1

LP IMUNOLOGIE INTRODUCERE REACTII AG-AC IMUNOSEROLOGIE REACTIE AG-AC = asociere intre cele 2 molecule prin legaturi necovalente; aceasta reactie nu determina modificari chimice ireversibile in nici una dintre cele 2 molecule. Ac = receptor specific, solubil pentru un anume Ag. Legaturile necovalente (legaturi de hidrogen, legaturi ionice, legaturi hidrofobe, reactii van der Waals ) intre cele Ag si Ac se realizeaza intre epitopul antigenului ( determinantul antigenic ) si CDR ale regiunilor variabile ale lanturilor H si L ale Ig (VH si VL ) ( CDR = complementarity-determining regions, regiuni de determinare ale complemetaritatii ). Aceste legaturi necovalente sunt relative slabe (comparativ cu cele covalente) si se realizeaza daca moleculele se afla la distante mici una fata de cealalta; astfel ca o legatura puternica intre Ag si Ac depinde de o potrivire intre domeniile Ac si Ag = o complemetaritate care sa asigure aceasta distanta mica si care sa asigure realizarea unui numar mare de asfel de legaturi. Aceasta complemetaritate intre Ac si Ag determina specificitatea legaturii. Legaturile intre Ag si Ac nu sunt ireversibile. Reactia Ag-Ac poate fi influentata de mai multi factori: Afinitatea, aviditatea Ac fata de Ag Titrul Ac Concentratia Ag; starea Ag: Ag solubile/corpusculate Conditii de mediu: pH, temperatura AFINITATEA = puterea combinata a legaturilor necovalente intre un singur Fab al Ac si un singur determinant antigenic/epitop al Ag. Reactia dintre Ac si Ag este cu dublu sens, asociere si disociere: Asocierea intre Ac si Ag poate fi descrisa de : Unde este constanta ratei de asociere; unitatea de masura a Iar disocierea legaturilor intre Ac si Ag: este l/mol/s

Unde este constanta ratei de disociere, unitate de masura 1/s Constanta de asociere se noteaza cu Ka care este k/k; Ka poate fi calculate si din ecuatia:

Ka este o masura a afinitatii; cu unitatea de masura l/mol (M); poate fi masurata prin dializa de echilibru:
Se foloseste o camera de dializa - un vas separat egal in 2 compartimente printr-o membrana semipermeabila. Proba de control: intr-un compartiment se pune Ag (haptena) marcata radioactiv, care poate trece liber prin membrana; astfel concentratia Ag si respectiv radioactivitatea se echilibraza intre cele 2 compartimente. Proba in care se evalueaza afinitatea unui Ac: intr-un compartiment se pune Ac, in celalalt Ag marcat; Ag va trece liber in celalalt compartiment si o parte se va lega de Ac; Ag ramas liber se va echilibra de o parte si alta a membranei; diferenta de radioactivitate(= de concentratie a Ag) intre cele 2 compartimente e data de Ag legat de Ac. Cu cat afinitatea Ac e mai mare, cu atat cantitatea de haptena marcata legata va fi mai mare.

2 K poate fi dedusa aici din ecuatia:

Unde r = ratia de haptena legata de Ac/concentratia totala de Ac, c = concentratia de haptena libera, iar n = nr. de situsuri de legare/molecula de Ac; se folosesc cantitati variabile de haptena la concentratii costante de Ac pentru calcul.

Reactia de disociere: Constanta de disociere: ; cu unitatea de masura a Kd de mol/l (M)

AVIDITATEA = suma afinitatilor intre situsurile de legare ale Ac si toti determinantii Ag pe care ii leaga. Este o masura mai buna de evaluare a capacitatii de legare a Ac in vivo. Aviditatea crescuta poate compensa pentru o afinitate scazuta: ex. IgM au afinitate mai scazuta de cat IgG dar avand mai multe situsuri de legare ( in forma lor pentamerica ) pot lega eficient Ag. SPECIFICITATE = Ac recunoaste in mod ideal un singur tip de antigen fata de care are complementaritate. CROSS-REACTIVITATE = in practica, uneori, un Ac[1] poate recunoaste un alt Ag[2] decat cel specific(Ag[1]), daca acest Ag[2] are un epitop identic sau asemanator cu Ag[1]. *De obicei aviditatea Ac[1] pentru Ag[2] este mai mica decat pentru Ag[1]. Evidentierea reactiei Ag-Ac: Reactii de precipitare Reactii de aglutinare Reactii de fixare a complemetului Reactii de neutralizare Reactii cu liganzi marcati IMUNOSEROLOGIA =domeniul imunologiei care studiaza reactiile Ag-Ac in vitro Aplicatii diagnostice: serotipie; dg imunologic. Componente esentiale ale reactiilor serologice Ag, Ac Ag Se utilizeaza pentru: - imunizarea animalelor de laborator in scopul obtinerii serurilor imune - reactii imune de serodiagnostic. Metode de preparare a Ag: Purificarea Ag prin electroforeza - SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) cu transfer ulterior pe nitroceluloza; dificil de extras proteinele de pe nitroceluloza;

necesita reactivi de disociatie puternici si care pot contamina Ag; daca acest Ag este ulterior utilizat pentru imunizarea animalului de experienta pot apare reactii adverse importante la acesta din cauza reactivilor de disociere. Purificarea Ag prin affinity chromatography: principiul metodei: Ac specific antigenului este fixat pe particule sintetic(e de Sepharose); aceste particule de sefaroza cu Ac specifici-Ag fixati se amesteca cu solutia in care se gaseste si Ag de extras; Ag se va fixa pe Ac, respectiv pe particulele de sefaroza; restul solutiei se va spala; ulterior legaturile Ag-Ac se rup prin modificarea pH-ului mediului. Producere de epitopi (peptide)/?Ag prin ADN recombinat in culturi de celule. Serurile imune Se pot obtine: - de la pacienti (bolnavi/convalescenti) - prin imunizarea animalelor (animale mari pentru utilizare pe scara larga, comercializare; de la animale mici pentru cercetare) Se folosesc pentru teste diagnostice, cercetare, terapie. Se pot obtine seruri policlonale/monoclonale: Ac/seruri POLICLONALI/e = prin imunizarea (unui animal de experienta) cu un Ag se obtine de obicei un ser policlonal = care contine mai multe tipuri de Ac, fiecare din ei specific pentru unul din mai multi determinanti antigenici al Ag respectiv. Serurile policlonale pot fi monospecifice = mai multi Ac impotriva a diversi epitopi ai aceluiasi Ag/polispecifice =pentru mai multe Ag Ac/seruri MONOCLONALI/e = Ac impotriva unui singur tip de epitop, secretat de o singura clona de LB; se folosesc pentru: - teste diagnostice - tehnici de cercetare - terapia unor afectiuni cum ar fi poliartrita reumatoida, diverse tipuri de tumori. Tehnica de obtinere a acestora in laborator: celule numite hybridomas = rezultate din fuziunea unei celule normale secretante de Ig (prelevate de la un animal imunizat in prealabil cu Ag specific) si celule tumorale de mielom multiplu; acesti hibrizi, spre deosebire de plasmocitele normale cresc si se inmultesc pe medii de cultura si pot avea o viata lunga; prin procese de selectie se obtine o clona care produce 1 singur tip de Ac. Avantaje/dezavantaje seruri poli/monoclonale: Daca epitopul specific unui Ac monoclonal a fost denaturat in cursul procesului de purificare, el nu va mai fi recunoscut de serul monoclonal. Folosirea unui ser policlonal, cu Ac care recunosc mai multi epitopi ai aceluiasi Ag e mai putin probabil sa fie afectata de aceasta conditie. Pentru a fi eficient un ser policlonal trebuie sa fie cat mai putin contaminat de Ac nenecesari si de o specificitate inalta. Un ser monoclonal obtinut dintr-un anume hybridom are proprietati standard in ceea ce priveste structura, specificitatea, afinitatea. Serurile policlonale variaza intre ele in ceea ce priveste specificitatea, afinitatea, aviditatea.