroze la care agentul etiologic este necultivabil sau dificil de cultivat ( Ag HBs,
Ag Hbe, Ag p 24 pt HIV, rotavirusuri, virusul Norwalk)
diagnosticul bronsiolitei sugarului cu virusul sincitial respirator pentru orientarea rapida spre
tratamentul cu Ribavirin si evitarea excesului de antibiotice
diagnosticul rapid al gripei, infectiilor herpetice, gastroenteritelor (Ag Helicobacter pylori, Ag
Giardia)
DETERMINAREA ANTICORPILOR
ELISA indirecta este varianta pentru determinarea calitativa sau cantitativa a Ac. Serul sau o alta proba care
contine Ac primari (Ac1) se adauga la godeurile tapetate cu Ag ale unei microplaci. Dupa incubare, Ac liberi
se indeparteaza prin spalare, iar prezenta Ac1 legat de Ag se detecteaza adaugind un Ac secundar (Ac2)
conjugat cu o enzima, specific fata de Ac1. Ac2 se indeparteaza prin spalare si se adauga substratul enzimei.
Cantitatea produsului colorat de reactie care se formeaza, se determina la spectrofotometru, care citeste
absorbtia fiecarei probe.
APLICABILITATE PRACTICA:
ELISA indirecta se foloseste pentru detectarea prezentei Ac specifici anti-HIV. In aceasta varianta, proteinele
invelisului si proteinele regiunii centrale, obtinute prin tehnologia ADN recombinant, sunt adsorbite pe
godeurile unei microplaci si reprezinta Ag in faza solida. Ac serici anti-HIV se pot detecta prin metoda
ELISA indirecta la 6 saptamini dupa infectie.
Prin tehnica ELISA se pot diagnostica o gama larga de boli infectioase, prin punerea in evidenta a
anticorpilor specifici:
hepatite virale A, B, C, D, E Ac anti HAV, anti HBc, anti HBe, anti HBs, anti HCV, anti HDV, anti
HEV
SIDA Ac anti HIV 1 si 2
Infectii cu Chlamydia, Helicobacter pylori
Sifilis
TORCH Ac anti Toxoplasma, Rubella, Citomegalovirus, Herpes virus
Oreion, rujeola, infectia varicela, zona zoster
Difterie, tetanos
Infectii respiratorii: adenovirusuri, influenza, Legionella, Mycoplasma, virusul sincitial respirator,
TBC
Infectii cu Candida
Infectii cu v. Epstein-Barr
Enteroviroze
Parazitoze: Leptospira, Toxoplasma
IMMUNOBLOTTING ( TEHNICA WESTERN BLOT ). PRINCIPIU. TEHNICA.
APLICABILITATE PRACTICA
PRINCIPIU
BLOTTING = transfer prin capilaritate
Imunobloturi tehnici foarte sensibile si specifice principiu: numeroase membrane sintetice pot lega
proteine suficient de puternic astfel incit devin suport pentru reactii imunologice in faza solida; proteinele
legate isi pastreaza reactivitatea antigenica fiind accesibile Ac din proba de testat.
WESTERN BLOT = procedeu prin care proteinele separate electroforetic sunt transferate pe o membrana
suport ( filtru de nitroceluloza) si reactioneaza cu Ac specifici din proba.
( Southern Blot Edwin Southern tehnica de detectie ADN; Northern Blotting tehnica de detectie ARN )
In tehnica Western Blot se combina selectivitatea electroforezei in gel cu specificitatea testelor imunologice
ceea ce permite detectarea si analizarea proteinelor aflate in amestec. Rezultatele sunt calitative.
Metoda este folosita pt identificarea unei proteine intr-un amestec complex, cu Ac cu specificitate cunoscuta
sau pentru detectarea Ac specifici. Proteinele sint izolate, denaturate cu SDS ( sodium-dodecil-sulfat) si
separate prin electroforeza in gel de poliacrilamida ( SDS-PAGE). SDS este un detergent care denatureaza
proteinele si le confera o sarcina globala negativa. Proteinele de diferite dimensiuni pot fi separate prin EF in
gel de poliacrilamida pe baza greutatii lor moleculare, care determina pozitia lor in gel.

Dupa separarea lor, proteinele se transfera din gelul PAA, pe o membrana suport de nitroceluloza prin
fenomenul de capilaritate ( blotting). Proteinele se leaga nespecific de membrana de nitroceluloza. SDS este
eliminat din proteina in timpul procesului de transfer si pe masura ce proteinele se renatureaza, isi
redobindesc determinantii antigenici nativi. Astfel pozitia proteinelor pe membrana poate fi identificata prin
legarea Ac specific marcat ( radioactiv sau conjugat cu o enzima).
Western blot se poate folosi pentru identificarea Ac specifici dintr-un amestec. In acest caz, Ag cunoscute, cu
greutate moleculara bine determinata, sunt separate prin SDS PAGE si transferate pe nitroceluloza.
Benzile separate ale Ag cunoscute sunt acoperite cu probele in care se cauta Ac specifici pentru unul sau mai
multe Ag. Reactia Ac cu unul dintre Ag se detecteaza folosind un Ac anti imunoglobulinic, marcat radioactiv
sau cuplat cu o enzima. Aceasta varianta este utilizata ca metoda de cofirmare pentru determinarea prezentei
Ac anti-HIV, ce pot reactiona cu una sau mai multe proteine virale.
APLICATII PRACTICE
confirmare Ac anti-HIV
dg encefalopatie spongifoma bovina ( boala vacii nebune )
boala Lyme
Citometria in flux este o metoda moderna prin se pot determina simultan numeroase proprietati fizice si
biologice ale celulelor si ale altor particule izolate, marcate cu fluorocromi, care circula in flux, trecind una
cite una prin fata statiei de masurare.
Desi principiul citometriei in flux este cunoscut din anii 30, abia in ultimii 20 ani s-a ajuns la o metoda
sensibila, practica, simpla si relativ ieftina, utilizabila in laboratorul clinic.
Dezvoltarea citometriei in flux se datoreaza progreselor in domeniul tehnologiei laserului, al producerii de
Ac monoclonali, al citochimiei, al chimiei fluorocromilor si al informaticii. Instrumentele din noua generatie
sunt mai ieftine, mai mici, mai usor de instalat si de manipulat. Laserul neste racit cu aer, nu este necesara o
sursa de aer comprimat. Ajustarile manuale au fost inlocuite prin controlul automat efectuat prin computer.
S-a avut in vedere si protectia operatorului.
Simultan a evoluat tehnologia Ac monoclonali, care a condus la largirea panelului de reactivi utili in clinica,
disponibili in cantitate mare si s-au descoperit noi fluorocromi, permitind analiza cu un singur laser a
celulelor dublu sau triplu marcate.
Analiza prin citometrie in flux prezinta numeroase avantaje fata de examinarea la microscop: este o metoda
mai rapida, precisa, mai sensibila, obiectiva, multiparametrica, automata si reproductibila.
Citometria in flux a trecut rapid din laboratoarele de cercetare in laboratoarele clinice. Dezvoltata pt a
automatiza procesul laborios al imunofenotiparii, citometria in flux s-a extins in multe domenii. Una din cele
mai importante aplicatii ale citometriei in flux este evaluarea tulburarilor imunitare: cele asociate tumorilor
maligne hematologice si deficitele imune; se mai aplica si in domeniul transplantarii pt testarea
compatibilitatii si monitorizarea imunologica post-transplantare.
Utilizarea unor fluorocromi speciali permite masurarea precisa de ADN a celulelor: determinarea gradului
de aneuploidie si a capacitatii proliferative a celulelor tumorale constituie o alta aplicatie importanta a
citometriei in flux.
Se mai pot masura proteinele oncogene, apoptoza si receptorii pt citokine. CF se utilizeaza in farmacologia
celulara, cu implicatii in strategia terapeutica.
APLICATII PRACTICE
1.
IMUNOLOGIE: identificarea si enumerarea populatiilor celulare prin Ag de suprafata clasificate
CD - clusters of differentiation
imunofenotiparea populatiilor limfocitare: in deficite imune/ SIDA, boli autoimune, transplant
2.
HEMATOLOGIE: diagnosticul si clasificarea leucemiilor si limfoamelor, numararea reticulocitelor,
diferentierea limfoproliferarilor reactive de cele maligne, prognosticul hemopatiilor maligne, analiza
trombocitelor
3.
ONCOLOGIE: analiza ploidiei AND, raportul ADN: ARN, analiza oncogenelor , antigene nucleare
( asociate proliferarii), markeri tumorali
4.
MICROBIOLOGIE: identificarea bacteriilor utilizind coloranti ai ADN, substrat fluorogenic pentru
activitatea enzimatica, parametrii de dispersie ai luminii; identificarea parazitilor intracelulari
10

5.
6.

ENDOCRINOLOGIE: analiza spermei prin continutul AND, sortarea spermei X:Y

GENETICA analiza cromozomiala

PRINCIPIUL DE FUNCTIONARE
Celulele se coloreaza cu probe marcate fluorescent, care au specificitate pentru moleculele caracteristice si
apoi se masoara cantitatea de fluorescenta dispersata de celula care trece individual printr-o raza laser.
Celulele disperseaza o cantitate de lumina proportionala cu dimensiunile lor. Granulatia celulara este
proportionala cu cantitatea de lumina laser dispersata.
Componentele de baza ale unui citometru in flux sunt:
sistemul de colectare si transport al probelor
sistemul fluidic (teaca coaxiala)
sursa de lumina si sistemul optic de focalizare
detectorii de semnale
computerul
sistemul de afisare si analiza a datelor
mecanismul de sortare
Analiza prin CF include urmatoarele etape:
prepararea suspensiei celulare
marcarea celulelor cu diferiti liganzi cuplati cu fluorocromi
fixarea cu paraformaldehida a celulelor marcate
analiza citometrica
interpretarea datelor
1.
Obtinerea suspensiei celulare
Analiza prin CF implica cu necesitate utilizarea celulelor in suspensie. Fluidele corpului, fiind suspensii
celulare naturale, sunt usor de utilizat; izolarea celulelor din tesuturi solide, chiar fixate si incluse in
parafina, desi mai laborioasa si dificila, este totusi posibila.
2.
Marcarea celulelor
Celulele izolate sint marcate cu reactivi specifici (anticorpi monoclonali sau alti cromofori) pt Ag de
suprafata sau alte molecule intracelulare ( de ex. ADN). S-au identificat grupe de Ac monoclonali care
reactioneaza cu aceleasi Ag (cluster of differentiation - CD) in numar total de 130.
Selectarea markerilor se face in functie de diagnostic.
3.
Fixarea cu paraformaldehida a celulelor colorate pastreaza integritatea celulara si fluorescenta timp
de 24 ore (pt markerii de suprafata). Analiza ADN trebuie facuta in maxim 3 ore de la colorare.
4.
Analiza prin CF
Un sistem hidropneumatic injecteaza sub presiune suspensia celulara in centrul unei teci de lichid (sheath
liquid), acesta fiind un tampon salin. Jetul de lichid cade vertical din camera de flux si intilneste punctul
focal al unei surse intense de lumina monocromatica emisa de un laser cu gaz ionizat (argon, krypton,
helium-neon).nPt excitatia optima a celulelor, fasciculul laser trebuie aliniat. Focalizarea laserului este
realizata de un sistem de lentile ce contine sistemul optic de excitatie.
Interactiunea fasciculului laser cu fiecare celula, care dureaza 5-15 microsec, nu afecteaza cu nimic
intregritatea celulara (analiza nedistructiva) si are 2 consecinte majore:
A.
Imprastierea (difuzia, dispersia) luminii
B.
Emisia fluorescentei
5.
Interpretarea datelor
Fiecare celula, in timpul traversarii fasciculului laser, emite semnale care sint vizualizate in timp real pe
monitor sub forma unui punct ale carui coordonate (X, Y) sint in functie de intensitatea masurata (de ex, pe
abscisa intensitatea fluorescentei, iar pe ordonata nr. de celule sau abscisa nr. granule, ordonata
dimensiunea celulei).
Imaginea afisata pe monitor arata o distributie in nori de puncte caracteristice celulelor care le-au generat.
Fiecare nor de puncte este caracteristic unei subpopulatii celulare particulare. Aceasta vizualizare a
rezultatelor poarta numele de dot plot sau diagrama de dispersie.
Achizitia datelor se opreste automat cind nr de celule cerut este atins (10000 - 50000). Rezultatele se
interpreteaza cu ajutorul unor softuri expert.
11

CONCLUZII
Determinarea rapida a proportiei limfocitelor T CD4/ CD8 este posibila prin utilizarea AMC specifici fata de
diferite CD. Probele de analiza pot fi singele, maduva osoasa pastrata in EDTA ori heparina, LCR. Tumorile
solide pot fi analizate dupa dispersia mecanica a celulelor in mediu nutritiv. Pacientii cu infectii HIV,
suspectati sau confirmati vor fi testati pt nr. total de celule T, Th si Ts.
Pacientii suspecti de leucemie sint testati pt. markeri ai celulelor B, T si ai liniei mielo-monocitare.
Identificarea tipului de celula neoplazica este foarte importanta pentru alegerea tratamentului.
CF este o tehnica esentiala pt tehnicile de biologie si imunologie celulara. Sint disponibili AMC pt
caracterizarea limfocitelor T in timpul maturarii. Celulele care exprima CD3 si CD4 apartin fenotipului
helper/ inductor, iar cele care exprima CD3 si CD8 sint de tip supresor/ citotoxic. Un anumit marker CD se
gaseste exclusiv pe o singura populatie celulara, pe care AMC o identifica. De exemplu, CD4 se gaseste pe
limfocitele Th, dar si pe monocite. Pentru a evita rezultatele eronate, se folosesc AMC fluorescenti specifici
fata de doi markeri CD: CD3 (comun tuturor celulelor T) si CD4. Celulele Th sint pozitive pt ambii markeri,
iar monocitele vor fi eliminate din calcul deorece sunt negative pt CD3.
Hibridizarea fluorescenta in situ (FISH) este o tehnica citogenetica moleculara prin care se detecteaza
anomalii cromozomiale numerice si structurale care nu pot fi identificate cu precizie prin studiul
conventional al cariotipului.
Avantaje:
este o tehnica simpla
poate fi folosita pe preparate deja arhivate
timpul de procesare si analiza este destul de scurt
nu altereaza morfologia celulara
are precizie crescuta, rezolutie mare
exista posibilitatea efectuarii analizei celulelor in diviziune sau in interfaza
Prin studiul celulelor in diviziune se depisteaza microdeletii sau microduplicatii cromozomiale, translocatii,
se identifica cromozomii marker si fuziunile genice. Se aleg sonde multilocus pentru a descoperi anomaliile
cromozomiale banuite.
Studiul celulelor in interfaza permite depistarea aneuploidiilor (anomalii numerice) cu aplicatii in
diagnosticul prenatal, in stabilirea sexului genetic.
Dezavantaje:
- cost ridicat al sondelor, reactivilor, aparatelor
Principiul metodei
La baza tehnicii FISH sta hibridizarea (formarea legaturilor de H) intre o sonda specifica ADN marcata
fluorescent sau imunohistochimic si o anumita regiune complementara sondei de pe un cromozom. Sonda
ADN fiind marcata in prealabil cu un fluorocrom devine vizibila la microscopul cu fluorescenta.
Hibridizarea se bazeaza pe legea complementaritatii bazelor azotate, conform careia in molecula de ADN se
formeaza urmatoarele perechi: A-T, C-G. Astfel se stabileste prezenta sau absenta secventei de ADN de
interes (corespunzatoare sondei), numarul de copii ale secventei respective si pozitia sa pe un anumit
cromozom.
Exista mai multe tipuri de sonde in functie de tipul de anomalie cromozomiala suspicionata:
Sonde specifice unui locus, pentru identificarea deletiilor sau duplicatiilor submicroscopice (care nu sunt
vizibile utilizand cariotipul conventional).
cat-eye etc. Fenotipul acestor sindroame include dismorfie faciala, retard mental si diverse malformatii.
Sondele centromerice au rol in identificarea unui anumit cromozom si/sau detectarea anomaliilor numerice
ale cromozomului respectiv.
Sondele telomerice permit diagnosticarea microdeletiilor sau altor rearanjamente criptice.
Sonde subtelomerice
Sondele specifice unui cromozom permit colorarea intregului cromozom sau doar a unei regiuni. Prin
colorarea diferita a doi sau mai multi cromozomi se pot identifica mici rearanjamente in care acestia sunt
implicati.
Probe Se aleg in functie de scopul diagnosticului: singe venos periferic, limfocite periferice, maduva osoasa,
lichid amniotic, biopsie din vilozitati corionice, produs de conceptie, ganglioni limfatici, tumori solide.
12

Se pot folosi preparate proaspat recoltate sau conservate prin congelare si impregnare la parafina. Pe
preparatele conservate se detecteaza doar anomaliile numerice si translocatii sau deletii; nu se pot folosi
pentru depistarea rearanjarilor.
Aplicatii practice
A. identificarea anomaliilor cromozomiale dobindite in leucemii, limfoame si cancere studiul
translocatiilor, deletiilor si amplificarilor cromozomiale la celulele in metafaza si interfaza:
- in transplantul de maduva osoasa
- pentru modificarile citogenetice dificil de diagnosticat prin analiza traditionala
- in diagnosticul cancerelor mamare, de vezica urinara
- in stabilirea originii celulare a neoplasmelor slab diferentiate sau nediferentiate
- pentru stabilirea prognosticului diferitelor tipuri de cancer
- pentru identificarea originii celulare a carcinoamelor cu punct de plecare necunoscut
- demonstrarea fenotipica a clonalitatii proliferarilor limfoide
- diagnosticarea neoplasmelor de tesut moale sau neuroendocrine
- investigarea persoanelor expuse la agenti mutageni
B. diagnosticul defectelor congenitale:
- stari intersexuale
- sindrom plurimalformativ
- debilitati mentale de cauza necunoscuta
- dezvoltarea anormala a caracterelor sexuale secundare
C. diagnosticul prenatal - diagnosticarea anomaliilor cromozomiale responsabile de o serie de boli si
tulburari reproductive grave:
- sterilitate primara nedeterminata
- avorturi spontane repetate sau copii nascuti morti
- prezenta unor anomalii cromozomiale la unul din parinti
- parintii copiilor cu anomalii cromozomiale
- cuplurile cu risc crescut:
- femei peste 35 ani la care riscul de a da nastere la un copil cu aneuploidii (anomalii numerice
cromozomiale) este mai mare decit riscul de avort dupa amniocenteza; sint frecvent diagnosticate trisomia
21 (sindrom Down), 13, 18 (sindrom Edwards), X (sindrom Klinefelter), monosomia X (sindrom Turner) in
corelatie cu incidenta crescuta a nedisjunctiei meiotice in gametogeneza feminina
- depistarea ecografica a unor anomalii congenitale viscerale (cardiace, renale, digestive) asociate la fat cu
existenta unei trisomii autozomale (21, 18, 13) sau a monosomiei X
- aparitia unor rezultate alarmante in screeningul biochimic prin triplu test: -fetoproteina, gonadotrofina
corionica umana si estrioloul conjugat efectuat in saptaminile 15-17 de sarcina.
REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT (PCR)
Principiu
PCR se bazeaza pe replicarea naturala semiconservativa a materialului genetic. ADN contine informatia
genetica completa pentru a specifica structura proteinelor unui organism. Informatia genetica este inscrisa in
secventa variabila a nucleotidelor (elementele din care sunt alcatuiti acizii nucleici).
Macromolecula de ADN este alcatuita din doua lanturi rasucite helicoidal si in acelasi sens in jurul unui ax
comun formand aspectul de dublu helix, ele nefiind identice ci complementare (Adeninei ii corespunde
Timina, iar Guaninei ii corespunde Citozina).
Aplicatii:
1.
Diagnosticul bolilor infectioase unele boli infectioase pot fi mai usor diagnosticate, iar altele sunt
detectabile doar prin PCR:
HIV este un retrovirus, informatia genetica fiind stocata in ARN; acesta este transcris de reverstranscriptaza in ADN ce se insera in materialul genetic uman al celulei gazda. Secventa tinta pe care o
urmarim (specifica numai acestui tip de virus) are o lungime de 150 de baze. Prezenta acestui ADN viral
intr-o proba de sange este un indicator fidel al infectiei HIV. Aceasta reactie permite realizarea unui
diagnostic precoce, testele curente pentru evidentierea HIV nedetectand prezenta virusului ci doar raspunsul
13

imun al organismului (prin detectarea anticorpilor); pana la aparitia anticorpilor pot trece saptamani sau luni
si in aceasta perioada testele conventionale raman negative;
In boala Lyme, boala ce incepe cu febra si dureri articulare, iar netratata poate duce la complicatii
(artrita cronica, afectare cardiaca, tulburari neurologice), testele imunologice ce evidentiaza Ac in fazele
timpurii ale bolii sunt neconcludente, iar terapia antibiotica precoce este decisiva pentru prevenirea
complicatiilor. Prin PCR, o secventa caracteristica a materialului genetic a agentului etiologic este
amplificata si identificata la debutul bolii;
In tuberculoza PCR poate inlocui cultivarea conventionala pe mediispeciale care dureaza 3-4
saptamani, rezultatul obtinandu-se in cateva ore.
Diagnosticul bolilor infectioase folosind tehnica PCR
Agentul patogen
Boala infectioasa
Infectii bacteriene Sistem respirator Bordetella pertusis
Tuse convulsiva Legionella pneumophila
Pneumonia legionarilor Mycobacterium tuberculosis
Tuberculoza
Mycoplasma
pneumonie
Pneumonie atipica Sfera genitala Chlamydia trachomatis Boala
inflamatorie
pelvina
Neisseria
gonorrhoeae Gonoree Treponema pallidumSifilis Sistemul nervos Haemophilus influenza Meningita
Neisseria meningitidisMeningita Tractul gastro-intestinal Helicobacter pylori Ulcer Salmonella typhi
Febra tifoida Shigella disenteriae
Dizenterie Sistemic Borellia burgdorfer Boala Lyme
Mycobacterium leprae
Lepra E. coli enterotoxic
Septicemie Infectii virale V. hepatitic B si C
Hepatita, carcinoame hepatice V. herpetic Herpes genital, inflamatii ale sist. limfatic
HIV 1 si 2
SIDA V. leucemiei cu celule T (HTLV 1 si 2)
Leucemie acuta cu celule T V. Papiloma
anumite tipuri
Carcinom cervical Infectii cu protozoare Entamoeba histolytica
Dizenterie
amoebiana Giardia lamblia Giardioza Plasmodium falciparum Malarie Infectii fungice Candida
albicans
Candidoza sistemica
2.
Diagnosticul bolilor ereditare
Bolile ereditare sunt cauzate de modificari ale materialului genetic. Importanta PCR in diagnosticul
defectelor genetice a fost relevata pentru prima oara in 1990 in diagnosticarea siclemiei, rezultatul
obtinindu-se in doar citeva ore fata de cele doua saptamini necesare testelor conventionale. Gena respectiva
este amplificata, apoi secventa de nucleotide din regiunea critica este comparata cu secventa
corespunzatoare din genele normale.
Un exemplu de aplicare a PCR in acest domeniu este diagnosticul prental al bolilor ereditare prin analiza
lichidului amniotic. Acest tip de diagnostic este restrans la grupele cu risc crescut: femei gravide peste 35 de
ani, familii in care au aparut deja modificari genetice ereditare.
Tehnica cultivarii si examinarii microscopice a celulelor fetale poate identifica numai acele defecte genetice
in care o secventa de ADN mare lipseste sau se repeta de mai multe ori. PCR poate diagnostica modificarile
ADN (absenta, schimbul sau repetarea unei perechi de baze) care nu pot fi vizualizate microscopic.
3.
Diagnosticul bolilor neoplazice
Diagnosticul precoce este deosebit de important in prognosticul si evolutia bolii. Majoritatea neoplaziilor
sunt descoperite in momentul constituirii tumorii, cel mai frecvent tardiv din punct de vedere al eficientei
terapiei. Anumite tipuri de cancer (plaman, san, colon) sau leucemii sunt adesea precedate de modificari ale
materialului genetic cu mult inainte de aparitia bolii (de exemplu, in cazul cancerului de colon, aceasta
perioada poate dura pana la zece ani). PCR descopera schimbarile materialului genetic care vor transforma o
celula normala intr-o celula maligna, inainte de aparitia tumorii sau a metastazelor.
4.
Transplantul de organe
Datorita sistemului imun capabil sa recunoasca non-selful, organele folosite pentru transplant pot fi deseori
rejectate de organismul rejector. Rolul principal in recunosterea celulelor straine revine complexelor HLA
(Human Leukocyte Antigens). Prin PCR se pot identifica secventele HLA specifice. Prin compararea
secventelor amplificate ale donorului si acceptorului se poate stabili compatibilitatea.
5.
Diagnosticul in medicina legala
Se analizeaza secventele de ADN cu variabilitate inalta (complexele HLA) sau secventele ADN prezente in
tot materialul genetic dar a caror lungime variaza de la o persoana la alta. Secventele de ADN ale unor
persoane necunoscute sunt comparate cu cele ale unor persoane cunoscute rezultatul avand precizie 100%.
14