Potențialul de repaus al celulelor. Relația Nernst.

Relația
Goldman (GN)

1. Obiective

 Familiarizarea cu noţiunile de potenţial la echilibru al unui ion şi de potenţial

membranar de repaus;
 Realizarea de simulări care permit determinarea celor două potențiale pentru mai
multe tipuri de celule;
 Identificarea parametrilor importanţi pentru calculul potenţialelor Nerst şi
Goldman;
 Înţeleagerea importanței următorilor parametrii pentru calculul potenţialelor
Nernst şi Goldman:
i) concentraţia ionilor de Na+, K+ şi Cl- în compartimentul intracelular sau
extracelular,
ii) temperatura și
iii) permeabilitatea membranei pentru cele trei tipuri de ioni;
 Reprezentarea grafică a valorilor determinate;
 Observarea fenomenelor bioelectrice care apar la nivelul unei membrane
utilizând o membrană artificială:
i) Efectuarea cu succes a experimentului în condiții de siguranță;
ii) Dobândirea capacitații de a prepara soluții cu concentrații molare, diluții;
 Aplicarea relației Nernst pentru calculul potențialului de echilibru;
 Estimarea rapoartelor de permeabilitate ale unei membrane artificiale aplicând
relația Goldman.
2. Norme de protecţia muncii în laborator

Lucrarea nu necesită măsuri speciale de protecţie.

Pentru exercițiul A, activitatea va fi desfăşurată pe calculator, ceea ce implică

respectarea urmatoarelelor norme:

 Toate fişierele obţinute se vor salva în folderul indicat la începutul laboratorului;

 Se va evita salvarea de fişiere pe Desktop;
 Nu vor fi instalate programe descărcate de pe internet;
 Pentru transferul datelor nu se vor utiliza unităţi de stocare virusate;
 În caz de nevoie, calculatoarele vor fi restartate doar utilizând opţiunea „Restart”
din meniul „Start”;
 Calculatoarele vor fi stinse doar utilizând opţiunea „Shut down” din meniul
„Start”;
 În cazul în care restartarea sau oprirea calculatorului nu este posibilă utilizând
indicaţiile de mai sus, se va evita scoaterea din priză a calculculatorului sau realizarea
altor manevre care ar putea deteriora calculatorul.
În cadrul exercițiului B, se lucrează cu soluții pentru care nu sunt necesare măsuri
speciale de protecție. Trebuie avut grijă ca soluțiile stoc găsite pe bancul de lucru să nu
fie deversate. Pentru buna desfășurare a experimentului trebuiesc respectate
următoarele norme:
 Diluțiile se prepară în pahare Berzelius sau în pahare Erlenmeyer individuale;
 Se utilizează pipete pentru manipularea soluțiilor;
 În cazul utilizării pipetorului automat (salpeta), se aspiră soluția cu atenție, astfel
încât aceasta să nu ajungă în aparat;
 După încheierea experimentului, compartimentele cuvei Ussing, membrana
selectivă, pipetele, paharele și celelalte materiale utilizate se spală cu apă de la robinet
de mai multe ori și apoi se clătesc cu apă deionizată;
 În cazul pipetelor serologice se folosește pipetorul și apa deionizată pentru
curățarea lor;
 Se șterge masa de lucru.
 CASETA 5 – FENOMENE BIOELECTRICE IN MEMBRANELE
CELULARE
Fenomenele electrice sunt specifice tuturor celulelor vii. Acest fapt este datorat
prezenţei a numeroase tipuri de atomi şi molecule ionizate, deci cu sarcină electrică,
atât în citoplasma celulelor, cât şi în mediul extracelular. Permeabilitatea selectivă a
membranelor celulare împreună cu activitatea metabolică a celulelor contribuie la
menţinerea unor diferenţe de concentraţie ale moleculelor cu sarcină electrică în
mediul intracelular faţă de mediul extracelular. Astfel, o caracteristică de bază a
oricarei celule vii este existenţa unei diferenţe de potenţial între faţa externă şi faţa
internă a membranei celulare. Această diferenţă de potenţial se numeşte potenţial de
repaus (PR) şi are valori cuprinse între -50 mV şi -100 mV.

Pentru a înţelege potenţialul de repaus al celulelor este importantă înţelegerea

permeaţiei speciilor individuale de ioni. Ionii sunt purtători de sarcină extrem de
mobili, fiind capabili să difuzeze cu uşurinţă de pe o faţă a membranei pe cealaltă prin
intermediul proteinelor canal. Difuzia ionilor este dictată de gradienţii chimici
(diferenţa de concentraţie dintre cele două compartimente) şi electrici (diferenţa de
sarcină electrică dintre cele două compartimente). Relaţia dintre cei doi gradienţi este
descrisă cantitativ de ecuaţia Nernst:

𝑅𝑇 [𝑖𝑜𝑛]𝑒𝑥𝑡
𝐸𝑖𝑜𝑛 = 𝑙𝑛
𝑧𝐹 [𝑖𝑜𝑛] 𝑖𝑖𝑖

R- constanta gazelor ( 8,314 Joule ∙ K-1 ∙ mol-1)

T- temperatura în grade Kelvin (K=C0 +273)

F- constanta lui Faraday (cantitatea de sarcină electrică aflata într-un mol de

electroni = 96 485 coulomb ∙ mol-1)

z- valenţa ionului transportat

[𝑖𝑜𝑛]𝑒𝑥𝑡 - concentraţia ionului în exteriorul celulei (măsurată în mM)

[𝑖𝑜𝑛]𝑖𝑛𝑡 - concentraţia ionului în interiorul celulei (măsurată în mM)

Rezultatul aplicării ecuaţiei Nernst, 𝐸𝑖𝑜𝑛 (măsurat în mV) reprezintă potenţialul la
echilibru pentru respectivul ion şi, aşa cum arată ecuaţia, depinde doar de concentraţia
ionului în afara şi în interiorul celulei, de valenţa ionului şi de temperatură.

S-a observat ca membrana celulară nu are aceeaşi permeabilitate pentru toţi ionii. Din
acest motiv, speciile de ioni pentru care membrana este mai permeabilă vor influenţa
mai mult potenţialul membranar. Relaţia care integrează şi permeabilitatea membranei
pentru diferiţi ioni se numeşte relaţia Goldman-Hodgkin-Katz (adesea numită simplu
“ecuaţia Goldman”). Ecuaţia Goldman calculează un potenţial de membrană (𝐸𝑚 ,
măsurat în mV) care reflectă contribuţiile relative ale gradienţilor de concentraţie
chimică şi permeabilitatea relativă a membranei pentru K+, Na+ şi Cl-:

𝑅𝑇 𝑃𝑁𝑎 + [𝑁𝑎+]𝑒𝑥𝑡 + 𝑃𝐾 + [𝐾 +]𝑒𝑥𝑡 + 𝑃𝐶𝑙 − [𝐶𝑙 − ]𝑖𝑛𝑡

𝐸𝑚 = 𝑙𝑛 −]
𝑧𝐹 𝑃𝑁𝑎+ [𝑁𝑎+ ]𝑖𝑛𝑡 + 𝑃𝐾 + [𝐾 +]
𝑖𝑛 𝑡 + 𝑃𝐶𝑙 − [𝐶𝑙 𝑒𝑥𝑡

R- constanta gazelor (8, 314 Joule ∙ K-1 ∙ mol-1)

T- temperatura în grade Kelvin (K=C0 +273)

F- constanta lui Faraday (cantitatea de sarcina electrică aflată într-un

mol de electroni = 96 485 coulomb ∙ mol-1)

z- valenţa ionului transportat

[𝑁𝑎 + ]𝑒𝑥𝑡 - concentraţia ionului de Na+ în exteriorul celulei (măsurată în mM)

[𝑁𝑎 + ]𝑖𝑛𝑡 - concentraţia ionului de Na+ în interiorul celulei (măsurată în mM)

𝑃𝑁𝑎 + - permeabilitatea membranei pentru ionii de Na+

3. Materiale

Simulările din cadrul exercițiului A vor fi realizate utilizând:

 Calculatorul din Laboratorul din Biofizică.

 Programul „The NERNST/ GOLDMAN equation simulator”, dezvoltat de
Colegiul de Medicină din cadrul Universităţii din Arizona.
 Reprezentarea grafică a rezultatelor va fi efectuată utilizând Microsoft Office
Excel 2007.

pH-metru
Cuva Ussing

Pahar Berzelius
Pipetor automat (salpetă)

Pahar Erlenmeyer
 Figura NG1. Ustensile de laborator

Pentru realizarea exercițiului B sunt necesare următoarele aparate și substanțe:

 Cuva Ussing;
 Membrană permeabilă selectivă;
 Electrozi de tensiune;
 pH-metru sau osciloscop;
 Soluție stoc salină (NaCl și KCl) ;
 Apă deionizată;
 Pipetor automat (salpetă);
 Pipete serologice;
 Pahare berzelius sau pahare Erlenmeyer.

4. Tutoriale

4.1Exercițiul A - Programul „The NERNST/GOLDMAN equation

simulator”
va fi accesat utilizând executabilul ngswin.exe care se găseşte pe Desktopul
calculatoarelor din Laboratorul de Biofizică. Programul cuprinde patru module:

 Nernst: modulul este destinat calculului potenţialului la echilibru pentru ionii de K+,
Na+ şi Cl- şi permite modificarea concentraţiilor ionilor la exteriorul şi interiorul
celulei, precum şi temperatura.
 Nernst @37oC: modulul este destinat calculului potenţialului la echilibru pentru
ionii de K+, Na+ şi Cl- şi permite doar modificarea concentraţiilor ionilor la exteriorul
şi interiorul celulei, în timp ce temperatura este menţinută la 37o C.
 Goldman: modulul este destinat calculului potenţialului membranar utilizând
ecuaţia Goldman (Em). Acesta permite modificarea concentraţiilor ionilor la exteriorul
şi interiorul celulei, modificarea permeabilităţii membranei pentru aceşti
 ioni şi modificarea temperaturii. Potenţialul membranei este afişat pe fundal negru, în
dreapta, sus. Modulul afişează în acelaşi timp potenţialele la echilibru pentru cele trei
specii de ioni (EK, ENa şi ECl) în dreapta, jos, pe fundal roşu în cazul K+, albastru în
cazul Na+ şi verde în cazul Cl-.
 Goldman @37oC: are aceleaşi proprietăţi cu modulul Goldman, cu excepţia faptului
că temperatura este fixată la 37o C.

Modulele programului afişează ecuaţiile utilizate pentru calculul celor două potenţiale
şi explicaţii legate de acestea atunci când mouse-ul este trecut peste zona de interes.
În plus, programul permite vizualizarea variaţiei în timp a potenţialelor la echilibru şi
a potenţialului membranei.

Programul include parametrii impliciţi şi parametrii specifici pentru următoarele tipuri

de celule: celulă generică; fibră musculară scheletică; axon de calmar şi globulă roşie.
Atenţie: între seturile de măsurători în care variaţi anumiţi parametrii (sunt descrişi
mai jos) este obligatoriu să reveniţi la parametrii iniţiali ai tipului de celulă cu care
lucraţi.

Concentraţiile ionice

In cadrul modulului Goldman, fiecărui tip de ion (K+, Na+ şi Cl-) îi sunt asociaţi trei
cursori care permit modificarea permeabilităţii membranei pentru acel ion,
concentraţia ionului la exteriorul celulei şi concentraţia ionului la interiorul celului.
Concentraţiile ionilor pot fi variate între valorile de 1 mM şi 600 mM. Toate valorile
cursorului pot fi ajustate prin dublu click pe valoarea raportată în caseta cursorului şi
tastarea valorii dorite.

Valorile implicite sunt: pentru K+, 10 mM în exterior şi 100 mM în interior; pentru

Na+, 100 mM în exterior şi 10 mM în interior şi pentru Cl-, 100 mM în exterior şi 10
mM în interior. Aceste valori absolute nu sunt de aşteptat pentru nici un ţesut şi au
fost selectate pentru motive didactice (factori de 10 pentru a simplifica matematica
asociată cu logaritmii). Cu toate acestea, concentraţiile ionilor relevante din punct de
vedere fiziologic, în special cele intracelulare, sunt dificil de definit. Acest fapt se
 datorează nu numai dificultăţilor tehnice asociate măsurării concentraţiilor ionilor
intracelulari, ci şi faptului că, de obicei, fiecare tip de celulă menţine concentraţiile
intracelulare de ioni într-un interval de valori, care poate varia în funcţie de diferitele
condiţii fiziologice.
Permeabilitatea membranei

În modulul Goldman, permeabilitatea membranei faţă de ionul de interes poate fi

variată între valorile stabilite arbitrar de 1 la 10.000. Când programul rulează în modul
Nernst, cursorii pentru concentraţie sunt singurii care pot fi ajustaţi.
Temperatura

Cursorul pentru temperatură raportează valori în grade Celsius, însă valorile de

temperatură utilizate pentru calculul potentialelor Nernst sau Goldman sunt în grade
Kelvin.
Reprezentarea grafică a datelor

În funcţie de întrebările la care trebuie să răspundeţi, veţi înregistra potenţialele la

echilibru pentru ioni şi potenţialul membranei atunci când variaţi concentraţiile
ionilor, permeabilitatea membranei pentru aceştia sau temperatura.

Aceste date vor fi reprezentate grafic urmând paşii de mai jos:

 Deschideţi Microsoft Excel şi generaţi un fişier nou;

 Completaţi datele având grijă ca pe prima coloană să treceţi datele pentru parametrul
care a variat şi ca pe următoarele coloane să treceţi valorile potenţialelor determinate
în funcţie de acea valoare. Mai jos este un exemplu de tabel în care puteţi completa
valorile potenţialului la echilibru pentru Na+ (ENa) şi a potenţialului membranar (Em)
determinate atunci când variază concentraţia ionilor de Na+ la exteriorul celulei
([Na+]o):

[Na+]o (mM) ENa (mV) Em (mV)

 Selectaţi datele şi inseraţi un grafic de tip „Scatter” („Prin puncte”). Acest tip de
grafic permite asocierea datelor din prima coloană cu valori de pe axa Ox. Datele din
următoarele coloane vor fi asociate cu axa Oy şi vor fi reprezentate în funcţie de
valorile de pe prima coloană.
 Utilizaţi opţiunile din meniul „Layout” pentru a adăuga titlul graficului şi legendele
axelor. Nu uitaţi sa menţionaţi unităţile de măsură.

4.1.1. Identificarea diferenţelor dintre tipurile de celule

1. Deschideţi „ngswin.exe‟, modulul Goldman şi selectaţi pe rând diferitele tipuri de

celule.
2. Răspundeţi la întrebarea: Ce caracteristici se menţin constante între celula generică,
celula musculară scheletică şi globula roşie, dar diferă mult faţă de axonul de calmar?

 Care este explicaţia biofizică a diferenţelor dintre parametrii fibrei

musculare scheletice, a globulei roşii şi a axonului de calmar şi care este
importanţa
fiziologică?
4.1.2 Efectul variaţiei concentraţiilor ionilor la interiorul şi exteriorul celulei.

1. Alegeți caracteristicile celulei generice în modului Goldmann la 37 C°.

2. Menţinând restul valorilor constante, creşteţi concentraţia ionilor de Na+ în exteriorul
celulei ([Na+]o) din 10 în 10 pornind de la 1 mM până la 200 mM. Deschideți
programul Excel şi pentru fiecare valoare a [Na+]o considerată notaţi valorile
potențialului Nernst al Na+ şi a potenţialului Goldman. Trasaţi graficul variaţiei
celor două potenţiale în funcţie de concentraţia ionilor de Na+ în exteriorul celulei.
3. Menţinând restul valorilor constante, creşteţi concentraţia ionilor de K+ în exteriorul
celulei ([K+]o) din 10 în 10 pornind de la 1 mM până la 200 mM. Deschideti
programul Excel şi pentru fiecare valoare a [K+]o considerată notaţi valorile
potentialului Nernst al K+ şi a potenţialului Goldman. Trasaţi graficul
variaţiei celor două potenţiale în funcţie de concentraţia ionilor de K+ în exteriorul
celulei.
4. Menţinând restul valorilor constante, creşteţi concentraţia ionilor de Cl- în exteriorul
celulei ([Cl-]o) din 10 în 10 pornind de la 1 mM până la 200 mM. Deschideti
programul Excel şi pentru fiecare valoare a [Cl-]o considerată notaţi valorile
potentialului Nernst al Cl- şi a potenţialului Goldman. Trasaţi graficul variaţiei celor
două potenţiale în funcţie de concentraţia ionilor de Cl- în exteriorul celulei.
5. Procedaţi similar ca mai sus pentru a trasa graficul variaţiei potenţialului Nernst pentru
Na+ şi a potenţialului membranar atunci când variază concentraţia ionilor de Na+ la
interiorul celulei ([Na+]i). Consideraţi valori ale concentraţiei care cresc din 10 în 10
mM, începând cu 1 mM până la 200 mM.
6. Procedaţi similar ca mai sus pentru a trasa graficul variaţiei potenţialului Nernst pentru
K+ şi a potenţialului membranar atunci când variază concentraţia ionilor de K+ la
interiorul celulei ([K+]i). Consideraţi valori ale concentraţiei care cresc din 10 în 10
mM, începând cu 1 mM până la 200 mM.
7. Determinaţi şi reprezentaţi grafic potenţialul la echilibru pentru ionii de Cl- şi
potenţialul membranar atunci când variază concentraţia ionilor de Cl- la exteriorul
celulei ([Cl-]o). Consideraţi valori ale concentraţiei care cresc din 10 în 10 mM,
începând cu 1 mM până la 200 mM.
8. Determinaţi şi reprezentaţi grafic potenţialul la echilibru pentru ionii de Cl- şi
potenţialul membranar atunci când variază concentraţia ionilor de Cl- la interiorul
celulei ([Cl-]i). Consideraţi valori ale concentraţiei care cresc din 10 în 10 mM,
începând cu 1 mM până la 200 mM.

 Care este ionul care influenţează cel mai mult potenţialul membranar? De ce?

4.1.3. Efectul variaţiei temperaturii.

1. Alegeţi caracteristicile celulei generice în modului Goldman.

2. Trasati graficele variaţiilor potenţialelor Nernst pentru ionii de Na+, K+ şi Cl- şi a
potenţialelor Goldman în funcţie de temperdin 5 în 5 oC, începând cu 0 oC până la 50
°C.

4.1.4. Efectul variaţiei permeabilităţii membranei pentru ioni.

1. Alegeți caracteristicile celulei generice în modului Goldmann la 37 C°.

2. Trasaţi graficul potenţialului Goldman atunci când variază permeabilitatea
membranei pentru ionii de Na+. Consideraţi următoarele valori ale permeabilităţii: 0;
1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024; 2048; 4096; 8192 (scală logaritmică).
3. Trasaţi graficul potenţialului Goldman atunci când variază permeabilitatea
membranei pentru ionii de K+. Consideraţi următoarele valori ale permeabilităţii: 0;
1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024; 2048; 4096; 8192 (scală logaritmică).
4. Trasaţi graficul potenţialului Goldman atunci când variază permeabilitatea
membranei pentru ionii de Cl-. Consideraţi următoarele valori ale permeabilităţii: 0;
1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 512; 1024; 2048; 4096; 8192 (scală logaritmică).

 Variaţia permeabilităţii cărui ion determină cele mai mari modificări ale
potenţialului Goldman? De ce ?
 Ce consecinţe fiziologice are acest fapt asupra modificărilor tipice
de permeabilitate din celula neuronală?

4.2 Exercițiul B - Experiment cu o membrană artificială

În acest experiment se folosește cuva Ussing (Fig. NG2) pentru observarea

fenomenelor bioelectrice care apar la nivelul unei membrane permeabile.

Plasați membrana artificială (cation selectivă sau neselectivă după caz) în partea liberă
a unuia dintre compartimentele cuvei Ussing, după care atașați celălalt compartiment.
Camera se etanșeizează cu ajutorul a 4 șuruburi speciale care trebuiesc strânse
foarte bine.

1.Din soluțiile stoc de pe bancul de lucru se fac diluții de NaCl și KCl pâna la o
concentație de 5 mM (pentru fiecare soluție) într-un volum final de 80 mL.
2.Se consideră primul sistem în care între cele două compartimente există un gradient
de concentrație pentru NaCl. Adăugăm soluție NaCl 150 mM în primul
compartiment (exterior) și 5 mM NaCl în al doilea (interior). Cele două
compartimente sunt marcate. Cele două compartimente trebuiesc umplute la același
nivel (cuva este marcată). Se crează astfel, un gradient pentru ionii de Cl- și ionii de
Na+. Se măsoară rapid. După ce cuva a fost umplută, se pun electrozii în soluție
(unul pentru fiecare compartiment) și se conectează la pH-metru (setat pe mV) (ca în
figura de mai jos) sau la un osciloscop.

Figura NG2. Model experimental

3.Se consideră primul sistem în care între cele două compartimente există un gradient
de concentrație pentru NaCl. Adăugăm soluție KCl 150 mM în primul compartiment
(exterior) și 5 mM KCl în al doilea (interior). Cele două compartimente
sunt marcate. Cele două compartimente trebuiesc umplute la același nivel (cuva este
marcată). Se crează astfel, un gradient pentru ionii de Cl- și ionii de Na+. Se măsoară
rapid. După ce cuva a fost umplută, se pun electrozii în soluție (unul pentru fiecare
compartiment) și se conectează la pH-metru (setat pe mV) (ca în figura de mai jos)
sau la un osciloscop.
 Figura NG3. Apariția diferenței de potențial în urma difuziei ionilor

Conform legilor difuziei va aparea un flux de substanță în sensul gradientului de

concentrație, dinspre compartimentul 1 inspre 2.
4.Observăm prin citirea pe aparat modificările de tensiune. Acesta este un potențial de
difuzie. Potențialul de difuzie scade în timp, pe măsură ce potențialul seegalizează.
Notați valorile și momentul în timp cu ajutorul unui ceas. (t1,/V1, t2,/V2, tn/Vn etc.).
5.Figurați pe un grafic valorile potențialului în decursul a 45 de minute.
6.Se ajunge în final la o stare staționară corespunzătoare unui potențial de echilibru
(valoarea potențialului de difuzie nu se mai modifică). Notați potențialul final obținut.
7.Calculați utilizând relația lui Nernst potențialul de echilibru al ionului de Na+pentru
concentrațiile date.

 În cazul în care membrana ar fi permeabilă pentru amândoi ionii, ce

rezultat scontați că trebuie să obțineți?
8.Folosiți și alte concentrații de NaCl și verificați relația lui Nerst.
9.Repetați eperimentul și măsurătorile pentru soluțiile de KCl (punctele 2->7).
10.Comparați datele obținute la acest experiment cu cele de la exercițiul A, în care
calculele se fac teoretic. Explcați diferențele, dacă acestea există.
1. În cazul celui de al doilea sistem punem în primul compartiment soluție de 150NaCl
și în al doilea soluție de KCl 150 mM. Se crează un gradient de concentrație pentru ionii
de Na+ și de K+. Care este valoarea potențialului? Explicați rezultatul.
12. Schimbați filtrul selectiv și observați modificările de potențial în cazul acesta.
 Definiți termenul de permeabilitate membranară.

5. Aplicaţii practice

Ecuaţia Nernst este utilă pentru determinarea potenţialului la echilibru pentru un

anumit ion atunci când se cunoaşte concentraţia ionului la interiorul şi în exteriorul
celulei. Semnul potenţialului la echilibru oferă informaţii asupra direcţiei în care se
desfăşoară pasajul ionilor: potenţialele pozitive arată că ionii vor difuza din exteriorul
celulei spre interior şi potenţialele negative arată că ionii vor difuza din interiorul
celulei spre exterior. Diferenţa dintre potenţialul membranar şi potenţialul la echilibru
pentru acel ion este direct proporţională cu intensitatea curentului ionic datorat
pasajului acelui ion.

Ecuaţia Goldman poate fi utilizată pentru estimarea rapoartelor de permeabilitate

atunci când sunt cunoscute concentraţiile ionilor şi potenţialul membranar.
Permeabilitatea membranei pentru ioni este asociată cu numărul de canale ionice
deschise, deci disponibile pentru pasajul ionilor. Modificări majore de permeabilitate
au loc în timpul potenţialului de acţiune. Inţelegerea legăturii dintre permeabilitatea
membranei pentru ioni şi potenţialul membranar permite înţelegrea:

- depolarizării membranei atunci când se deschid un număr mare de canale de sodiu

dependente de voltaj care permit intrarea masivă a Na+ in celula şi declanşează
potentialul de actiune;

- repolarizării şi hiperpolarizării membranei atunci când se deschid canalele de K+

dependente de voltaj.