schimb Tntre H+R si Na+s, afinitatea rasinii pentru cei doi
ioni fiind foarte apropiata iar reactia nu este completa.
Echilibrul care se stabileste este:
Utilizand o rasina de amoniu cuaternar sub forma de
hidroxid, are loc echilibrul:
Nici una din cele doua reactii nu este cantitativa pentru o
extractie cu un randament bun.
Daca Tnsa se folosesc simultan cele doua rasini Tn
prezenta solutiei de NaCI, echilibrele de mai sus sunt
complet depiasate spre dreapta datorita reactiei
suplimentare care are loc Tn solutie:
Se obtine astfel o apa foarte pura.
Tn domeniul farmaceutic cromatografia prin schimb ionic
are largi aplicatii Tn operable de purificare a
medicamentelor obtinute din sange sau prin tehnologie
recombinata (exemplu, factorul VIII recombinat).
In toxicologie schimbatorii de ioni sunt utilizati pentru
extractia bismutului din sangele total Tn prezenta acidului
clorhidric concentrat cand se formeaza cpmplecsi de tipul
BiCI"4, BiCI2"5 fixati pe rasini schimbatoare de anioni de
tipul IRACG400. Aceasta tehnica permite concentrarea
urmelor.
In terapeutica cromatografia cu schimbatori de ioni este o
tehnica exploatata deoarece colestiramina, rasina sintetica
bazica, se caracterizeaza printr-o afinitate crescuta pentru
acizii biliari pe care-i fixeaza sub forma de compusi
instabili.
214
E. Cromatografia cu perechi de ioni
Acest tip de cromatografie reprezinta o alternativa a
cromatografiei cu schimbatori de ioni. Multe dintre probleme pot
fi rezolvate combinand cele doua metode de cromatografiere,
cromatografia Tn faza inversS si cromatografia cu schimbatori
de ioni, dar cromatografia cu schimbatori de ioni nu este
eficienta pentru separarea amestecurilor acide, bazice sau
neutre fara asigurarea unor conditii speciale de lucru.
Probele ionice pot fi separate prin cromatografie Tn faza
inversa numai daca sunt formate din compusi neutri si pot
contine acizi sau baze slabe Tn forma1 nedisociata. Asigurarea
formei neionizate printr-un pH corespunzator poarta numele de
supresie de ioni. Cromatografia cu perechi de ioni este o
extindere a acestui principiu si consta Tn adaugarea unei
substante ionice la faza mobila ce formeaza o pereche de ioni
cu un component al probei de sarcina opusa:
Proba+ + Contraion" -> Perechea [ Proba+ Contraion" ]
Proba" + Contraion"" -» Perechea [ Proba" Contraion" ]
Perechea formats se comporta cromatografie ca o
molecula organica neionica si se poate folosi Tn acest caz
cromatografia cu faza inversa.
Mecanisme de separare
Sunt propuse doua mecanisme:
• repartitia perechilor de ioni Tntre doua faze lichide
nemiscibile (metoda neutilizata astazi)
• cromatografia de perechi de ioni pe faza sta|ionara
nepolara - Tn acest caz pentru explicarea mecanismului
fiind propuse mai multe modele:
215
 1. Modelul cu schimbator de ioni pe suprafata
Contraionul avand unul sau mai multe centre hidrofobe
este adsorbit de lanturile alchil ale fazei stationare devenind
echivalentu! unui schimbator de ion.
Solut
e ce ionii de semn contrar sunt atrasi.
Contraion Solut
Lanturi alchil
Figura 2.3.23. Model de schimb ionic in suprafata
Aproximativ 30% din lanturile alchil sunt blocate cu
contraion, restui sunt libere §i pot reactiona cu compu§ii neionici
din proba.
2. Modelul formarii perechilor de ioni fn faza mobila
Este cazul perechilor de ioni suficient de stabile pentru a
se fixa pe resturile alchil ale fazei stafionare.
Exemple:
- pentru acizi la pH > 7,5
RCOCr + A* ^RCOO'A*
- pentru aminele alifatice la pH < 6
216
3. Modelul formarii unui strat dublu electric la interfata
solid/lichid
Este modelul Gouy - Chapman - Ster, eel mai apropiat
de mecanismul real.
Adsorbtia contraionului pe faza stationara determma
aparitia unei diferente de potential Tntre suprafata solidului si
solutie.
Compozitja stratului lichid ionic Tn vecmatatea suprafetei
solide este perturbata, zona numindu-se strat difuz; ionii de
acelasi semn cu contraionii sunt respinsi de stratul difuz Tn timp
Aspects practice
Tn practice se adauga un alchilsulfonat Tn probe cationice
si fosfat de tetrabutilamoniu Tn probe anionice. O proba ce
contine componente anionice si cationice are unul din ioni
mascat de un contraion iar celalalt este supresat prin pH.
Avantajele cromatografiei cu perechi de ioni:
« se pot folosi sisteme cu faza inversa;
. pot fi separate amestecuri acide, bazice, neutre sau soiutii ce
contin molecule amfoterice;
• sele'ctivitatea este uneori influenza de contraion.
In continuare sunt mentionate cateva aspecte privind
practica Tn cromatografia cu perechi de ioni:
• Tehnica se folose§te atunci cand metodele cu faza inversa
sau cu supresie de ioni nu se pot aplica sau cand proba
contine atat componente anionice cat §i cationice.
• Ca faza mobila se folose§te un amestec de metanol - apa
care sa reduca problemele legate de solubilitatea
contraionului. Cand selectivitatea este mica se prefera
acetonitrilul.
. Este importanta alegerea corecta a contraionului,
preferandu-se specii cu catene scurte §i diferente structurale
217

mici. lonii cu catene lungi se folosesc cand este necesara o
retentie mare.
• Cand se lucreaza cu gradient trebuie verificata solubilitatea
contraionului pentru toate raporturile fazei mobile.
® pH-ul fazei mobile trebuie ales asa meat sa asigure o
ionizare maxima a probei. In acest caz trebuie sa se ia Tn
considerare stabilitatea silicagelului la pH-ul folosit.
« In cromatografia cu faza inversa se prefera pentru un test
initial monomerii C-ia sau Ca.
• Faza mobila sa fie degazata Tnainte de adaugarea
contraionului pentru a preveni spumarea.
® Concentratia ionului sa fie inifial 0,01 M pentru cei cu catena
scurta si 0,005 M pentru cei cu catene lungi. In cazul elutiei
cu gradient, daca este necesara folosirea unui tampon,
acesta se adauga Tn cantitati egale Tn apa si metanol
(aproximativ 0,001 - 0,0005 M).
• Pentru a preveni precipitarea sarurilor, este necesar ca !a
Tncheierea lucrului sa se spele coloana §i tuburile de legatura
iar daca aparatul functioneaza peste noapte, debitui poate fi
redus la 3-5 ml/h.
« Trebuie sa se verifice absorbtia Tn ultraviolet ( UV ) a
contraionului.
• Cresterea temperaturii scade factorul de capacitate k'. La
temperaturi mai mari de 60 °C contraionii de tip +N(C4H9)4
prezinta riscul degradarii.
• Influenta fortei ionice: cresterea fortei ionice a eluantului
diminueaza factorul de capacitate k' a solutului printr-un
proces de competitie Tntre contraion si ionii prezenti Tn faza
mobila (de exemplu, ionii fosfat utilizati pentru ajustarea pH-
ului), ceea ce scade eficacitatea separarii.
Aplicatii
Multe medicamente pot fi analizate pe coloana de silice
grefata C18 prin cromatografie cu formare de perechi de ioni
utilizand o faza eluanta pe baza de rnetanol. Pot fi
cromatografiate astfel numeroase substante medicamentoase:
- acizi tari sau slabi Tn prezenta de tetrabutilamoniu; exemple:
acid acetilsalicilic, indometacin, acid folic, metotrexat, etc.
218
^m
- baze tari sau slabe Tn prezenta de alchilsulfonati; exernple:
codeina, morfina, clorfeniramina, efedrina, clorura de
benzalconiu, metadonS.
F. Cromatografia de ion'i
Cu cateva excepfii ionii anorganici pot fi analizati prin
cromatografie de lichide. in prezent exista numeroase metode
de separare §i detectie a ionilor anorganici, printre acestea
numarandu-se §i cromatografiile cu:
« detectie conductometrica §i supresie chimica ( cromatografie
cu coloana dubla);
• detectie conductometrica §i supresie electronica;
«B detectie UV indirecta.
Se mai folosesc detectia Tn UV si detectia prin indice de
refractie.
Prin aceste tipuri de cromatografii pot fi studiati numeros. i
ioni:
• cloruri, nitrati, sulfa|i, carbohidrati din bauturi §i ape;
• nitrati Tn alimente;
« fluoruri Tn pasta de dinti;
e ionul amoniu, potasiu, nitrat §i fosfat Tn sol §i Tngra§aminte;
« sodiu §i potasiu Tn fluidele biologice §i solutiile perfuzabile.
Cromatografia de ioni nu este Tnsa restrictiva, putandu-
se detecta, de exemplu, si acizii organici din sucurile de fructe.
Acest tip de separare a devenit astfel o metoda importanta de
studiu, reprezentand de fapt un caz special de cromatografie cu
schirnbator de ioni dar echipamentul folosit este diferit. in figura
2.3.24. este schitat un sistem cromatografic cu coloana dubla.
Coloana de supresie reduce drastic conductivitatea fazei ce
vine din coloana de separare inversand sarcina eluentului ( de
exemplu bicarbonatul este transformat Tn acid carbonic).
219
 Separarea Separarea
cationllor anlonilor
Ednslfill
Cromatografiaprin excluziune sterica se bazeaza pe un
proces de repartitie lichid-lichid Tn care moleculele
Tampon
HCI, HNOj 1CPM NaHC03.Na2C03, NaOH componen^ilor de separat sunt retinute Tn functie de forma si
marimea lor.
Ca suport se utilizeaza o serie de substante granulare,
microporoase, care permit difuzia moleculelor Tn porii acestora.
Cu cat moleculele sunt mai mici, ele difuzeaza mai u§or Tn porii
gelului si sunt retinute un timp mai Tndelungat pe coloana, Tn
timp ce moleculele mai mari raman Tn majoritatea timpului Tn
metale alcaline, metale anioni anorganic!, acizi
alcalino-pamantoase,
Proba
organici, fosfati organic!
spatiile interstitiale dintre particulele de gel, fiind eluate primele.
amoniu, amirie Desi materialele suport cu proprieta|i care permit
separarea substantelor pe aceste principii (geluri de amidon, de
agar, de poliacrilamida, etc.) au fost cunoscute de multa vreme,
Tn cazul acestora peste efectui de sita moleculara se suprapun
Tntotdeauna §i alte fenomene, ca adsorbtia, repartitia si
Schimbator de
Coioana schimbul ionic.
cation!
de Schimbator de anioni
(capacitate scSzuta)
Descoperirea a doua clase principale de materiale
separare
(capacitate scazuta) cromatografice, Tn care separarea are loc Tn mare masura si
uneori exclusiv pe baza marimii moleculei, a dus la dezvoltarea
cromatografiei prin excluziune sterica. Acestea sunt materiale
de tip Sephadex - geluri dextranice reticulate care se umfla Tn
mediul apos, si geluri polistirenice cu grad Tnalt de reticulare,
Schimbator de anioni Schimbator de cationi folosite Tn special Tn solven^i organici. Ulterior s-au descoperit
(capacitate mare)
Ccloana (capacitate'mare) alte materiaie, Tnsa trebuie remarcat faptul ca toate gelurile de
Ra§ina-OH~-H-rcr-» de Ra§ina-H' + Na*CO3"
Ra§ina-CI" + H2O
supresie —> natura organica sunt sensibile la temperatura ridicata, la uscare
Ra?in5-Na* + H2C03 si la o presiune ridicata pe coloana. Dupa schimbarea presiunii
sau temperaturii este necesara, de obicei, o recalibrare.
Mecanismul prin care are loc separarea Tn Cromatografia
prin excluziune sterica nu este suficient elucidat. Daca se
considera un material poros ce umple coloana cromatografica,
moleculele ce nu pot patrunde Tn pori se pot deplasa Tn spatiul
dintre particule si devin excluse, ele fiind eluate primele. Pe de
alta parte, daca moleculele sunt suficient de mici, ele
Figura 2.3.24. Cromatografia de ioni cu coloana de supresie penetreaza porii fazei stationare. In pori exista Tnsa faza mobila
stagnanta, particulele putand parasi aceste zone numai prin
difuzie si, ca rezultat, se vor deplasa mult mai Tncet decat
221
220
 T-l
moleculele excluse. La detector ajung mai Tntai moleculele
excluse §i la sfarsit moleculele retinute de pori (figura 2.3.25). Cu cat o molecula este mai mica, cu atat creste volumul
Semnal de por accesibil si, deci, timpul petrecutm coloana:
— >r ~ Molecula nujaatrunde Primul pic
Timpul de aparitie a picului
V este o funcfie de raza depinde de marimea
Tmolec ^ Tpor molecule! molecule!
V este egal cu volumul Picui final
rmolec fpor porului

Ca importanta, acest tip de cromatografie permite

Volumul de soh/ent
Ffgura 2.3.25. Ordinea de elutie in cromatografia de exciuziune
sterica: 1. molecula exclusa, 2. rno!ecu!a de marime mica, 3.
solvent
separarea unor cantitaVi mari de proba deoarece procesul
cromatografie nu presupune stabilirea unui echilibru. Este Tnsa
limitata, doua molecule putand fi separate daca exista o
diferenta de 10% Tntre masele moleculare.

Daca se considera ca porul este de forma cilindrica cu Caracteristici ale fazei stationare
raza rpor', atunci volumul de por accesibil V pentru o molecula - Diametrul porilor - este Tn functie de gradul de reticulare
cu raza rmo/gc este dat de relatia: a gelului care corespunde proportiei de substrat Tn
ansamblul fazei stationare. Marimea porilor
o conditioneaza volumul fazei stationare si domeniul de
= r
* ( por ~ rmolec) ' u ' 0 ~ rmolec) aplicare a metodei.
- Capacitatea de umflare - este cantitatea de solvent
unde I este lungimea porului (figura 2.3.26). absorbita pe gram de gel uscat.
Exemple:
Sephadex G10 -> 1 g gel uscat absoarbe 1 ml apa
Sephadex G 200 -»1 g absoarbe 20 ml apa
- Forma sj marimea particulelor substratului - particulele
substratului trebuie sa fie mici, de forma sferica, cu o
granulometrie care variaza de la 40 la 300 u,m Tn
cromatografia clasica si de la 20 la 80 (am Tn cea de
Tnalta performanta.
- Consistenta - variaza Tn functie de natura si gradul de
reticulare a gelurilor. Se disting:
- xerogeluri - sunt geluri semirigide
- aerogeluri - sunt geiuri rigide, utilizate Tn special
cand se lucreaza la debit mare si
Figura 2.3.28. SVIodekil porului de forma cilindrica Tn sub presiune
cromatografia prin exciuziune sterica (V - volumul ramas liber)
222 223

L
 - Gradul de reticulare - gelurile nu trebuie sa reactioneze
cu faza dispersanta.
Xerogeluri
Potfi:
« geluri moi
• geluri semirigide
Tn functie gradul de reticulare.
Gelurile moi sunt utilizate eel mai frecvent cu solutii
apoase (cu exceptia polistirenilor care sunt hidrofobi). Aceste
geluri se utilizeaza la presiuni (< 2 bari) si debite mici.
Gelurile semirigide au un grad ridicat de reticulare ceea
ce le confera proprietati diferite de ale gelurilor moi, putand fi
utilizate la debite mari pentru ca suporta presiuni ridicate.
Natura aromatica hidrofoba a acestor geluri permite
lucrul cu faze mobile de solvent! organic! - permeabilitate pe
gel.
Exemple:
1. Geluri de dextran = Sephadex
Au structure de poliozida formata din 90% molecule de
glucoza legate 1,6 si 10% molecule de glucoza legate 1,3. Sunt
insolubile Tn apa dar sunt hidrofile, ele se umfla Tn mediu apos
si Tn mediu de solventi de tipul dimetilsulfoxidului.
Prin acetilarea sau alchilarea gruparilor hidroxilice se pot
obtine geluri gonflabile Tn mediu organic (hidroxipropil-
Sephadex). Permit separarea substantelor cu masa moleculara
M = 700 000 - 800 000 daltoni.
2. Geluri de poliacrilamida sau biogeluri
Se prezinta sub forma de perle de forma regulata,
rezistente Tn medii acide sau bazice. Permit separarea
moleculelor cu M = 200 000 - 400 000 daltoni.
3. Geluri de agaroza sau sefaroza
Agar-agarul sau geloza este o poiizaharida extrasa din
alge care are proprietatea de a se dizolva Tn apa calda §i de a
forma geluri prin racire. Confine:
- agaropectina - cu proprietati de schimbator de
ioni sau adsorbtive (datorita prezentei gruparilor carboxilice sau
sulfurice)
224
- agaroza - substanta neionica, poiizaharida
lineara formata din D-galctoza §i 3,6-anhidro-L-galactoza legate
prin legaturi de hidrogen
Acest tip de gel permite separarea moleculelor cu masa
moleculara M = 10 000 - 150 • 106 daltoni.
4. Geluri de polivinil (fractogel)
Matricea acestor geluri este constituita din polimeri
vinilici hidrofili §i se caracterizeaza printr-un grad malt de
stabilitate chimica §i mecanica. Masa moleculara a
substanteior ce pot fi separate utilizand aceste geluri
corespunde intervalului 102 - 5 • 107 daltoni.
Aerogeluri
Sunt materiale rigide formate din sticla sau silice
poroasa, eventual dezactivata prin silanizarea gruparilor OH
pentru eliminarea fenomenului de adsorbfie.
Aerogelurile au o utilizare practica Tn HPLC, ele nu se
umfla Tn contact cu faza dispersanta, domeniul de utilizare fiind
3 - 1 0 4 < M < 2 - 1 0 7 daltoni. Permit obtinerea unor rezolu^ii mai
mari decat Tn cazul gelurilor descrise anterior.
Aspecte practice
Alegerea faze/ stajionare
Se face Tn functie de masa molecular^ a substantelor
supuse separarii.
Alegerea faze/ mobile
Faza mobila trebuie sa Tndepiineasca anumite conditii:
- dizolvarea probei
- impregnarea §i gonflarea geluiui
- compatibilitatea cu sistemul de detectie
- sa nu distruga faza stationara
Tehnicile de cromatografiere prin excluziune
- cromatografie pe strat. subtire
- cromatografie de elutie pe coloana
- cromatografie cu reciciare
225
 !og(M)i
1. etalonarea directa a coloanei cromatografice cu
etaloane de masa molara cunoscuta;
2. etalonarea indirecta plecand de la determinarea
volumului hidrodinamic.
In acest caz se pleaca de la definirea vascozita^ii
intrinseci a unei solutii de polimer:

r I _ lim "^solvent
W-c->(

[TI] pentru un polimer linear, Tntr-un solvent dat, se define§te

conform relatiei Mark-Houwink:

Volum de elutie
unde k' §i a sunt constante pentru un polimer, un solvent §i o
temperatura data.
Figura 2.3.27. Aiegerea fazei stationare Aceasta metoda de etalonare se bazeaza pe principiul
conform caruia moleculele se separa Tn functie de volumul lor
hidrodinamic care este produsul dintre masa molara M si
Apiicatii vascozitatea intrinseca [TI].
Cromatografia prin excluziune Tsi gaseste largi aplicatii Tn Reprezentand grafic log M[TI] Tn functie de volumul de
procesele de separare a polimerilor sau a macromolecuielor: retentie VR se obfine curba universala de etalonare. De pe
- Separarea moleculeior mici de macromolecuie. aceasta curba, avand VR experimental si cunoscand T\ se poate
Exemplu: purificarea proteinelor dupa marcare cu !131. deduce M.
- Analiza unui amestec de macromolecuie. In domeniul farmaceutic aceasta Tsi gaseste
Exemple: aplicabilitatea la determinarea masei molare a
« purificarea fractiunilor plasmatice pentru prepararea de imunoglobulinelor IgG existente sub diverse forme farmaceutice
medicamente sau reactivi de diagnostic; (Tn presupunerea ca aproximativ 90% din IgG sunt prezente
« analiza si studiul stabilitatii materialelor plastice sub forma de monomeri si numai 10% sub forma de dimeri).
(ambalaje).
- Separarea celulelor (limfocite izolate de monocite prin H. Cromatografia de afinitate
cromatografie pe gel de dextran).
- Fractionarea moleculeior mici: La baza procesului de afinitate stau interactiuni de
© analiza peptidelor; natura biochimica:
© analiza colorantilor Tn industria alimentara. « antigen-anticorp;
- Deterrninarea masei moieculare - se poate realiza Tn doua • enzime-inhibitor sau substrat;
moduri: • hormon-transportor sau receptor.
227
226

matrice ligand liganci Imobilteat
ligand imobilizat proba complex
Figura 2.3.28. Principiu! cromatografiei de afinitate
Caracteristica cea mai importanta a acesteia consta Tn
faptul ca este nevoie sa existe, pe langa interactiuni
electrostatice, o orientare spatiala favorabila. Ligandul,
componenta legata pe suport, leaga reversibil componenta din
solutie (figura 2.3.28). Daca Tn solutie mai exista componente
care nu se potrivesc ligandului, acestea nu vorfi adsorbite.
Dupa ce s-a produs fixarea probei, elutia acesteia se
face cu o solutie ce contine un produs cu o afinitate mai mare
pentru iigand. Procesui de afinitate fiind de natura biochimica
se produce Tntr-un mediu specific si, deci, va fi afectat de
utilizarea unui gradient de concentratie sau pH. Ca liganzi se
folosesc anti-imunoglobulina G, lectine, Cibacrom Blue, etc.
Apiicatii
Cromatografia de afinitate este larg utilizata in procesele
de purificare a medicamentelor de origine biotehnologica sau a
celor derivate din sange.
228
2.3.2. Grama
2.3.2.1 Principiu §i tehnica
Interesul crescut manifestat Tncepand cu anii '80 ai
secolului trecut pentru Cromatografia de lichide se datoreaza
nevoiior tot mai mari de a se analiza cornpus.! cu masa
moleculara mare, instabili termic, sau compu§i biologici, fara
efectuarea unor reactii auxiliare.
Principalele progrese au fost realizate Tn domeniul
materialelor folosite ca umpluturi si sisternelor de transport al
eluentului sub presiune.
In Cromatografia de lichide de Tnaita performanta pe
coloana sunt necesare presiuni mari pentru a vehicula cu debite
corespunzatoare faza mobila iichida prin faza stationara a caret
granuiatie este mica (3-10 urn).
Tn principiu un cromatograf de lichide este format din
(figura 2.3.29):
• pom pa
® injector
« coloana cromatografica cu sau fara termostat
« detector
* sistern de achizitie si prelucrare B datelor (computer)
Toate eiernentele sistemului cromatografic pot fi
actionate prin intermediu! computerului. Daca se face
cromatografie preparativa, se utilizeaza un colector de fractiuni
iar Tn unele cazuri, din motive economice, faza mobila se
recircula. Acest iucru nu afecteaza analiza urmatoare deoarece,
detectoru! compenseaza !a Tnceputul analizei semnalul dat de
faza mobila.
229
 coloana detector interfata ete
comunicare
sistem comanda
HPLC §i prelucrare
date
,1,1 1*—?
1 general, simple si ieftine si se folosesc cSnd pemneabilitatea
I f aza mobila (eluent)
Figura 2.3,20. Schema w.r»ul cromatograf de lichide
A. Pompele
Pompele utilizate Tn cromatografia de lichide de Tnalta
performanta sunt capabile sa produca presiuni Tnalte deoarece
faza mobila este fortata sa treaca prin patul cromatografic
alcatuit din particule mici ce opun o rezistenta mare la curgere.
Pentru accelerarea transportului se utilizau la Tnceput
trompa de vid sau pompele peristaltice. Pompele moderne sunt
dispozitive extrem de pretentioase, atat din punct de vedere al
confectionarii cat §i al utilizarii. Exista douS tipuri principale de
pompe:
• cu presiune constants
e cu debit constant care pot fi:
1. pompe cu presiune aplicata prin intermediul unei
membrane sau ai unui amplificator de presiune.
2. pompe cu piston cu o singura cursa (tip seringa).
3. pompe aspiratoare-respingatoare cu piston.
4. pompe cu piston cu bataie scurta.
230
Pompe de presiune constants
Pompele ce functioneaza cu presiune constants sunt, Tn
coloanei, temperature §i vascozitatea eluentului sunt
mentinute constante. Sunt lipsite de pulsatii si debitul poate
fi variat cu usurinta, dar prezinta dezavantajul ca prin
aplicarea directa a presiunii gazului inert are loc si
dizolvarea acestuia Tn eluent. Pe masurS ce presiunea din
coloana scade, buiele de gaz dizolvate se vor degaja sub
forma de bule Tn interiorul coioanei sau Tn detector. Aceste
pornpe lucreaza la presiuni mici si nu pot fi apiicate
gradiente de elutie.
Pompe cu debit constant
1. Un piston este deplasat rapid cu ajutorul unui disc excentric,
determinand Tmpingerea unui ulei hidraulic spre o
membrana. Compresia membrane! mic§oreaza volumul din
spatiui de trecere a eiuentului, fortandu-l sa Tnainteze.
Membrana este confectionata din otei. Regimul de
functionare a pompei este discontinuu dar pompele moderne
au Tncorporate un regulator de debit ce amelioreaza pulsafia
eluentuiui.
2. Aceste pompe sunt folosite, de asemenea, Tn multe
cromatografe de lichide, avantajul lor constand Tn faptul ca
pot livra un debit constant fara pulsatii. Un exemplu este
pornpa Varian de 350 atm care are o capacitate de 250 ml si
un debit reglabil Tntre 0-200 ml/h. Pompa asigura transportul
eluentuiui cu o precizie de de ±1% iar reproductibilitatea
vitezei de curgere este de ±0.1%. Fluctuatiile prin pulsatie
sau alte deviatii sunt mai mici de ±0.1% si sunt nedetectabile
chiar de detectorii cei mai sensibili la debit. Pompele din
aceasta categorie sunt Tnsa scumpe dar sunt foarte indicate
Tn cazul utilizarii gradientilor.
3. Pompeie aspiratoare-respingatoare cu piston sau diafragma
desi prezinta avantaj fata de pompele cu presiune
231

constanta, in sensul ca furnizeaza un debit constant si
reproductibil, introduc pulsatii care sunt simtite de detectorii
sensibili cu volurn mic. De aceea utilizarea lor este
conditionatS de foiosirea unui dispozitiv de atenuare a
pulsatiilor.
4. In comparable cu pompele cu membrana, pompele cu piston
si bataie scurta deplaseaza direct solventul, fara ajutorul
unui lichid sau membrana. Pistonul trebuie sa fie
confectionat din safir si sa fie rezistent la coroziune chirnica
sau rnecanica. Bataia scurta a acestor pompe este asigurata
de rotatia asimetrica a unei came. Profilul debitului obtinut
cu o astfel de pompa este redat Tn figura 2.3.30.
Debit
Timp
0.2s
Figura 2.3.30. Profilul debitului obtinut cu o pompa cu bataie
scurta
Elutia se poate face Tn regim:
« izocratic - compozitia sj debitu! fazei mobile sunt mentinute
constante pe tot timpul Tnregistrarii cromatogramei
• cu gradient - compozitia si/sau debitu! (mai rar) fazei mobile
variaza Tn timpul Tnregistrarii cromatogramei; Tn acest caz
trebuie sa se asigure, Tnainte de o noua injectare, un interval
de tirnp necesar reechiiibrarii coloanei ia compozitia initiala;
pompele reaiizeaza elutia cu gradient prin amestecarea
componenteior fazei mobile la presiune joasa (se folose§te o
232
singura pompa ce asigura si amesteca proportiile necesare
din fiecare solvent aflat m rezervoare diferite) sau la
presiune Tnalta (este nevoie de eel putin 2 pompe si un
mixer ce reaiizeaza amestecarea sub presiune)
B.jn'iectorul
Importanta calitatilor acestei componente a sistemului
cromatografic rezulta din constatarile experimentale potrivit
carora se poate obtine o separare necorespunzatoare, chiar §i
cu o coioana foarte buna, daca injectarea nu s-a facut corect. O
injectare corecta se face atunci cand nu se introduce aer Tn
spatiul de injectare.
Exista diferite tipuri de injectoare:
» injector cu sept;
• sistem de injectie fara sept;
« injector cu bucla - proba este introdusa mai Tntai Tntr-un
capiiar de unde este preluata de faza mobila;
» autoinjector ~ injectarea probelor se face programat; fiecare
proba este introdusa dintr-o fiola specials asezata Tntr-un
suport special.
C. Termostatul coloanei
De foarte multe ori este necesara menVmerea unei
temperaturi Tn coioana cromatografica diferita de temperatura
ambianta, temperatura care este asigurata cu ajutorul unui
termostat Tn care pot fi introduse simultan mai multe coloane.
DJDetectorui
Detectoru! reprezinta acea parte a cromatografului
capabila sa recunoasca substanta ce ajunge la nivelul ei,
Schirnbarea Tn compozitia fazei mobile este transformata Tn
semnal electric ce este transmis la sistemul de prelucrare a
datelor.
Un detector idea! trebuie:
• sa aiba aceeasi sensibilitate pentru toate componentele;
233
 sa nu fie influentat de variatia temperaturii sau de
schimbarile Tn compozitia fazei mobile;
sa detecteze cantitati foarte mici de proba;
sa aiba un raspuns rapid pentru a asigura Tnregistrarea
componentelor ce tree rapid prin celula;
sa fie usor de manipulat §i robust.
Un detector este caracterizat de mai multi parametri:
Seiectsvitatea descrie acea caracteristica a detectorilor de a
sesiza orice schimbare Tn proprietatile eluentului ce ajunge
la detector.
Specificitatea detectoruiui se refera la capacitatea de a
sesiza discriminant analitii din proba de analizat, capacitate
bazata pe anumite proprietafi fizico-chimice ale acestora (de
exemplu, absorbtia radiatiei cu o anumita Iungime de unda).
SensibiMtatea de concentrate §1 sensibiiifafea mas lea
Detectorii sensibili fa concentrate produc un semnal S
proportional cu concentratia c a analitului Tn eluent:
S » c [g/ml]
Detector!f sensibiii la variatia fluxuSui de masa produc un
semnal S proportional cu fluxul de masa (numarul de moli n
de substanta ce ajung Tn detector Tn unitatea de timp At):
At s
Cu exceptia detectorilor electrochimic, de conductivitate si
fotoconductivitate, toti ceilalti sunt caracterizati de
sensibiHtatea de concentratie.
Sensibilitatea unui detector nu trebuie sa fie confundata cu
Simita de detectie.
ZgornotuS este variatia liniei de baza atunci cand prin
detector trece nurnai faza mobila. Ceie mai importante
cauze ale cresterii nedorite a acestei variatii sunt fiuctuatia
temperaturii, existenta bulelor de gaz dizolvate Tn faza
mobila, etc.
234
Limita de detectie a unui detector este cea mai mica
cantitate de analit care da un semnal egal cu de 2-3 ori
semnalul zgomotului de fond.
Liniaritatea. Un detector ideal prezinta o dependenta liniara
semnal-concentrafie (figura 2.3.31). Domeniul de liniaritate
pentru un detector UV este 1:10000 (de exemplu, daca
limita superioara' de concentrate este 5x10"* g/ml, limita
inferioara corespunzatoare este 5x10"8 g/ml).
ideal
Semnal
limita de detectie
zgomot
Concentratie
Figura 2.3,31. Domaniul de liniaritate a! detectoruiui
Constanta de timp T masoara cat de rapid poate Tnregistra
detectorul un pic. Constanta de timp poate fi definite ca
timpul minim necesar unui sistem de a Tnregistra 63% din
marimea picului (adesea acest procent este dat ca fiind
98%). Constanta de timp nu trebuie sa fie mai mare de 0,3 s
pentru detectarea picurilor foarte ascutite §i nu trebuie sa
depa§easca 0,1 s pentru cromatografia de lichide foarte
rapid a.
Volumul celuiei detectoruiui trebuie sa aiba o influenta
minima asupra iatimii picuiui. Volumui standard este de 8 p.l.
Se recomanda, de asemenea, ca Tn cazul utilizarii unor
substante foarte polare, ferestrele celuiei sa fie tratate Tn
prealabil cu acestea.
235
 umpluturiior cu granulatie fina se explica prin aceea ca distanta
Tipuri de detectori foiositi: pe care se produce o amestecare radiala este mica. Exista ia
• detectori de absorbtie in UV-VIS, IR; ora actuala coioane cu diametre cuprinse Tntre 50 si 75 nm ale
® detector de fiuorescenta; caror eficienta le fac candidatele viitorului Tn HPLC (consum mic
• detector electrochimic; de solvent!, necesita volume mici de proba, cre§terea numarului
e spectrometru de masa; de talere teoretice, etc.)
• detector de indice de refractie;
« detector de conductivitate; Lungimea coloanelor
• detector de radioactivitate; Variaza Tntre 5 §i 25 cm la coloaneie HPLC uzuale,
• de dicroism circular diametrul granuielor fazei stationare fiind mai mic de 10 j.im.
• de rezonanta rnagnetica nucieara etc.
Precoloanele sau coloaneie de garda
Cei mai des utilizati detectori Tn sistemele cromatografice
HPLC sunt detectorii UV-VIS (la lungime de unda fixa, variabila Sunt destinate protectiei coioanei de constituent!!
sau cu bareta de diode), de fiuorescenta, spectrometre de probelor ce se retin puternic §i se introduc de obicei Tntre
masa si detectorul electrochimic. injector si coloana. Au dimensiuni reduse §i se Tnlocuiesc atunci
cand performanta separarii este afectata. Umpiutura unor astfel
E. Coioane si faze stationare ?n_HP_LC de coioane este, Tn general, similara umpluturii coloanei
Cele mai multe coioane Tn HPLC sunt confectionate din anaiitice.
otel cu crom-nichel-molibden, rezistent la presiunile de lucru din
sistemie HPLC §i inert chimic. Exista si coioane din stida dar si raze/e stationare
din alte materiale cum ar fi polietilena sau tantaiui. La capetele Dintre urnpluturi cea mai utilizata este silicageiul:
tuburilor, materialul de umplere a coloanei esie iimitat de doua
opritoare identice sau diferite care au rolul de a evita
modificarea coloanei Tn timpul operarii prin antrenarea Tn \ .OH n
_
Si
exterior a granuielor de umpiutura. In HPLC se folosesc ca \ .0, ,0-Si n—Si
Si si O
opritoare foite metalice sau din material plastic (Tn genera! 7x 9 •' / n
teflon sau polietilena), de porozitate mai mica sau egala cu a HO o- o-su±o-sr° ,
granuielor de umpiutura. OH
OH
V/ I i

Diametral coloanelor Figura 2,3,32. Structure ehimiea a silicageiulu:

Desi pot fi utilizate si coioane cu diametre similare celor
din cromatografia ciasica, s-a dovedit ca cele mai bune
rez.ultate se obtin atunci cand se folosesc coioane cu diametre
de 2-5 rnm (ce! mai adesea 4 si 4,6 mrn). Coloaneie cu
diametru! mai mare se foiosesc Tn scop preparativ. Eficienta
marita a coloaneior capilare (diametrul < 1 mm) Tn cazui
236
Se obtine prin hidroliza totaia a siiicatuiui de sodiu,
tetraalcoxisiianuiui, urmata de condensare pentru a obtine acid
poiisiiicic si deshidratare. Acest tip de silicagel are forma
neregulata.
237
 Silicagelul de forma sferica se obtine, de exemplu, din 2.3.2.2 Alegerea unei metode HPLC
tetraetoxisilan prin transformare Tn polietoxisilan lichid si acesta
este apoi emulsionat Tn amestec etanol-apa. Alegerea unei metode HPLC se face tinand cont de
Gruparile OH de pe suprafata pot fi modificate chimic, masa moleculara sj solubilitatea analitului, urmand schema
a§a cum s-a aratat Tn capitolele anterioare, pentru a da faze
urmatoare:
stationare cu proprietati specifice. Figura 2.3.33 ilustreaza
cateva tipuri de modificari ale suprafetelor de silicagel.
r—
Solubil in
Q-Si-OH + HO-R --> Q-Si-OR + H2O (la 150-250°C, 3-8 h)
D-Si-OH + SOCI2 -> D-Si-CI + SO2 + HCI
I hexan

Solubil in Solubil Tn
D-Si-CI + H2N-R -> D-Si-NH-R + HCI solvent! metanol,
organic! ! metanol/ Faza Inversa Faze legate C18, C8,
mediu (legata) fenil, C4, CN
apa
anhidru i 4 Umplutura hidrofoba cu
1 Solubil Tn Molecule mici prin
D-Si-OH + CI-Si(CH3)2-R D-Si-0-Si(CH3)2-R tetrahidro- GPC* pori mici
AnaHtcu | furan
mediu
anhidru
M<2000 Solubil
tetrahidra-
Tn
cia c8
Molecule mici prin Umplutura hidrofoba cu

**™[igjs ' '

GPC* pori mici
D-Si-OH + CI-SiRz-CI D-Si-O-SiR2 -Cl + HCI 1 1 furan
. f
Neionic
H2O

;
Solubil Tn
apa
1-—
?**?*, xTS'-a
(control .omzare) '(^'n'trol|onizare)'
Q-Si-O-SiR2 -OH + HCI Ionic FazS inversa cu Faze legate C18, C8,
aerechi de ioni fenil, C4, CN, NHZ
Schimbatori de ioni
H20 i J
Faze chirale
Q-Si-0-SiR2 -OH + CI-SiR'a -Cl -> D-Si-O-SiR2 -O-(SiR'2 -O)n -H Analit chiral Chiral
Solubil in Umplutura polimericS
solvent! GPC* j macroporosa
inici Umplutura hidrofila cu
Filtrare pe gel domeniu de fract,ionare
Fazele modificate chimic se folosesc §i Tn cromatografia ' adecvat

de afinitate, cu schimbator de ioni sau cromatografia chiraia. Analit cu Schimb ionic I %™££ ™ «"
M > 2000 Solubil in
Alte tipuri de umpluturi:
apa
• stiren-divinilbenzen; ^
legata — S«..N5S
mari)
• alumina; Hir.. I Faze legate fenil, C5,
"_ I C4, C3, C5OH
« silicat de magneziu; hydrophobic chromatography
*GPC - gel-permeation chromatography, "HIC
« gelul de hidroximetacrilat;
• hidroxilapatita;
• agaroza;
e grafit poros.

239
238

2.3.2.3 Catena considerente privind dezvoltarea
unei metode HPLC
In dezvoltarea unei metode cromatografice de analiza,
este esenfial studiul bibliografic ai unor metode de separare a
compu§ilor cu structure similara cu cea a substantelor luate Tn
lucru, daca substantele nu au mai fost caracterizate
cromatografic sau daca publicatiile ce se refera direct la
compusii de interes, necesita o dbtare tehnica neaccesibila la
momentul respectiv. Informatia primita este utila pentru
alegerea sistemului de detectie si a metodei de pregatire a
probei pentru analiza. Pe de alts parte, o metoda HPLC
publicata se dovedeste deseori nereproductibila Tn practica, fie
datorita imposibilitatii realizarii aceiorasi conditii tehnice, fie a
diferenteior ce pot sa existe Tntre coloanele cromatografice cu
aceeasi umplutura sj aceleasi dimensiuni, chiar daca provin de
la aceeasi firma. Este de preferat, deci, sa se Tncerce punerea
la punct a unei metode noi, pornind de la cateva principii de
baza Tn cromatografia de lichide Tn faza inversata.
In acest sens, un prim pas consta Tn cunoasterea
structurii chimice sau a naturii componentilor ce urmeaza a fi
separati din proba. Informatiile legate de proba sunt utile pentru
a putea alege corect modu! de prelucrare a acesteia §i sistemul
de detectie si a evita eventualele probleme care pot sa apara Tn
timpul punerii la punct a metodei. in uneie cazuri este posibil sa
se faca optimizarea separarii cromatografice a unor substante
prin modelare pe calculator daca sistemul cromatografic este
automatizat si daca elementele experimental sunt alese cu
atentie. Pentru cele mai multe probe, Tnsa, aceasta posibilitate
este practic imposibila.
Dintre principiile care pot sta la baza punerii la punct a
unei separari Tn cromatografia de iichide putem aminti:
• modificarea acelor conditii experimentale care pot schimba
Tn mod apreciabil seiectivitatea
® evitarea acelor probleme care afecteaza robustefea metodei
« reducerea numarului de verificari printr-o gandire
practica sau simulare pe calculator
240
« selectarea acelor conditii experimentale care pot fi valabile
pentru orice proba "normala"
• evitarea alegerii unor conditii experimentale neeconomice
sau dificile (schimbarea coioanei, utilizarea unor amestecuri
complicate de solvent!, etc.)
In general, atunci cand se doreste utilizarea metodei
HPLC Tn faza inversa se porneste de la cateva conditii initiate
care sunt grupate Tn tabelul 2.3.4.
Tabeiul 2.3.4. Conditii initiate de la care se poate porni Tn
dezvoltarea unei metode HPLC in faza inversa
Umplutura coioanei C8 sau C18
Dimensiunile 150 x 4,6 mm, particule de 5 sau 75 x 4,6
coioanei mm, particule de 3,5 ^m
Debitui fazei mobile 2,0 ml/min
acetonitril - apa, pentru probe neutre, sau
acetonitril - tampon, pentru probe ionice; ca
tampon 25 - 50 mM fosfat de potasiu la pH 2 -
Faza rnobila 3 (este de preferat un pH mai scazut, daca
coloana este stabila); se recomanda pentru
tatonari o elutie cu un gradient de 5 - 10%
acetonitri! Tn 60 de minute.
Temperatura 35 sau 40°C
IVlarimea probei <50 nl; 50-100
Modui de manipulare a variabilelor experimentale
depinde de abilitatea, pregatirea §i experienta celui care
realizeaza experimentul, conditiile tehnice de care dispune si,
nu Tn ultimul rand, de scopul determinarilor.
In figura urmatoare este schematizata separarea
amestecurilor de substante cu compozijie necunoscuta prin
HPLC Tn faza inversa.
' Probele normals sunt probe ce contin substante organice cu mase rnoieculare obifnuite.
Probe speciale sunt cele care contin ioni anorganici, izomeri de separat, biomolecule, polimeri,
carbohidrati.
241