Lucrarea nr.

8
Refractometrie. Metode fizice de evaluare a proteinelor din serul
sanguin

Aceast lucrare practic i propune s v prezinte o metod de rutin care se

pot aplica n orice laborator medical n scopul obinerii unor date eseniale
asupra proteinelor.

1. Date teoretice: refractometrie

Refracia luminii este fenomenul de schimbare brusc a direciei de
propagare a luminii la limita de separare a dou medii transparente cu indice de
refracie diferit.
Dac unghiul de refracie este mai mic dect unghiul de inciden, spunem c
mediul al doilea este refrigent dect primul.
Legile care stau la baza fenomenului de refracie v sunt cunoscute.
Reamintim doar formularea matematic a legii a doua a refraciei:

unde
(fig.1).

= indicele de refracie relativ al celui de-al doilea mediu fa de primul

Fig.1. Refracia luminii la trecerea dintr-un mediu cu indice de refracie

mai mic n unul cu indice de refracie mai mare

Se consider cazul n care lumina trece dintr-un mediu optic mai dens n
unul mai puin dens, ca n figura 2. Se observ c mrind progresiv valoarea
unghiului de inciden, se ajunge la situaia n care unghiul de refracie are
valoarea maxim de

. Valoarea unghiului de inciden pentru care unghiul de

refracie este de

se numete unghi limit (l). Pentru orice valoare a

unghiului de inciden mai mare dect unghiul limit, l, lumina nu mai trece n
mediul al doilea, ci se reflect n punctul de inciden, fenomen denumit reflexie
total. n acest caz legea refraciei se poate scrie:

cum

=1, se obine:

ceea ce arat c unghiul limit depinde numai de indicii de refracie ai

celor dou medii aflate n contact.

Fig.2. Refracia luminii la trecerea dintr-un mediu cu indice de refracie mai

mare n unul cu indice de refracie mai mic

Valoarea indicelui de refracie al unui mediu depinde de mai muli parametri:

Temperatura: creterea temperaturii produce la multe lichide organice
scderea indicelui de refracie;
Lungimea de und a radiaiei care sufer fenomenului de refracie;
Concentraia substanei respective n lichidul de cercetat;
Variaiile obinuite ale presiunii atmosferice influeneaz foarte puin
valoarea indicelui de refracie, nct ea poate fi neglijat.
Starea de agregare i densitatea mediului: creterea densitii produce o
cretere a indicelui de refracie, dup o relaie de forma:

unde r este un coeficient caracteristic pentru o substan dat i se numete

refracie specific. Ea nu depinde de condiiile exterioare i nici de starea de
agregare a substanei.
nmulind refracia specific cu densitatea unui corp obinem puterea
refringent a corpului respectiv.
Produsul dintre refracia specific a unei substane i greutatea sa
molecular se numete putere refrigent molecular.
Puterea refrigent molecular a unui compus chimic este egal cu suma
puterilor refringente atomice ale elementelor din care este format molecula lui,
nmulite respectiv cu numrul de atomi de acelai fel. n cazul compuilor
organici, legturile duble sau triple modific puterea refringent molecular,
deci aceast mrime depinde de structura chimic.

Msurarea prin refractometrie a concentraiei proteinelor totale din serul

sanguin

Partea practic
Scopul refractometriei este msurarea concentraiei unei substane. De
exemplu, de interes medical este determinarea concentraiei proteinelor totale
din serul sanguin.
Metoda se bazeaz pe faptul c indicele de refracie variaz n funcie de
concentraia moleculelor din mediul refringent considerat, dup o ecuaie de
forma:

n exemplul de mai sus, dac n sngele integral ndeprtm prin coagulare

elementele figurate, vom obine serul sanguin. Indicele su de refracie depinde
numai de coninutul n proteine, deoarece ionii au o putere refringent foarte
mic. Aceasta nseamn c evaluarea concentraiei proteinelor din serul sanguin
se poate face msurnd fie indicele de refracie al lichidului biologic, fie unghiul
limit corespunztor. Ca urmare, exist dou tipuri de refractometre:
I. Refractometrul Abbe- a crui scal gradat permite citirea direct a
indicelui de refracie al lichidului de cercetat;
II. Refractometrul Pulfrich- pe scala cruia se citete unghiul limit, care va
fi apoi transformat n indicele de refracie i concentraie de substan.

Fig.3. Refrectometrul Pulfrich

(1921)

Conform
principiului
reversibilitii razelor de lumin,
considerm un fascicul de radiaii
monocromatice care ptrunde n
mediul mai puin dens sub un unghi
de aproximativ de
unghiul
valoarea corespunztoare unghiului limit (l).

de

. n acest caz,

refracie

va

avea

Legea a doua a refraciei se poate scrie:

Dar i=

Dar sin

, iar r va fi nlocuit cu l; n acest caz relaia se va scrie:

=1 i atunci relaia devine:

Aceasta este relaia fundamental pe care se bazeaz construcia i folosirea

refractometrelor. Din relaia precedent se observ c, msurnd valoarea
unghiului limit (l) i cunoscnd valoarea indicelui de refracie al sticlei (

),

putem afla care este valoarea indicelui de refracie al mediului mai puin dens(
).

Refractometrul Abbe (fig.10) permite msurarea indicelui de refracie al

lichidelor cu precizie de ordinul

Fig. 10. Refractometrul Abbe (AR3- Kruss Optronic)

Prile componente are refractometrului (fig.11) sunt urmtoarele:

Fig. 11. Schema refractometrului Abbe

1-ocular; 2,3- racorduri pentru termostatarea prismei de iluminare; 4- urub
pentru reglarea compensatorului; 5,11- racorduri pentru termostatarea prismei de
iluminare; 6- urub pentru manevrarea scalei; 7- luneta; 8- tambur pentru
deschiderea blocului de prisme; 9- sursa de iluminare a scalei; 10- termometru;
12- prisma de iluminare; 13- lampa de sodiu; 14- oglind

a)Sistemul de prisme reprezint partea principal a aparatului, fiind

alctuit dintr-o prism de msur situat n partea inferioar i o prism de
iluminare. Ambele prisme sunt confecionate din sticl flint (n=1,75), au
dou fee de contact i formeaz un bloc paralelipipedic. Fiecare prism
este fixat ntr-o montur metalic prin care circul un curent de ap cu
temperatur constant, de la un termometru (10) ataat la sistemul de
prisme.
ntre planele prismelor se introduc 1-2 picturi din lichidul de cercetat, al
crui indice de refracie este mai mic dect indicele de refracie al prismelor.
Valoarea indicelui de refracie al prismelor reprezint limita superioar a scalei
de msur a aparatului. Sursa de lumin utilizat este o lamp de sodiu situat n

faa prismei de iluminare, fcnd corp comun cu aceasta. Razele de lumin ce

provin de la surs sunt reflectate cu ajutorul oglinzii situat la partea inferioar a
prismelor. Faa de contact a prismei de iluminare este mat i difuzeaz lumina
care o strbate n toate direciile. Datorit reflexiei totale, razele care ptrund n
prisma de msur vor face cu normala la faa de contact a acesteia un unghi mai
mic sau egal cu unghiul limit.
b)Luneta este alctuit dintr-un sistem de lentile convergente avnd rolul
de a capta razele care emerg din prisma de msur. n cmpul vizual al
lunetei se observ o zon luminoas i una ntunecat (fig.12). limita de
separaie ntre cele dou zone corespunde razelor cu nclinare maxim fa
de normala la suprafaa prismei. Poziia acestei limite de separaie poate fi
modificat rotind urubul (6).

Fig. 12. Limita de separaie ntre zona luminoas i cea ntunecat

n ocularul lunetei sunt fixate dou fire reticulare, perpendiculare ntre ele.
Pentru determinarea indicelui de refracie, limita dintre zona ntunecat i cea
luminoas se aduce exact la punctul de intersecie al firelor reticulare. n partea
inferioar a cmpului vizual al lunetei se afl un fir reticular vertical n faa
cruia se deplaseaz o scal gradat n indici de refracie i o scal n procente
Brix (fig.13). Scala Brix este n direct corelaie cu indicele de refracie si
exprim procentual cantitatea de substan solid dizolvat n 100 ml de ap.
Cele dou scale sunt iluminate cu ajutorul unei surse de lumin alb(9);

Fig. 13. Scala refractometrului Abbe

a) Compensatorul este situat ntre blocul de prisme i lunet i este alctuit

din dou prisme Amici identice. Compensatorul are rol de a recombina
lumina dispersat n prisma de msur, obinndu-se o limit de separaie
net ntre zona ntunecoas i cea luminoas. Compensatorul se regleaz
n poziia corect rotind urubul (4).

Mod de lucru
Se parcurg urmtoarele etape:
Verificarea exactitii refractometrului Abbe -se face cu ap distilat al
crei indice de refracie la temperatura de

este 1,3329.

Cu ajutorul urubului (8) se deschide sistemul de prisme. Feele de

contact ale celor dou prisme. Feele de contact ale celor dou prisme
se cur cu o bucat de tifon umezit cu alcool i se las s se usuce;
Cu o pipet Pasteur se aeaz pe suprafaa lucioas a prismei de
msur 1-2 picturi de ap distilat;
Privind n ocularul lunetei se observ o zon ntunecat, una luminoas
i imaginea scalei. Se regleaz poziia ocularului astfel nct imaginea
s fie clar;
Cu ajutorul urubului (6) se aduce limita de separaie dintre cele dou
zone la punctul de intersecie al firelor reticulare.
Se rotete urubul (4) pn ce limita de separaie ntre cele dou zone
devine net;

 Se citete valoarea indicelui de refracie de pe scal, n dreptul firului

vertical. Pentru temperatura de lucru, valoarea indicelui de refracie
msurat cu refractometrul Abbe trebuie s coincid cu cea din tabelul
2.

1. Se terg prismele i se trece la msurarea indicelui de refracie al unui

fluid biologic, parcurgndu-se aceleai etape ca n cazul apei distilate.
Valorile indicelui de refracie citite pe scala refractometrului Abbe sunt
convertite n valori ale concentraiei proteinelor din ser (g/l) cu ajutorul
tab.2. Datele obinute se trec ntr-un tabel asemntor celui de mai jos:

Nr. Det.
1
2
3

Indice de refracie

Concentraia proteinelor (g/l)

Refractometrul clinic portabil (fig.14) permite msurarea direct a

concentraiei de albumine din serul sanguin (g/dl) i a densitii urinii (g/

).

Fig. 14. Refractometrul clinic portabil

1- Prism de msur
2- Lam transparent pentru protecie prismei
3- urub pentru reglajul scalei
4- tub optic
5- ocular.
Mod de lucru:
1. Verificarea exactitii refractometrului :
se ndreapt refractometrul cu prisma spre o surs de lumin, astfel
nct, rotind urubul ocularului (5) s obinem o imagine clar a scalei
refractometrului;
Se ridic lama de protecie (2) i se depun cu o pipet din plastic 1- 2
picturi de ap distilat pe suprafaa prismei;
Cu ajutorul urubului (3) se regleaz scala astfel nct linia de separaie
ntre zona luminoas i cea ntunecat s coincid cu reperul W (fig.
15);

Fig. 15. Scala refractometrului portabil

2. Se ridic lama de protecie (2), se terge uor suprafaa prismei cu hrtie

de filtru i se trece la msurarea concentraiei de albumine din serul
sanguin, parcurgndu-se aceleai etape ca n cazul apei distilate. Limita de
separaie ntre zona luminoas i cea ntunecat va indica concentraia de
albumine din ser. n acelai mod se procedeaz pentru msurarea
densitii urinii.
Scala pentru msurarea concentraiei de albumine este gradat pentru
temperaturi ntre 5-

C, n diviziuni cu valoarea de 0,2 g/dl, iar pentru

densitatea urinii diviziunea are valoarea de 0,002 g/