Lucrarea nr.

8
Refractometrie. Metode fizice de evaluare a proteinelor din serul
sanguin
Aceast lucrare practic i propune s v prezinte o metod de rutin care se
pot aplica n orice laborator medical n scopul obinerii unor date eseniale
asupra proteinelor.
1. Date teoretice: refractometrie
Refracia luminii este fenomenul de schimbare brusc a direciei de
propagare a luminii la limita de separare a dou medii transparente cu indice de
refracie diferit.
Dac unghiul de refracie este mai mic dect unghiul de inciden, spunem c
mediul al doilea este refrigent dect primul.
egile care stau la baza fenomenului de refracie v sunt cunoscute.
Reamintim doar formularea matematic a legii a doua a refraciei!
unde " indicele de refracie relativ al celui de#al doilea mediu fa de primul
$fig.%&.
Fig.1. Refracia luminii la trecerea dintr#un mediu cu indice de refracie
mai mic n unul cu indice de refracie mai mare
'e consider cazul n care lumina trece dintr#un mediu optic mai dens n
unul mai puin dens, ca n figura (. 'e observ c mrind progresiv valoarea
unghiului de inciden, se a)unge la situaia n care unghiul de refracie are
valoarea ma*im de . +aloarea unghiului de inciden pentru care unghiul de
refracie este de se numete unghi limit $l&. ,entru orice valoare a
unghiului de inciden mai mare dect unghiul limit, l, lumina nu mai trece n
mediul al doilea, ci se reflect n punctul de inciden, fenomen denumit refle*ie
total. -n acest caz legea refraciei se poate scrie!
cum "%, se obine!
ceea ce arat c unghiul limit depinde numai de indicii de refracie ai
celor dou medii aflate n contact.
Fig.2. Refracia luminii la trecerea dintr#un mediu cu indice de refracie mai
mare n unul cu indice de refracie mai mic
+aloarea indicelui de refracie al unui mediu depinde de mai muli parametri!
.emperatura! creterea temperaturii produce la multe lichide organice
scderea indicelui de refracie/
ungimea de und a radiaiei care sufer fenomenului de refracie/
0oncentraia substanei respective n lichidul de cercetat/
+ariaiile obinuite ale presiunii atmosferice influeneaz foarte puin
valoarea indicelui de refracie, nct ea poate fi negli)at.
'tarea de agregare i densitatea mediului! creterea densitii produce o
cretere a indicelui de refracie, dup o relaie de forma!
unde r este un coeficient caracteristic pentru o substan dat i se numete
refracie specific. 1a nu depinde de condiiile e*terioare i nici de starea de
agregare a substanei.
-nmulind refracia specific cu densitatea unui corp obinem puterea
refringent a corpului respectiv.
,rodusul dintre refracia specific a unei substane i greutatea sa
molecular se numete putere refrigent molecular.
,uterea refrigent molecular a unui compus chimic este egal cu suma
puterilor refringente atomice ale elementelor din care este format molecula lui,
nmulite respectiv cu numrul de atomi de acelai fel. -n cazul compuilor
organici, legturile duble sau triple modific puterea refringent molecular,
deci aceast mrime depinde de structura chimic.
Msurarea prin refractometrie a concentraiei proteinelor totale din serul
sanguin
artea practic
'copul refractometriei este msurarea concentraiei unei substane. De
e*emplu, de interes medical este determinarea concentraiei proteinelor totale
din serul sanguin.
2etoda se bazeaz pe faptul c indicele de refracie variaz n funcie de
concentraia moleculelor din mediul refringent considerat, dup o ecuaie de
forma!
-n e*emplul de mai sus, dac n sngele integral ndeprtm prin coagulare
elementele figurate, vom obine serul sanguin. 3ndicele su de refracie depinde
numai de coninutul n proteine, deoarece ionii au o putere refringent foarte
mic. Aceasta nseamn c evaluarea concentraiei proteinelor din serul sanguin
se poate face msurnd fie indicele de refracie al lichidului biologic, fie unghiul
limit corespunztor. 0a urmare, e*ist dou tipuri de refractometre!
3. Refractometrul Abbe# a crui scal gradat permite citirea direct a
indicelui de refracie al lichidului de cercetat/
33. Refractometrul ,ulfrich# pe scala cruia se citete unghiul limit, care va
fi apoi transformat n indicele de refracie i concentraie de substan.
Fig.!. Refrectometrul ,ulfrich
$%4(%&
0onform principiului
reversibilitii razelor de lumin,
considerm un fascicul de radiaii
monocromatice care ptrunde n
mediul mai puin dens sub un unghi
de apro*imativ de . -n acest caz,
unghiul de refracie va avea
valoarea corespunztoare unghiului limit $l&.
egea a doua a refraciei se poate scrie!
Dar i" , iar r va fi nlocuit cu l/ n acest caz relaia se va scrie!
Dar sin "% i atunci relaia devine!
Aceasta este relaia fundamental pe care se bazeaz construcia i folosirea
refractometrelor. Din relaia precedent se observ c, msurnd valoarea
unghiului limit $l& i cunoscnd valoarea indicelui de refracie al sticlei $ &,
putem afla care este valoarea indicelui de refracie al mediului mai puin dens$
&.
Refractometrul Abbe $fig.%5& permite msurarea indicelui de refracie al
lichidelor cu precizie de ordinul .
Fig. 1". Refractometrul Abbe $AR6# 7russ 8ptronic&
,rile componente are refractometrului $fig.%%& sunt urmtoarele!
Fig. 11. 'chema refractometrului Abbe
%#ocular/ (,6# racorduri pentru termostatarea prismei de iluminare/ 9# urub
pentru reglarea compensatorului/ :,%%# racorduri pentru termostatarea prismei de
iluminare/ ;# urub pentru manevrarea scalei/ <# luneta/ =# tambur pentru
deschiderea blocului de prisme/ 4# sursa de iluminare a scalei/ %5# termometru/
%(# prisma de iluminare/ %6# lampa de sodiu/ %9# oglind
a&'istemul de prisme reprezint partea principal a aparatului, fiind
alctuit dintr#o prism de msur situat n partea inferioar i o prism de
iluminare. Ambele prisme sunt confecionate din sticl flint $n"%,<:&, au
dou fee de contact i formeaz un bloc paralelipipedic. >iecare prism
este fi*at ntr#o montur metalic prin care circul un curent de ap cu
temperatur constant, de la un termometru $%5& ataat la sistemul de
prisme.
-ntre planele prismelor se introduc %#( picturi din lichidul de cercetat, al
crui indice de refracie este mai mic dect indicele de refracie al prismelor.
+aloarea indicelui de refracie al prismelor reprezint limita superioar a scalei
de msur a aparatului. 'ursa de lumin utilizat este o lamp de sodiu situat n
faa prismei de iluminare, fcnd corp comun cu aceasta. Razele de lumin ce
provin de la surs sunt reflectate cu a)utorul oglinzii situat la partea inferioar a
prismelor. >aa de contact a prismei de iluminare este mat i difuzeaz lumina
care o strbate n toate direciile. Datorit refle*iei totale, razele care ptrund n
prisma de msur vor face cu normala la faa de contact a acesteia un unghi mai
mic sau egal cu unghiul limit.
b&uneta este alctuit dintr#un sistem de lentile convergente avnd rolul
de a capta razele care emerg din prisma de msur. -n cmpul vizual al
lunetei se observ o zon luminoas i una ntunecat $fig.%(&. limita de
separaie ntre cele dou zone corespunde razelor cu nclinare ma*im fa
de normala la suprafaa prismei. ,oziia acestei limite de separaie poate fi
modificat rotind urubul $;&.
Fig. 12. imita de separaie ntre zona luminoas i cea ntunecat
-n ocularul lunetei sunt fi*ate dou fire reticulare, perpendiculare ntre ele.
,entru determinarea indicelui de refracie, limita dintre zona ntunecat i cea
luminoas se aduce e*act la punctul de intersecie al firelor reticulare. -n partea
inferioar a cmpului vizual al lunetei se afl un fir reticular vertical n faa
cruia se deplaseaz o scal gradat n indici de refracie i o scal n procente
?ri* $fig.%6&. 'cala ?ri* este n direct corelaie cu indicele de refracie si
e*prim procentual cantitatea de substan solid dizolvat n %55 ml de ap.
0ele dou scale sunt iluminate cu a)utorul unei surse de lumin alb$4&/
Fig. 1!. 'cala refractometrului Abbe
a& 0ompensatorul este situat ntre blocul de prisme i lunet i este alctuit
din dou prisme Amici identice. 0ompensatorul are rol de a recombina
lumina dispersat n prisma de msur, obinndu#se o limit de separaie
net ntre zona ntunecoas i cea luminoas. 0ompensatorul se regleaz
n poziia corect rotind urubul $9&.
Mod de lucru
'e parcurg urmtoarele etape!
+erificarea e*actitii refractometrului Abbe #se face cu ap distilat al
crei indice de refracie la temperatura de este %,66(4.
0u a)utorul urubului $=& se deschide sistemul de prisme. >eele de
contact ale celor dou prisme. >eele de contact ale celor dou prisme
se cur cu o bucat de tifon umezit cu alcool i se las s se usuce/
0u o pipet ,asteur se aeaz pe suprafaa lucioas a prismei de
msur %#( picturi de ap distilat/
,rivind n ocularul lunetei se observ o zon ntunecat, una luminoas
i imaginea scalei. 'e regleaz poziia ocularului astfel nct imaginea
s fie clar/
0u a)utorul urubului $;& se aduce limita de separaie dintre cele dou
zone la punctul de intersecie al firelor reticulare.
'e rotete urubul $9& pn ce limita de separaie ntre cele dou zone
devine net/
'e citete valoarea indicelui de refracie de pe scal, n dreptul firului
vertical. ,entru temperatura de lucru, valoarea indicelui de refracie
msurat cu refractometrul Abbe trebuie s coincid cu cea din tabelul
(.
%. 'e terg prismele i se trece la msurarea indicelui de refracie al unui
fluid biologic, parcurgndu#se aceleai etape ca n cazul apei distilate.
+alorile indicelui de refracie citite pe scala refractometrului Abbe sunt
convertite n valori ale concentraiei proteinelor din ser $g@l& cu a)utorul
tab.(. Datele obinute se trec ntr#un tabel asemntor celui de mai )os!
Ar. Det. 3ndice de refracie 0oncentraia proteinelor $g@l&
%
(
6
Refractometrul clinic portabil $fig.%9& permite msurarea direct a
concentraiei de albumine din serul sanguin $g@dl& i a densitii urinii $g@ &.
Fig. 1#. Refractometrul clinic portabil
%# ,rism de msur
(# am transparent pentru protecie prismei
6# urub pentru regla)ul scalei
9# tub optic
:# ocular.
2od de lucru!
%. +erificarea e*actitii refractometrului !
se ndreapt refractometrul cu prisma spre o surs de lumin, astfel
nct, rotind urubul ocularului $:& s obinem o imagine clar a scalei
refractometrului/
'e ridic lama de protecie $(& i se depun cu o pipet din plastic %# (
picturi de ap distilat pe suprafaa prismei/
0u a)utorul urubului $6& se regleaz scala astfel nct linia de separaie
ntre zona luminoas i cea ntunecat s coincid cu reperul B $fig.
%:&/
Fig. 1$. 'cala refractometrului portabil
(. 'e ridic lama de protecie $(&, se terge uor suprafaa prismei cu hrtie
de filtru i se trece la msurarea concentraiei de albumine din serul
sanguin, parcurgndu#se aceleai etape ca n cazul apei distilate. imita de
separaie ntre zona luminoas i cea ntunecat va indica concentraia de
albumine din ser. -n acelai mod se procedeaz pentru msurarea
densitii urinii.
'cala pentru msurarea concentraiei de albumine este gradat pentru
temperaturi ntre :# 0, n diviziuni cu valoarea de 5,( g@dl, iar pentru
densitatea urinii diviziunea are valoarea de 5,55( g@ .