L. P.

2
I. Reacii de precipitare
Reactia Ag-Ac de precipitare consta in unirea Ag solubile cu Ac specifici, rezultind complexe
Ag-Ac, care devin insolubile si stabile decit in cazul formarii unei retele tridimensionale,
conform teoriei retelei care presupune: un Ag cel putin trivalent pentru amplasarea Ac, un Ac
bivalent si conditii fizice favorabile precipitarii.
Reactia de precipitare este sensibila si specifica in evidentierea prezentei Ag (pentru
realizarea retelei Ag-Ac este necesar ca in reactie sa intre o anumita cantitate de Ag si Ac,
care sa se gaseasca intr-un anumit raport/proportie, iar Ag care participa la formarea
agregatelor sunt intr-o cantitate proportional mai mica, in raport cu Ac).
Clasificarea reaciilor de precipitare
Reactia Ag-Ac de precipitare poate avea loc in mediu lichid sau solid.
a. Reactii de precipitare in mediu lichid:
reactii de precipitare in amestec, reactii de floculare:
- titrarea toxinei difterice, determinarea titrului Ac antitoxici
- !"R# (!eneral "isease Research #aborator$), R%R (Rapid %lasma Reagin), utilizate
in diagnosticul serologic al sifilisului
reactii de precipitare in inel
- reactia Ascoli (in diagnosticul antraxului), determinarea grupului streptococic
reactii de precipitare in tub capilar
- determinarea prezentei proteinei & reactive
- determinarea prezentei tipului ' streptococic (streptococi de grup A)
doza(ul nefelometric
b. Reactii de precipitare in mediu gelifiat:
imunodifuzia radiala simpla (metoda 'ancini)
difuzia dubla:
- metoda )le*
- difuzia dubla radiala (+uchterlon$)
- reactii de precipitare in care difuzia in gel este combinata cu migrarea in cimp
electric:
)lectroforeza si imunelectroforeza
&ontraimunoelectroforeza
)lectroforeza urmata de imunofixare
)lectroimunodifuzia
Reacii de precipitare n mediu lichid
Au la baza unirea Ag cu Ac in mediul lichid, formindu-se complexe Ag-Ac, care vor precipita
atunci cind Ag si Ac se gasesc in anumite proportii.
Reacii de precipitare n amestec
,e demonstreaza prezenta sau absenta precipitatului in functie de concentratiile relative de Ag
si Ac. "e exemplu, pentru titrarea toxinei difterice (Ramon) se pun in contact, in amestec in
tuburi, cantitati egale din componenta care trebuie titrata (toxina difterica, Ag) cu cantitati
variabile de Ac la care titrul este cunoscut. &antitatea maxima de precipitat se gaseste in tubul
unde exista raportul de echivalenta. %entru sistemul toxina difterica-Ac anti-toxina difterica
(ca si in cazul sistemului toxina tetanica-Ac anti-toxina tetanica), raportul de echivalenta se
suprapune peste proportia optima, astfel incit se poate observa relativ usor tubul in care apare
cantitatea cea mai importanta de precipitat. &unoscind titrul Ac, se afla imediat titrul toxinei
(- #f . - limes floculans . cantitatea de toxina care se combina cu o unitate de antitoxina .
-/A . - unitate antitoxica). "aca de exemplu, precipitarea maxima apare in tubul in care
titrul Ac este de -0 /A, titrul toxinei este de -0 #f.
Asemanator, prin metoda "ean si 1eb se poate determina titrul Ac anti-toxici, cunoscind
titrul toxinei.
VDRL (Veneral Disease Research Laborator! este un test de floculare, netreponemic
(nespecific) utilizat pentru diagnosticul serologic al sifilisului. 2estele de floculare se bazeaza
pe faptul ca particulele antigenice ramin dispersate in serul normal, dar formeaza grun(i
vizibili atunci cind se combina cu reaginele.
2ehnica:
,erul de cercetat se inactiveaza 30 minute la 456&. ,e amesteca intr-o placa cu godeuri o
cantitate de 0,04 ml ser cu suspensie antigenica preparata in prealabil. ,e folosesc martori
(seruri cu reactivitate cunoscuta, martor pentru Ag) pentru fiecare test. ,e aseaza placa pe un
agitator la -70 turatii/minut 8 minute. Rezultatul se citeste prin transluminare pe fond negru,
cu a(utorul unei lupe.
Rezultatul este negativ daca lichidul nu prezinta flocoane si este asemanator martorului
negativ si martorului Ag. Rezultatul este pozitiv cind se vad flocoane, in lichid clar.
Rezultatul negativ nu elimina diagnosticul de sifilis9 pacientul se poate afla in perioada de
incubatie sau in faza de sifilis latent (evidentiabil prin 2%:A).
RPR este un alt test de floculare, netreponemic (nespecific) utilizat pentru diagnosticul
serologic al sifilisului.
2ehnica:
,e executa pe carduri de material plastic pe care apar mai multe cercuri de -7 mm. Ag este
preparat dintr-o suspensie antigenica tip !"R# modificata (pentru a elimina etapa de
inactivare prin caldura). Reactivul contine si particule de carbune. Ag R%R este amestecat cu
serul de cercetat in cercul de pe card. "aca Ac anti-T. palidum sunt prezenti, se combina cu
particulele lipidice din Ag si produc aglutinarea lor. %articulele de carbune coaglutineaza cu
Ac si duc la aparitia unor granule negre pe fondul alb al cardului. ;n absenta Ac rezulta un
aspect gri uniform. 2estul se poate realiza calitativ si cantitativ (dilutii de ser).
Reacii de precipitare n inel
Reac<ia de precipitare =n inel, consta in punerea in contact a Ag si Ac astfel incit sa nu se
amestece9 reactia care apare la interfata dintre Ag si Ac se concretizeaza printr-un inel de
precipitare albicios.
Aplicatii:
- in medicina legala > reactia /hlenhut > pentru identificarea originii petelor de singe
- in industria alimentara > pentru identificarea provenientei unor preparate pe baza de
carne
- identificarea prezentei Ag carbunos (Ag obtinut de la Bacillus anthracis) > reactia
Ascoli
Reactia Ascoli:
,e utilizeaza 3 tuburi, - pentru reactie si ? tuburi martor. ;n primul tub martor se pipeteaza
0,4 ml ser anticarbunos si 0,4 ml solutie salina fiziologica, iar in al doilea tub martor vom
pipeta 0,4 ml ser normal de cal si 0,4 ml solutie de antigen. ;n tubul de reactie se pipeteaza
intii 0,4 ml din serul anticarbunos, urmind ca solutia de Ag, 0,4 ml, sa fie pipetata foarte lent,
eventual prin scurgere picatura cu picatura, pe peretele interior al tubului, astfel incit cele
doua solutii sa nu se amestece. ;n cazul reactiei pozitive (prezenta Ag carbunos in solutia
antigenica), dupa circa 4 minute, la interfata dintre cei doi reactivi apare un @inelA de
precipitare.
Reacii de precipitare n mediu solid
Reactia Ag-Ac se vizualizeaza utilizindu-se geloza in care pot sa migreze cei doi reactivi,
obtinindu-se un arc/ linie de precipitare.
Imunodifu"ia radiala simpla (IDR# $ancini!
;munodifuzia radiala simpla (;"R, 'ancini) se bazeaza pe difuzia spontana si radiala a Ag
din proba de cercetat, intr-un gel care contine o cantitate constanta de Ac, determinind
aparitia unui cerc de precipitare al carui diametru este direct proportional cu concentratia de
Ag din proba. %entru a obtine un cerc de precipitare de marime convenabila, concentratia Ac
inglobati in gel trebuie sa fie aleasa in functie de titrul acestora si de concentratia Ag care
urmeaza a fi testat.
Aplicatii:
- determinarea cantitativa a ;g (;gB, ;g', ;gA), fractiunii &
3
a complementului, C--
antitripsinei, siderofilinei etc.
2ehnica:
,unt necesare placute in care se toarna un gel care include Ac fata de structura a carei
concentratie dorim sa o determinam. ;n gel sunt perforate mici godeuri (3 mm). ,unt necesare
seruri de cercetat si un ser de referinta in care se cunoaste concentratia diferitelor
componente. ,erurile se dilueaza in functie de proteina care urmeaza a fi determinata si apoi
se pipeteaza in godeuri. "upa -0 minute de mentinere a placutei pe masa de lucru, aceasta se
incubeaza la 3D6&, cu stratul de gel pozitionat in sus, timp de ?8-87 ore. &itirea se face cu
a(utorul unei rigle gradate din plastic, speciala pentru aceasta analiza. ,e va masura initial
diametrul cercului de precipitare din (urul godeului in care se afla serul de referinta, iar in
functie de acesta se vor masura si cele ale serurilor test. &oncentratiile se obtin dupa
inmultirea cu dilutia probei, conform unor tabele.
Imunodifu"ia radiala dubla (%uchterlon!
;munodifuzia dubla se bazeaza pe difuzia Ag si Ac (unul spre celalalt) intr-un gel. "eoarece
marimea moleculelor de Ag si Ac este mai mica decit diametrul porilor gelului, iar distanta
parcursa de reactant intr-un anumit timp este direct proportionala cu gradientul concentratiei
sale si invers proportionala cu greutatea sa moleculara, migrarea reactantilor unul spre
celalalt determina formarea unor linii de precipitare la locul de intilnire Ag-Ac. ;n gelul
transparent vor aparea linii opace, numarul lor corespunzind numarului sistemelor Ag-Ac
studiate. 'etoda certifica prezenta sau absenta proteinei cercetate.
Aplicatii:
- determinarea C-fetoproteinei, proteina & reactiva, E-? microglobulina, proteine Fence-
Gones tip *appa si lambda, produsi de degradare ai fibrinogenului
- in micologie, pentru determinarea exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum,
Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezenta Ac fata de Ag
fungice, in diagnosticul serologic al aspergilozelor invazive
- determinarea specificitatii Ac antinucleari sau a altor Ac
2ehnica:
,unt necesare lame de microscop pe care se toarna un gel de agar -H, lama putind fi folosita
pe parcursul unei zile. ;n gelul de pe lama se perforeaza 3 grupe de godeuri, cite D godeuri in
fiecare grup (- godeu central si 5 godeuri periferice, fiecare cu diametrul de 3 mm). "e
exemplu, daca se determina prezenta proteinei & reactiva (&R%) in seruri de cercetat, e
nevoie de un ser cu Ac anti-&R%, seruri de cercetat si un ser de referinta care contine &R%. ,e
numeroteaza godeurile periferice, se pipeteaza Ac anti-&R% in godeul central si un ser de
referinta cu &R% in godeurile - si 8. ;n celelalte godeuri se pipeteaza serurile de cercetat. ,e
incubeaza la 3D6&, timp de ?8 ore, in camera umeda. #iniile de precipitare pot deveni vizibile
dupa ?-8 ore dar sunt mult mai clare dupa ?8 ore. %entru citire poate fi necesara o lupa si o
sursa de lumina. ;ntre godeul central si godeurile - si 8 (martori pozitivi) vor aparea linii
(arcuri) de precipitare. ;n cazul in care de ex., in godeul ? exista &R%, va aparea un arc de
precipitare si intre godeul central si godeul nr.?. )ste certificata prezenta &R% in cazul in care
cele ? linii de precipitare (dintre godeul central si godeurile - si ?) sunt una in continuarea
celeilalte (imagine de @genunchi indoitA).
Difu"ia dubl& 'le(
Aplicatii:
- depistarea capacitatii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae > daca
tulpina este toxigena, toxina va difuza in mediu, iar dupa unirea cu Ac anti-toxina,
complexele Ag-Ac vor da nastere unor linii de precipitare
2ehnica:
;ntr-o cutie %etri se toarna mediul )le* si dupa ce mediul s-a intarit, se decupeaza un sant pe
unul din diametre. ;n santul respectiv se pipeteaza 0,4 ml ser antidifteric, ser care contine Ac
anti-toxina difterica in concentratie de -000 /;/ ml. Ac anti-toxina difterica vor difuza in
mediu. "upa circa ? ore se insaminteaza pe santul cu Ac anti-toxina, de fiecare parte a
santului, o tulpina de Corynebacterium diphteriae toxigena (martor pozitiv), o tulpina de
Corynebacterium diphteriae ne-toxigena (martor negativ) si tulpini de cercetat, cite un striu
(de fiecare parte a santului) pentru fiecare tulpina. ,e incubeaza la 3D6& pentru 87 ore, dar se
urmareste zilnic aparitia culturii si precipitatului (liniilor de precipitare). "e-a lungul liniilor
de insamintare apare cultura bacteriana. "in cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen,
toxina (Ag) difuzeaza in mediu. /nirea dintre Ag si Ac duce la formarea unor complexe Ag-
Ac care precipita, iar in mediu vor aparea linii de precipitare in unghiurile dintre cultura si
santul cu Ac anti-toxina. ;n cazul in care apar linii de precipitare in unghiul dintre una dintre
tulpinile de cercetat si santul cu Ac anti-toxina, respectiva tulpina este toxigena. Reactia va fi
negativa pentru martorul negativ si pentru tulpinile de cercetat ne-toxigene.
Reacii de precipitare combinate cu mi)rarea n c*mp electric
'lectrofore"a proteica in )el
)lectroforeza proteinelor este o metoda curentI pentru separarea proteinelor serice utilizatI =n
laboratoarele de biochimie medicalI.
)lectroforeza proteica in gel este folosita pentru decelarea unor proteine patologice.
"eplasarea proteinelor intr-un strat de gel supus actiunii unui cimp electric se va realiza
diferentiat, pentru fiecare structura proteica in parte, in functie de greutatea moleculara si
incarcatura electrica a proteinelor. %entru vizualizare este necesara fixarea, uscarea si
colorarea liniilor de precipitare care corespund fractiunilor proteice din serul normal sau a
unor eventuale proteine patologice.
,e utilizeazI suporturi solide Ji p: alcalin, la care toate componentele proteice sunt =ncIrcate
negativ Ji migreazI spre polul pozitiv. %e electroforegramI, dupI colorare, proteinele apar
sub formI de benzi cIrora li se mIsoarI densitatea opticI, fiecare bandI avKnd un maxim de
absorb<ie. %rin electroforezI, =n condi<iile amintite mai sus, se ob<in cinci frac<iuni: albumina
sericI, alfa
-
, alfa
?
, beta, gamma - globuline.
Albumina, alafa
-
Ji beta apar sub forma unor benzi omogene, bine definite. alfa
?
, Ji
gamma apar ca benzi difuze, iar frac<iunea gamma prezintI =n partea sa centralI o zona mai
intens coloratI.
Indicatii
- detectarea gamapatiilor monoclonale
- evaluarea proteinelor serice Ji a statusului nutri<ional.
Valori de referin& - sunt dependente de vKrstI

Vrst Albumina (%) a
1
(%) a
2
(%) b(%) g(%) A/G
L - an 80-54 ?-4 5.5--3.4 7.4--8 -0-?- -.-5-?.?3
- > -5
ani
40-54 ?-4 5--4 7.4--4 -0-?? -.05-?.87
M -5 ani 4? > 57 ?-4 5,5--3,4 7,4 --8 -- > ?- -.3N-?.?3

Interpretarea re"ultatelor
%entru a facilita interpretarea rezultatelor va fi descrisI fiecare din cele 4 frac<iuni cu
proteinele componente:
Albumina
- ,cIderea albuminei serice (hipoalbuminemie) survine =n stIri patologice variate Ji are
semnifica<ii diferite (malnutri<ie, malabsorb<ie, sindrom nefrotic, neoplazii).
- &reJteri ale albuminei apar =n urma deshidratIrilor. On cazuri speciale, =n zona de
migrare a albuminei se constatI o bandI suplimentarI, datoratI unor varia<ii genetice
fIrI relevan<I clinicI (aloalbuminemie Ji bisalbuminemie).
Pona alfa
-
reflectI =n special concentra<ia sericI de alfa--antitripsinI
- reducerea acestei frac<iuni se intKlneste =n deficitul de alfa--antitripsinI asociat cu
anumite boli pulmonare (emfizem cu debut precoce) Ji hepatice (hepatitI neonatalI).
- creJteri se =nregistreazI =n toate reac<iile inflamatorii (reactant de fazI acutI). On
cazuri rare, ob<inerea unei benzi suplimentare largi =n aceastI zonI poate sugera
prezen<a alfa-fetoproteinei.
Pona alfa
?
este constituitI din ? componente proteice: alfa? macroglobulina Ji haptoglobina.
- creJtere de a
?
apare =n infec<ii acute, reumatism articular acut, arteritI, sindrom
nefrotic, diabet zaharat, neoplazii9
- scIderea acestei fractiuni se poate =ntKlni =n pancreatite acute severe, leziuni
hepatocelulare, sindroame de coagulare intravascularI diseminatI, anemii hemolitice,
anemii megaloblastice.
Pona beta este alcItuitI din ? benzi distincte: b- corespunzItoare transferinei Ji b? care
include frac<iunile complementului &
3
Ji &
8
. Al treilea component al acestei zone este beta-
lipoproteina, a cIrei bandI se poate suprapune pe cea a transferinei sau &
3
sau poate fi situatI
=n zona beta-gamma.
- creJteri apar =n anemia feriprivI Ji ciroza biliarI Ji
- scaderi =n boli autoimune aflate =n puseu activ (#),), nefrozI, afec<iuni hepatice,
neoplazii, infec<ii acute Ji cronice. On unele cazuri de mielom multiplu de tip ;gA se
poate constata prezen<a unui component monoclonal =n aceasta zonI.
Pona gamma include imunoglobulinele (;gB, ;gA, ;g', ;g" Ji ;g)). Anomaliile suferite de
acestea se traduc fie prin diverse deficite, fie prin hipergamaglobulinemii policlonale sau
monoclonale.
- scaderi =n agamaglobulinemie, hipogamaglobulinemii Ji sindroame nefrotice.
:ipogamaglobulinemia poate fi congenitalI sau dobKnditI Ji poate fi uJor detectatI la
electroforeza proteinelor serice atunci cKnd concentra<iile principalelor 3 clase de
imunoglobuline sunt scIzute (;gB, ;gA Ji ;g'). %rezen<a hipogamaglobulinemiei la
adult impune continuarea investiga<iilor =n vederea depistIrii unei posibile boli
limfoproliferative (mielom cu lan<uri uJoare, leucemie limfaticI cronicI, limfoame).
- creJterile policlonale indicI un proces imunologic cronic asociat cu afec<iuni hepatice
(hepatitI cronicI activI, cirozI), boli de colagen (#),, poliartritI reumatoidI),
neoplazii (ex. boalI :odg*in), leucemie mielo-monocitarI cronicI. On aceste cazuri,
hipergamaglobulinemia se datoreazI activIrii unui numIr mare de clone plasmocitare
care elibereazI imunoglobuline. 2rebuie men<ionat aspectul caracteristic cirozei
alcoolice de QpunteA beta-gama, vizualizat pe gel ca o zonI intens coloratI =ntre
zonele beta Ji gamma.
/neori, =n zona gamma se pot observa cKteva benzi mici, =nguste, denumite oligoclonale,
=ntKlnite la pacien<i cu hepatitI, boli ale complexelor imune, sindromul imunodeficien<ei
dobKndite, limfomul angioimunoblastic.
Bamapatiile monoclonale includ un numIr mare de condi<ii clinice Ji biologice asociate de
obicei cu afec<iuni maligne (mielom multiplu, boalI 1aldenstrRm, amiloidozI, limfoame) dar
Ji cu unele afec<iuni benigne sau chiar cu absen<a unei modificari patologice (gamapatii
monoclonale cu semnifica<ie nedeterminatI). On aceste cazuri, se depisteazI la electroforeza
proteinelor un component monoclonal (bandI '), rezultat ca urmare a proliferarIrii unei
singure clone plasmocitare. %e gel, componentele monoclonale apar sub forma unor benzi
inguste, net definite, iar dupI scanarea densitometricI, se ob<in QvKrfuriA (pea*-uri)
caracteristice, ce pot fi =ntKlnite oriunde =ntre zonele alfa Ji gamma, datoritI mobilitI<ii
electroforetice variabile, cel mai frecvent insI =n zona gamma.
;munoglobulinele monoclonale sunt omogene din punct de vedere structural Ji biochimic,
fiind alcItuite dintr-un singur tip de lan< uJor (*appa sau lambda). On circula<ie pot fi eliberate
imunoglobuline complete sau numai subunitI<i ale acestora (ex. lan<uri uJoare monoclonale,
denumite proteine Fence-Gones). %rezen<a componentului monoclonal va fi precizatI pe
buletinul final de analize al pacientului, cu recomandarea de a se efectua electroforeza
proteinelor serice cu imunofixare
--3
.
On tabelul de mai (os sunt sintetizate informa<iile prezentate:


Legend


Imunoelectrofore"a
,e asociaza electroforeza in gel cu imunodifuzia dubla (realizindu-se separarea prin
electroforeza a proteinelor in mediu gelozat, urmata de o imunodifuzie dubla utilizind un
antiser corespunzator). Reactia Ag-Ac se va vizualiza prin aparitia unor arcuri de precipitare.
)ste o metoda foarte utila in studierea puritatii unui Ag (sau Ac).
Aplicatii:
- evidentierea prezentei Ag S eliminat in urina in boala pneumococica
Contraimunoelectrofore"a
&ontraimunoelectroforeza este o dubla difuzie in care deplasarea unul fata de celalalt a Ag si
Ac este accelerata de un cimp electric.
2ehnica:
%e o lama de microscop se toarna un gel de agar -H si se perforeaza 3 grupe de perechi de
godeuri, fata in fata. 'etoda poate fi folosita pentru acele structuri antigenicecare in cimp
electric migreaza catre anod. ;n godeurile care vor fi pozitionate spre catod (polul negativ) se
pipeteaza Ag, iar in godeurile care vor fi pozitionate spre anod (polul pozitiv) se pipeteaza Ac
+one electroforetice
Descriere aspect Albumina
%
Alfa 1
%
Alfa 2
%
Beta
%
Gamma
%
Normal T T T T T
nteropatie cu pierdere de
proteine
- TU TU T- -TU
!indrom ne"rotic - T UUU T T-
Hipogamaglobulinemie T- T T T -
Agamaglobulinemie T- T T T AbsentI
#amopatie policlonal T- T T T U
Rspuns in"lamator cronic T- TU U T U
Rspuns in"lamator acut T- U U T T-
Rspuns in"lamator subacut T- T U T T
Ciro$ hepatic - T T- Q%unteA beta-gamma
Hipoal"a%& globulinemie T - T T T
#amopatie monoclonal 'tip () T- T T T FandI '
#amopatie monoclonal 'tip *) T- T T Fanda ' T-
#amopatie biclonal T- T T Fanda ' FandI '
Ben$i oliglonale T- TU TU T Fenzi oligl.
Bisalbuminemie !Krf dublu
Hipoalbuminemie - T T T T
N + ni,el normal , +ni,el crescut - +ni,el sc$ut
N +ni,el
normal-crescut
N! +ni,el
normal-sc$ut
!N +ni,el sc$ut-normal-crescut
cunoscuti, specifici Ag de identificat. Reactia este mai rapida si mai sensibila decit dubla
difuzie deoarece migrarea celor doi reactanti unul catre celalalt este amplificata de cimpul
electric. Reactia (aparitia unei linii de precipitare intre godeuri, in cazul in care in godeul
catodic se gaseste Ag presupus) poate fi citita dupa numai 30-N0 minute in loc de ?8 ore asa
cum se intimpla in dubla difuzie +uchterlon$.
Aplicatii:
- identificarea prezentei Ag:Fs > importanta istorica
- identificarea Ag capsulare in #&R la pacientii cu meningita acuta (Haemophilus
in"luen$ae, Neisseria meningitidis, !treptococcus pneumoniae).
'lectroimunodifu"ia
)lectroimunodifuzia are la baza electroforeza probelor care contin proteina-Ag, intr-un strat
de gel, care contine o cantitate constanta de Ac monospecifici (anti proteina-Ag), rezultind
zone de precipitare in forma de racheta sau conuri, a caror arie este direct proportionala cu
concentratia Ag. 'etoda are o sensibilitate mai mare decit imunodifuzia radiala simpla.
II. Reacia de a)lutinare
Reactia de aglutinare consta in reactia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafata unor
particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol), determinind aglutinarea acestora prin
scaderea fortelor electrostatice de repulsie dintre particule si formarea unor punti de legatura.
Antigenele sunt de natura corpusculara.
Aglutinarea este mai sensibila decit precipitarea, Ag fiind o particula si nu o molecula
solubila. Ac de tip ;g' sunt mai aglutinanti decit Ac de tip ;gB (pentru ca au mai multe
valente). )xista si Ac neaglutinanti (incompleti / blocanti) sau care aglutineaza numai la rece.
2ipuri de aglutinare:
- aglutinarea directa
- aglutinarea indirecta
- inhibarea aglutinarii
- aglutinarea in coloana
- aglutinarea mediata de Ac anti-imunoglobuline
-. .)lutinarea directa
Aglutinarea directa este aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii, celule) de catre
Ac specifici.
Aplicatii:
- in diagnosticul bacteriologic: de exemplu pentru identificarea enterobacteriaceelor
(!higella, !almonella, . col, .ibrio cholerae, Haemophilus in"luen$ae) pe baza
structurii antigenice
- in diagnosticul serologic al unor boli infectioase (febra tifoida, bruceloza,
leptospiroza, ric*ettsioza)
- determinarea grupelor sanguine (AF0)
.)lutinarea directa pe lama / in dia)nosticul bacteriolo)ic
'ateriale necesare:
- cultura de identificat (colonii de tip ,, de -7-?8 ore)
- solutie salina fiziologica
- Ac cunoscuti fata de Ag pe care dorim sa le identificam (Ac polivalenti, Ac
monovalenti de grup/ tip
- lame de microscop curate
- pahar Ferzelius cu amestec dezinfectant
2ehnica:
- se pune pe o lama o picatura suspensie omogena din colonia de identificat in ser
fiziologic (daca suspensia se limpezeste si apar grun(i, tulpina este netipabila, apare
aglutinare nespecifica, fiind probabil dintr-o colonie de tip R)
- se adauga o picatura de ser cu Ac cunoscuti si se realizeaza o suspensie omogena
- in cazul reactiei pozitive (corespondenta intre Ac cunoscuti si Ag de identificat) se
produce aglutinarea
.)lutinarea directa pe lama / reactia 0uddleson
Aplicatii:
- diagnosticul brucelozei
'ateriale:
- lame de microscop
- Ag brucelos inactivat (colorat in violet)
- ser de cercetat
2ehnica:
- se adauga o picatura de de solutie de Ag brucelos si una de ser de cercetat pe o lama
de sticla
- se omogenizeaza
- reactia este pozitiva daca apare aglutinare > Ac anti-Brucella spp sunt prezenti in serul
pacientului9 reactia pozitiva pe lama trebuie confirmata prin aglutinare in tuburi.
2. .)lutinarea indirecta (pasi1a!
Aglutinarea indirecta (pasiva) este o reactie in care particule artificiale (globule rosii
formolate, particule de latex, cristale de colesterol, colodiu etc) sau naturale sunt @incarcateA
in vitro cu Ag sau Ac si sunt aglutinate de catre Ac sau Ag corespondente din proba de
cercetat.
Aplicatii:
- determinarea factorului reumatoid, &R%
- determinarea grupului streptococic, a pneumococilor, meningococilor
- identificarea . coli tip capsular S-, H. in"luen$ae tip capsular b
- detectarea unor enterotoxine (stafilococice, clostridiene)
- detectarea unor fungi (Cryptococcus neo"ormans, Candida albicans, Aspergillus spp)
sau virusuri
- identificarea unor exotoxine in filtratul de cultura
- identificarea . coli +:-4D, Legionella pneumophilla, Listeria monocytogenes
0ema)lutinarea pasi1a 2 3P0. (Treponema pallidum hemaglutinatinare)
$etoda calitati1a4
,e face dilutia serului -/?0 (-N0Vl diluent si -0 Vl ser de analizat)9
se pun cite ?4 Vl proba diluata in cite ? godeuri9
se agita usor reactiv test si reactiv de control9
se adauga D4Vl de reactiv test in godeul - si D4 Vl reactiv de control in godeul ?9
se incubeaza pentru 84 minute pe o suprafata fara vibratii, la temperatura camerei9
se citesc rezultatele
$etoda cantitati1a4
,e face dilutia serului -/?0 (-N0Vl diluent si -0 Vl ser de analizat)9
,e lasa primul godeu gol si se adauga cite ?4 Vl 2%:A diluent pina la godeul 79
,e adauga ?4 Vl de proba in godeul -9
,e adauga ?4 Vl de proba in godeul ? se agita si se fac dilutii seriale
,e adaua D4 Vl reacti test in toate godeurile
,e obtin titruri de la -/70- -/-0?80
,e incubeaza la temperatura camerei pe o suprafata fara vibratii timp de 84 de minute
,e citesc rezultatele
D'3'R$I5.R'. 3P0. 4
"upa terminarea timpilor de reactie se face citirea reactiei, notandu-se cu :

8U voal neted de celule acoperind in intregime fundul godeului, uneori cu
margini cu falduri.
3U voal neted de celule acoperind partial fundul godeului.
?U voal de celule conturat printr-un cerc de celule.
-U voal de celule conturat printr-un cerc de celule bine evidentiat.
U/- buton de celule cu o mica deschidere centrala.
-- buton de celule cu sau fara o foarte mica deschidere centrala.
%+P;2;!: de la 8U la -U
;T&)R2: U/-
T)BA2;! : --
Aspectul reactivului de control nu trebuie utilizat drept comparatie pentru esantioanele negative.
Reactivul de control va da un buton de celule mai compact decat reactivul antigen.
+ aglutinare in godeul de control (3) indica prezenta aglutininelor nespecifice. 2otodata, reactiile
nespecifice sunt foarte rare prin utilizarea eritrocitelor de pasare, un esantion cu acest rezultat
neputand fi interpretat.
/n rezultat pozitiv in godeurile cu esantion indica prezenta anticorpilor anti-2.pallidum rezultanti ai
unei infectii trecute sau prezente.
/n rezultat negativ in godeurile cu esantion indica absenta anticorpilor.
/n rezultat la limita in testul calitativ poate corespunde la un titru scazut de anticorpi din stadiile
precoce de sifilis sau un titru rezidual din sifilisul tratat. ;n acest caz, o proba suplimentara va trebui
testata pentru a demonstra o posibila crestere a titrului de anticorpi.
;n metoda cantitativa titrul aproximativ va corespunde ultimei dilutii care va da o reactie pozitiva.
#;';2)#) R)A&2;);
2ehnica 2%:A poate da reactii incrucisate cu alte forme de infectii cu treponeme si reactii fals
pozitive cu probele pacientilor cu mononucleoza infectioasa, lepra sau maladii autoimune.
Reactii fals pozitive pot cauza si serurile lipemice sau icterice.
+cazional, in unele cazuri de sifilis primar precoce, anticorpii specifici ar putea sa nu fie detectati prin
tehnicile 2%:A.
Anticorpii specifici pot persista o lunga perioada de timp, chiar daca tratamentul acestei boli a avut
succes.
6. Inhibarea a)lutinarii
Reactia consta in inhibarea aglutinarii particulelor @incarcateA cu Ag, dupa ce in prealabil Ac
reactioneaza cu Ag corespondent.
Aplicatii:
- decelarea mioglobinei
- diagnosticul imunologic al sarcinii
.)lutinarea in coloana
'etoda permite o mai buna vizualizare a reactiei. "ispozitivul utilizat are ? compartimente,
partea in care se introduc reactivii (situata superior) si o coloana situata inferior, plina cu
microparticule de sticla. "upa introducerea hematiilor si a serului de cercetat si incubarea
acestora, dispozitivul este centrifugat. ;n cazul unei reactii pozitive complexul Ag-Ac se va
vizualiza la nivelul coloanei, in timp ce in cazul unei reactii negative, hematiile se depun in
portiunea inferioara a coloanei
.)lutinarea mediata de .c anti2imuno)lobuline
Ac anti-;g se vor cupla cu particule incarcate cu Ac si vor duce la aparitia unor aglutinate
(prin aparitia complexului imun).
Aplicatii:
- decelarea factorului reumatoid (tehnica 1aaler-Rose).
III. Reacia de fi7are a complementului (R8C!
%rincipiu:
Reac<ia de fixare a complementului (RW&) se bazeaza pe proprietatea sistemului &X de a se
fixa pe complexul imun Ag-Ac. ;n prima faza a reactiei se introduce serul de cercetat iar daca
acest ser contine Ac specifici fata de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de
fixarea &X, care se va activa pe calea clasica si nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe
sistemul hemolitic indicator (hematii U Ac antihematie). ;n cazul in care serul de cercetat nu
contine Ac specifici fata de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac in
prima etapa a RW&. "upa introducerea in reactie a sistemului hemolitic indicator, hematiile si
Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun, iar &X liber se va fixa pe acesta.
"upa fixare va urma activarea &X si respectiv liza hematiilor, hemoliza putind fi examinata cu
ochiul liber.
%entru vizualizarea reactiei este nevoie de utilizarea unui sistem hemolitic indicator9 Ag este
sub forma macromoleculara sau corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul
Ag-Ac format nu devine vizibil cu ochiul liber, daca nu se adauga sistemul hemolitic.
Aplicatii:
- diagnosticul serologic al sifilisului > reactia Fordet-1asserman
- diagnosticul serologic al infectiilor produse de /ycoplasma pneumoniae, Chlamydia
spp., Ric0ettsia spp., Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp, virusuri
'ateriale:
- serul de cercetat
- seruri de referinta (martor pozitiv si negativ)
- Ag cunoscut (suspensie corpusculara sau solutie coloidala)
- sistemul &X obtinut din ser prospat sau conservat recoltat de la cobai
- sistemul hemolitic indicator format din: hematii de berbec si ser hemolitic anti-
hematii de berbec (obtinut prin in(ectari repetate de hematii de oaie la iepurele de
laborator)
- baie de apa cu temperatura reglabila
- placi cu godeuri, tuburi de hemoliza, pipete diferite
2ehnica de lucru:
- serul de cercetat se va mentine 30 minute la 456&, in baia de apa, pentru inactivarea
&X propriu
- etape:
se pun in reactie &X, serul de cercetat si Ag cunoscut9 sunt doua posibilitati:
in serul de cercetat exista Ac specifici, rezultind un complex Ag-Ac pe
care se va fixa &X9
in serul de cercetat nu exista Ac specifici, nu se formeaza complex Ag-
Ac, &X ramine liber
se introduce in reactie sistemul hemolitic indicator (hematiiUAc anti-hematie)9
exista ? posibilitati:
&X nu este liber, nu are loc hemoliza
&X se fixeaza pe sistemul hemolitic, lizeaza hematiile si apare hemoliza
- se dilueaza conform indicatiilor din protocolul de lucru reactivii utilizati
- se repartizeaza in godeurile corespunzatoare serurile de cercetat, Ag si &X
- pe o placa separata se prepara martorii (martor pentru sistemul hemolitic, pentru &X,
Ag, serul de referinta si martor sigur negativ)
- placile se tin pina a doua zi la 8 6&
- a doua zi, placile se mentin la 3D 6& timp de 30 min
- se adauga in toate godeurile sistem hemolitic
- placile se mentin la 3D 6& timp de 30 min
- se pun placile la 8 6&, pina la sedimentarea hematiilor
- in RW& Fordet-1asserman, metoda calitativa, reactia se realizeaza in eprubete, ?
pentru reactia propriu-zisa (una cu ser diluat -/7, cealalta cu ser diluat -/-5, ? pentru
martori sigur pozitiv si sigur negativ si cite una pentru fiecare din ceilalti martori,
respectiv martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru &X, martor
pentru serul hemolitic).
- interpretare: se verifica reactia martorilor9 in tubul cu serul de cercetat, testul este
negativ (lichidul din tub are un aspect rosu, limpede), inseamna ca nu exista Ac9 testul
este pozitiv atunci cind in tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliza, hematiile se
depun formind un buton in partea inferioara a tubului (in serul de cercetat exista Ac)
%entru a stabili diagnosticul final, este necesar ca RW&-F1 sa fie confirmata prin reactii
specifice.
IV. Reacia de seroneutrali"are
%rincipiu:
Ag are o anumita proprietate biologica (toxica, enzimatica) care poate fi blocata prin
cuplarea cu Ac specific. Teutralizarea efectului biologic respectiv se poate realiza doar in
cazul in care determinantul pentru toxicitate sau pentru activitatea enzimatica respectiva
este acelasi cu determinantul antigenic (epitop). R,T are nevoie de un artificiu tehnic
pentru a permite vizualizarea rezultatelor.
Aplicatii:
- diagnosticul microbiologic direct:
identificarea Clostridium per"ringens prin metoda placilor
semineutralizate
testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test
de seroprotectie)
toxinotipia in cazul suspicionarii unei toxiinfectii alimentare cu
Clostridium botulinum
- diagnosticul serologic:
reactia A,#+
- prevenirea unor boli infectioase prevenibile prin vaccinare si evaluarea eficacitatii
vaccinale:
vaccinarea cu anatoxine ("2%, "2, A2%A, A"%A)
titrarea prezentei Ac anti-toxine (difterica, tetanica)
testarea prin ;"R (intradermoreactie) a susceptibilitatii fata de o
anumita boala infectioasa care are la baza drept mecanism patogenic
efectul unei exotoxine
- tratamentul/ profilaxia unor boli infectioase prin utilizarea de imunoglobuline
specifice omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe
Reactia .#L%
Reactia A,#+ determina titrul Ac antistreptolizina +.
Aplicatii:
- diagnosticul retrospectiv al unei infectii streptococice
- confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice
%rincipiu:
2itrarea Ac anti-,#+ se bazeaza pe faptul ca ,#+ are efect hemolitic asupra hematiilor
de iepure sau de berbec. ;n cazul in care in serul de cercetat exista Ac anti-,#+, actiunea
hemolitica a ,#+ este neutralizata. &ombinind dilutii din serul de cercetat cu o cantitate
constanta de ,#+ se poate determina titrul A,#+.
'ateriale si reactivi necesari:
- ser de cercetat
- ,#+ liofilizata
- singe defibrinat de iepure/ berbec
- solutie salina izotona, solutie de rivanol 0,3H
- eprubete, pipete gradate
- baie de apa, centrifuga
2ehnica:
- se omogenizeaza suspensia de hematii
- se indeparteaza inhibitorii ,#+ din serul de cercetat (se utilizeaza solutie de rivanol si
suspensie de carbune activ, se realizeaza o dilutie de -/-0 a serului care se va mentine
30 minute la 456&)
- se realizeaza dilutiile de ser si se repartizeaza in tuburile de reactie (ser in dilutii
succesive) impreuna cu ,#+ (in cantitate constanta, cite 0,4 ml/tub)9 combinarea
serului de cercetat cu ,#+ reprezinta prima etapa a reactiei9
- se agita tuburile pentru omogenizare si se mentin -4 minute la 3D 6&
- urmeaza a doua etapa a reactiei A,#+, respectiv adaugarea suspensiei de hematii
(4H), cite 0,4 ml in fiecare tub
- se agita pentru omogenizare si se incubeaza timp de 84 minute la 3D 6&
- se centrifugheaza tuburile timp de - minut (-400 rotatii/ minut) si se mentin pina a
doua zi la 8 6&
- interpretare: pornind de la o dilutie initiala a serului de -/-0, dupa adaugarea tuturor
reactivilor titrul (numarul de unitati A,#+) va fi -?, 40 in tubul urmator, -00, -?4,
-55, ?40, 333 etc in tuburile urmatoare. 2itrul reactiei A,#+ este dat de cea mai mare
dilutie de ser la care lipseste complet hemoliza. !aloarea normala este de ?00- ?40
unitati A,#+.
9tili"area R#5 in profila7ia si tratamentul unor boli infectioase
Vaccinarea in scopul obtinerii unei protectii prin seroneutrali"are
!accinul "2% include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) in faza ;, combinata
cu anatoxina difterica si tetanica. %rimovaccinarea se incepe cu virsta de ? luni a nou-
nascutului, administrindu-se 3 doze la interval de ? luni (la ?, 8, 5 luni). %entru
mentinerea imunitatii se practica revaccinarea ; la 5 luni de la primo-vaccinare, iar
revaccinarea a ;;-a se practica la 35 luni de viata a copilului respectiv.
'1aluarea eficacitatii 1accinurilor
,e recomanda testarea starii de imunitate indusa prin vaccinare9 metodele au la baza
titrarea Ac anti-toxina (difterica, tetanica) in seruri prelevate de la copii vaccinati. ,e
considera ca un copil este prote(at (prezinta rezistenta specifica in cazul unei infectii
difterice) daca titrul Ac-anti toxina difterica este mai mare de 0,03 /A;/ ml (/A; .
unitate anti-toxica internationala)
,e pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica daca persoana investigata
este sau nu prote(ata fata de o anumita infectie prin ;"R. ;"R "ic* permite testarea
susceptibilitatii fata de scarlatina (toxina este elaborata de catre streptococul de grup A
lizogenizat). ;"R ,chic* permite testarea susceptibilitatii fata de difterie (toxina este
elaborata de catre bacilul difteric lizogenizat.
2ehnica:
,e in(ecteaza in treimea medie a antebratului, strict intradermic o cantitate de 0,- ml
toxina diluata corespunzator. ;n cazul in care in singele persoanei testate se gaseste o
cantitate de Ac anti-toxina mai mare de 0,03 /A;/ ml, toxina inoculata va fi neutralizata
si nu va aparea nicio modificare la locul inocularii (lipsa eritemului semnifica faptul ca
persoana testata nu este susceptibila sa faca difterie, in cazul in care se infecteaza cu un
bacil difteric toxigen). ;n cazul in care persoana respectiva nu prezinta Ac anti-toxina
difterica, Ag inoculat va conduce la aparitia unui eritem la locul de inoculare.
3erapia sau profila7ia specifica (imunoterapie pasi1a!
administrarea de ;g specifice omologe, obtinute de la persoane imunizate (natural
sau artificial) fata de o anumita boala infectioasa9 de exemplu in imunoterapia
infectiei cu &lostridium tetani (tetanos) se pot administra im 3-5.000 /A;
administrarea de seruri imune heterologe, obtinute prin hiperimunizarea cailor, in
tratamentul tetanosului, difteriei, botulismului
2erapia bolilor in care mecanismul patogenic implica exotoxine trebuie instituita cit mai
rapid, deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci cind se gasesc in circulatie.