LP3 IMUNO 2019

L. P.3
Reacţii de precipitare. Clasificare. Reacţii de precipitare în mediu lichid. Reacţii
de precipitare în mediu solid. Difuzia simpla Mancini. Difuzia dubla
Ouchterlony. Difuzia dublă Elek. Reacţii de precipitare combinate cu migrarea
în câmp electric: Imunoelectroforeza. Contraimunelectroforeza

Imunoprecipitarea se manifesta doar atunci cand Ag solubil este amestecat

cu Ac corespunzator. Ea poate fi observata sau in mediu lichid, sau solid, fiind
calitativa sau cantitativa. Acestea sunt reactii specifice, dar putin sensibile ce
necesita cantitati importante de anticorpi.

Precipitarea complexelor moleculare rezultate din uniunea Ag-Ac este

determinata de formarea unei retele tridimensionale de Ag reunite prin Ac.

Condiţiile de formare a reţelei de precipitare:

• Ac sa fie cel putin bivalent (Ac completi)
• Ag sa fie multivalent (haptenele nu pot fi precipitate)
• Precipitarea maxima corespunde cu zona de echivalenţă, unde Ac si Ag sunt in
raport optimal de concentraţie, ce permite precipitarea tuturor moleculelor de Ac cu
Ag corespunzator.
În exces de Ag sau de Ac precipitatul nu se formează.

Clasificarea reacţiilor de precipitare

Reactii de precipitare in mediu lichid:

• reactii de precipitare in amestec (reactii de floculare):
- titrarea toxinei difterice, determinarea titrului Ac antitoxici
- VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin),
utilizate in diagnosticul serologic al sifilisului
• reactii de precipitare in inel:
- reactia Ascoli, determinarea grupului streptococic
• reactii de precipitare in tub capilar
- determinarea prezentei proteinei C reactive

1
LP3 IMUNO 2019

- determinarea prezentei tipului M streptococic (streptococi de grup A)

• pe lama:
- test Ferreira.

Reactii de precipitare in mediu solid (gel):

• imunodifuzia radiala simpla (metoda Mancini)
• difuzia dubla:
- metoda Elek
- difuzia dubla radiala (Ouchterlony)

Reactii de precipitare in care difuzia in gel este combinata cu migrarea in cimp

electric:
• imunoelectroforeza
• contraimunoelectroforeza
• electroforeza urmata de imunofixare
• electroimunodifuzia

Reacţii de precipitare în mediu lichid

Reacţii de precipitare în amestec (reacţii de floculare)

Se efectuează diluţia succesivă a serului imun (Ac) la care se adauga cantităţi
egale de Ag.
Se introduc probele în termostat şi periodic se examinează pentru depistarea
tubului în care apare precipitatul iniţial (zona de echivalenţă). Utilizare: pentru
determinarea cantităţii de toxină, antitoxină sau anatoxină.
Se demonstreaza prezenta sau absenta precipitatului in functie de
concentratiile relative de Ag si Ac.
Exemplu: pentru titrarea toxinei difterice (Ramon) se pun in contact, in
amestec in tuburi, cantitati egale din componenta care trebuie titrata (toxina difterica,
Ag) cu cantitati variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Cantitatea maxima de
precipitat se gaseste in tubul unde exista raportul de echivalenta.
Pentru sistemul toxina difterica-Ac anti-toxina difterica (ca si in cazul
sistemului toxina tetanica-Ac anti-toxina tetanica), raportul de echivalenta se

2
LP3 IMUNO 2019

suprapune peste proportia optima, astfel incit se poate observa relativ usor tubul in
care apare cantitatea cea mai importanta de precipitat.
Cunoscind titrul Ac, se afla imediat titrul toxinei (1 Lf = 1 limes floculans =
cantitatea de toxina care se combina cu o unitate de antitoxina = 1UA = 1 unitate
antitoxica). Daca de exemplu, precipitarea maxima apare in tubul in care titrul Ac
este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf.
Asemanator, prin metoda Dean si Web se poate determina titrul Ac anti-toxici,
cunoscind titrul toxinei.

- VDRL (Veneral Disease Research Laboratory) este un test de floculare,

netreponemic (nespecific) utilizat pentru diagnosticul serologic al sifilisului.
Testele de floculare se bazeaza pe faptul ca particulele antigenice ramin
dispersate in serul normal, dar formeaza grunji vizibili atunci cind se combina
cu reaginele.
Tehnica: serul de cercetat se inactiveaza 30 minute la 56ºC.
Se amesteca intr-o placa cu godeuri o cantitate de 0,05 ml ser cu suspensie
antigenica preparata in prealabil.
Se folosesc martori (seruri cu reactivitate cunoscuta, martor pentru Ag) pentru
fiecare test.
Se aseaza placa pe un agitator la 180 turatii/minut 4 minute.
Rezultatul se citeste prin transluminare pe fond negru, cu ajutorul unei lupe.
Rezultatul este negativ daca lichidul nu prezinta flocoane si este asemanator
martorului negativ si martorului Ag.
Rezultatul este pozitiv cind se vad flocoane, in lichid clar.
Rezultatul negativ nu elimina diagnosticul de sifilis; pacientul se poate afla in
perioada de incubatie sau in faza de sifilis latent (evidentiabil prin TPHA).

- RPR este un alt test de floculare, netreponemic (nespecific) utilizat pentru

diagnosticul serologic al sifilisului.
Tehnica: se executa pe carduri de material plastic pe care apar mai multe cercuri de
18 mm. Ag este preparat dintr-o suspensie antigenica tip VDRL modificata (pentru a
3
LP3 IMUNO 2019

elimina etapa de inactivare prin caldura). Reactivul contine si particule de carbune.

Ag RPR este amestecat cu serul de cercetat in cercul de pe card.
Daca Ac anti-T. palLidum sunt prezenti, se combina cu particulele lipidice din
Ag si produc aglutinarea lor. Particulele de carbune coaglutineaza cu Ac si duc la
aparitia unor granule negre pe fondul alb al cardului. In absenta Ac rezulta un aspect
gri uniform. Testul se poate realiza calitativ si cantitativ (dilutii de ser).

Reacţii de precipitare în inel.

Intr-un tub cu diametrul de 5 ml se introduce serul imun; pipeta se inclina si pe peretii
ei se lasa sa se prelinga incet solutia de Ag, ca sa nu se amestece cu serul.
Daca Ac din ser corespund cu Ag, in zona de separare a celor doua lichide se
formeaza un inel alb, ceea ce semnifica precipitarea complexului Ag-Ac.
Avantajul metodei – rapiditatea si simplicitatea.
Utilizarea practica: identificarea petelor de sange, depistarea falsificarilor produselor
alimentare, depistarea antigenului polizaharidic al agentului antraxului in omogenat
de organe (reactia Ascoli)

4
LP3 IMUNO 2019

Reactia Ascoli:
Se utilizeaza 3 tuburi, 1 pentru reactie si 2 tuburi martor. In primul tub martor se
pipeteaza 0,5 ml ser anticarbunos si 0,5 ml solutie salina fiziologica, iar in al doilea
tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal si 0,5 ml solutie de antigen. In tubul
de reactie se pipeteaza intii 0,5 ml din serul anticarbunos, urmind ca solutia de Ag,
0,5 ml, sa fie pipetata foarte lent, eventual prin scurgere picatura cu picatura, pe
peretele interior al tubului, astfel incit cele doua solutii sa nu se amestece. In cazul
reactiei pozitive (prezenta Ag carbunos in solutia antigenica), dupa circa 5 minute, la
interfata dintre cei doi reactivi apare un “inel” de precipitare.

Reacţii de precipitare în mediu solid (in gel)

In aceste reactii Ag si Ac difuzeaza unul spre altul prin geloza si in zona de

concentratie optima a castor doua reactivese produce precipitarea sub forma de linii
albe-cenusii. Daca exista mai multe sisteme Ag-Ac de precipitare se vor forma linii
de de precipitare distincte. Poate fi utilizata in analiza calitativa a unui amestec de
Ag in solutie.

Imunodifuzia radiala simpla (Mancini) se bazeaza pe difuzia spontana si

radiala a Ag din proba de cercetat, intr-un gel care contine o cantitate constanta de
Ac, determinind aparitia unui cerc de precipitare al carui diametru este direct
proportional cu concentratia de Ag din proba.
Pentru a obtine un cerc de precipitare de marime convenabila, concentratia
Ac inglobati in gel trebuie sa fie aleasa in functie de titrul acestora si de concentratia
Ag care urmeaza a fi testat.

5
LP3 IMUNO 2019

Aplicatii:
- imunograma (determinarea cantitativa in serul bolnavilor a unor fractiuni
proteinice, cum ar fi IgA, IgM, IgG),
- determinarea fractiunilor Complementului in ser uman.
Tehnica: sunt necesare placute in care se toarna un gel care include Ac fata de
structura a carei concentratie dorim sa o determinam. In gel sunt perforate mici
godeuri (3 mm).
Sunt necesare seruri de cercetat si un ser de referinta in care se cunoaste
concentratia diferitelor componente.
Serurile se dilueaza in functie de proteina care urmeaza a fi determinata si apoi
se pipeteaza in godeuri. Dupa 10 minute de mentinere a placutei pe masa de lucru,
aceasta se incubeaza la 37ºC, cu stratul de gel pozitionat in sus, timp de 24-48 ore.
Citirea se face cu ajutorul unei rigle gradate din plastic, speciala pentru aceasta
analiza.
Se va masura initial diametrul cercului de precipitare din jurul godeului in care se
afla serul de referinta, iar in functie de acesta se vor masura si cele ale serurilor test.
Concentratiile se obtin dupa inmultirea cu dilutia probei, conform unor tabele.

Imunodifuzia radiala dubla (Ouchterlony) se bazeaza pe difuzia Ag si Ac (unul

spre celalalt) intr-un gel. Deoarece marimea moleculelor de Ag si Ac este mai mica
decit diametrul porilor gelului, iar distanta parcursa de reactant intr-un anumit timp
este direct proportionala cu gradientul concentratiei sale si invers proportionala cu
greutatea sa moleculara, migrarea reactantilor unul spre celalalt determina formarea
unor linii de precipitare la locul de intilnire Ag-Ac.

6
LP3 IMUNO 2019

In gelul transparent vor aparea linii opace, numarul lor corespunzind

numarului sistemelor Ag-Ac studiate. Metoda certifica prezenta sau absenta
proteinei cercetate.
Aplicatii:
- determinarea α-fetoproteinei, proteina C reactiva, β-2 microglobulina, proteine
Bence-Jones tip kappa si lambda, produsi de degradare ai fibrinogenului
- in micologie, pentru determinarea exoantigenelor fungice (Histoplasma
capsulatum, Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezenta
Ac fata de Ag fungice, in diagnosticul serologic al aspergilozelor invazive
- determinarea specificitatii Ac antinucleari sau a altor Ac
Tehnica:
Sunt necesare lame de microscop pe care se toarna un gel de agar 1%, lama putind
fi folosita pe parcursul unei zile. In gelul de pe lama se perforeaza 3 grupe de
godeuri, cite 7 godeuri in fiecare grup (1 godeu central si 6 godeuri periferice, fiecare
cu diametrul de 3 mm).
De exemplu, daca se determina prezenta proteinei C reactiva (CRP) in seruri de
cercetat, e nevoie de un ser cu Ac anti-CRP, seruri de cercetat si un ser de referinta
care contine CRP.
Se numeroteaza godeurile periferice, se pipeteaza Ac anti-CRP in godeul central si
un ser de referinta cu CRP in godeurile 1 si 4. In celelalte godeuri se pipeteaza
serurile de cercetat.
Se incubeaza la 37ºC, timp de 24 ore, in camera umeda. Liniile de precipitare pot
deveni vizibile dupa 2-4 ore dar sunt mult mai clare dupa 24 ore. Pentru citire poate
fi necesara o lupa si o sursa de lumina. Intre godeul central si godeurile 1 si 4
(martori pozitivi) vor aparea linii (arcuri) de precipitare. In cazul in care de ex., in
godeul 2 exista CRP, va aparea un arc de precipitare si intre godeul central si godeul
nr.2. Este certificata prezenta CRP in cazul in care cele 2 linii de precipitare (dintre
godeul central si godeurile 1 si 2) sunt una in continuarea celeilalte (imagine de
“genunchi indoit”).

7
LP3 IMUNO 2019

Difuzia dublă Elek

Aplicatii:
- depistarea capacitatii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae –
daca tulpina este toxigena, toxina va difuza in mediu, iar dupa unirea cu Ac
anti-toxina, complexele Ag-Ac vor da nastere unor linii de precipitare

Tehnica:
Intr-o cutie Petri se toarna mediul Elek si dupa ce mediul s-a intarit, se
decupeaza un sant pe unul din diametre.
In santul respectiv se pipeteaza 0,5 ml ser antidifteric, ser care contine Ac
anti-toxina difterica in concentratie de 1000 UI/ ml.
Ac anti-toxina difterica vor difuza in mediu.
Dupa circa 2 ore se insaminteaza pe santul cu Ac anti-toxina, de fiecare parte
a santului, o tulpina de Corynebacterium diphteriae toxigena (martor pozitiv), o
tulpina de Corynebacterium diphteriae ne-toxigena (martor negativ) si tulpini de
cercetat, cite un striu (de fiecare parte a santului) pentru fiecare tulpina.
Se incubeaza la 37ºC pentru 48 ore, dar se urmareste zilnic aparitia culturii si
precipitatului (liniilor de precipitare).
De-a lungul liniilor de insamintare apare cultura bacteriana.
Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzeaza in
mediu. Unirea dintre Ag si Ac duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipita,
iar in mediu vor aparea linii de precipitare in unghiurile dintre cultura si santul cu Ac

8
LP3 IMUNO 2019

anti-toxina. In cazul in care apar linii de precipitare in unghiul dintre una dintre
tulpinile de cercetat si santul cu Ac anti-toxina, respectiva tulpina este toxigena.
Reactia va fi negativa pentru martorul negativ si pentru tulpinile de cercetat ne-
toxigene.

Reacţii de precipitare combinate cu migrarea în câmp electric

Electroforeza proteica in gel este folosita pentru decelarea unor proteine

patologice.
Deplasarea proteinelor intr-un strat de gel supus actiunii unui cimp electric se
va realiza diferentiat, pentru fiecare structura proteica in parte, in functie de
greutatea moleculara si incarcatura electrica a proteinelor.
Pentru vizualizare este necesara fixarea, uscarea si colorarea liniilor de
precipitare care corespund fractiunilor proteice din serul normal sau a unor eventuale
proteine patologice.

9
LP3 IMUNO 2019

Imunoelectroforeza asociaza electroforeza in gel cu imunodifuzia dubla

(realizindu-se separarea prin electroforeza a proteinelor in mediu gelozat, urmata de
o imunodifuzie dubla utilizind un antiser corespunzator).
Reactia Ag-Ac se va vizualiza prin aparitia unor arcuri de precipitare.
Este o metoda foarte utila in studierea puritatii unui Ag (sau Ac).
Aplicatii:
- evidentierea prezentei Ag K eliminat in urina in boala pneumococica

10
LP3 IMUNO 2019

11
LP3 IMUNO 2019

Contraimunoelectroforeza este o dubla difuzie in care deplasarea unul fata

de celalalt a Ag si Ac este accelerata de un cimp electric.
Proteinele cu migrare anodica sunt precipitate intr-un camp electric de catre
anticorpii specifici.

`
Aplicatii:
- antigene bacteriene, virale, parazitare (antigene meningococice,
streptococice, pneumococice, antigenul HBs etc.
- decelarea sau identificarea unor proteine serice patologice (alfa feto proteina,
produsii D si E de degradare ai fibrinogenului).

Electroimunodifuzia are la baza electroforeza probelor care contin proteina-Ag,

intr-un strat de gel, care contine o cantitate constanta de Ac monospecifici (anti
proteina-Ag), rezultind zone de precipitare in forma de racheta sau conuri, a caror
arie este direct proportionala cu concentratia Ag.
Metoda are o sensibilitate mai mare decit imunodifuzia radiala simpla.

12
LP3 IMUNO 2019

13