1

LP IMUNOLOGIE REACTII DE AGLUTINARE IMUNA

= reactii Ag-Ac vizualizate prin formarea de aglutinari ale Ag particulate de catre Ig; aglutinarea rezulta din cross-linkarea particulelor Ag de catre Ac. Avantaje: sunt relativ usor de realizat din punct de vedere tehnic, unele foarte rapide, sunt relativ sensibile si specifice. Se folosesc:  Ac = Aglutinina = Ac care produce aglutinarea Ag  Ag: I) Ag corpusculate/particulate natural : celule = aglutinarea directa Ag corpusculat poate fi o hematie, o bacterie s.a. II) Poate fi utilizata si pentru Ag solubile care sunt adsorbite pe suprafata unei hematii sau pe particule de latex = aglutinare pasiva Cand Ag corpusculat este hematia/ cand epitopul este situat pe hematie se foloseste termenul de hemaglutinare. Se pot utiliza pentru detectia unui Ag necunoscut intr-un lichid biologic (ser, LCR, etc.) folosindu-se seruri diagnostice cu Ac cunoscut; sau se pot utiliza pentru evidentierea unui Ac intr-un lichid biologic folosindu-se un Ag particulat cunoscut. Pot fi calitative sau semicantitative (titrul Ac serici). Se pot efectua in tuburi/ pe lame/ pe microplaci iar reactia Ag-Ac este vizualizata prin formarea de mici agregate (vizualizate macroscopic sau microscopic, in functie de tehnica). Factori care influenteaza reactia de aglutinare: a) Tipul de Ig folosite: IgM sunt aglutinine mult mai eficiente prin forma lor pentamerica b) Excesul de Ac in reactie poate inhiba aglutinarea = efect prozone = la concentratii mari de Ac, situsurile de legare ale acestora depasesc numeric epitopii care pot fi legati astfel incat probabilitatea ca un Ac sa se lege doar la un situs de legare este foarte mare; daca Ac se leaga doar printr-un situs de legare el nu poate produce aglutinare; acest lucru se probeaza prin cresterea dilutiei solutiei in care se gasesc Ac: la concentratii mai mici de Ac se va produce aglutinarea. c) In serurile policlonale care contin mai multi IgG decat IgM aglutinarea poate fi scazuta/absenta din cauza legarii a unei mai mari cantitati de Ag de catre IgG care este mai slab aglutinant decat IgM (leaga mai greu 2 epitopi de pe particule diferite, mai ales vorba de eritrocite sau alte celule care se resping fiind incarcate electric la suprafata; insa daca se realizeaza conditii specifice, ex. modificarea concentratiei de ioni din solutie a.i. sa scada fortele de respigere dintre hematii si aceste Ig pot deveni aglutinanti). d) O limitare a reactiei de aglutinare apare in cazul unor epitopi ascunsi in buzunare membranare ale Ag corpusculat (bacterie de ex.). e) Temperatura la care se realizeaza reactia f) Miscarea tubului/ centrifugarea g) pH-ul mediului HEMAGLUTINAREA IMUNA A) Hemaglutinare directa = se folosesc hematiile cu epitopii proprii de suprafata; aglutinarea e realizata de Ac care interactioneaza cu epitopii hematiei. B) Hemaglutinare pasiva = Ag solubile (care nu apartin hematiei prorpiu-zise) sunt adsorbite pe hematii

C) Hemaglutinare indirecta = aglutinarea nu e realizata de Ac care interactioneaza cu epitopii de pe hematie, ci de Ac secundari, care recunosc si leaga Ac primari. A) HEMAGLUTINAREA DIRECTA Se foloseste pentru determinarea grupelor de sange. Sistemul antigenic eritrocitar ABO (ABH) Ag H gena pe cr. 19 Gena A, B,O pe cr. 9 alela A si alela B codifica pentru diverse glicozil-transferaze care transfera variate tipuri de molecule de monozaharide pe o substanta precursoare = Glu-Gal-NAGA-Gal. Alela O este este o alela silentioasa care lasa Ag H nemodificat. Aceste polizaharide care se formeaza sunt intens imunogene. Ag H = glicoproteina/glicolipid membranar-Glu-Gal-NAGA-Gal-Fuc Ag A = glicoproteina/glicolipid membranar -Glu-Gal-NAGA-Gal -Fuc - NAGA Ag B = glicoproteina/glicolipid membranar -Glu-Gal-NAGA-Gal -Fuc -Gal Glu= glucoza Gal= galactoza NAGA= N-acetil-glucozamina Fuc = fucoza Transmiterea genelor ABO se face mendelian. Grup de sange O = ambele alele de tip O Grup de sange A = alele AA sau AO 2 subtipuri: A1 (~80% din toote persoanele de grup A) reactioneaza cu un Ac-anti A1; si A2 nu reactioneaza cu Ac anti-A1; atat A1 cat si A2 reactioneaza cu Ac anti-A Grup de sange B = alele BB sau B Grup de sange AB = alele AB Grup hh (Bombay) = lipsa homozigota de alela H normala; pacientii nu au Ag H; chiar daca au alele functionale A sau B , celulele lor nu expima nici Ag H deci nici Ag A sau Ag B. Exista si alte celule care exprima Ag din grupul ABO pe suprafata lor (in special celule epiteliale si endoteliale). Exista posibilitatea sa se excrete in unele secretii (saliva) aceste Ag la indivizii secretori. Ac anti-A si/sau anti-B apar ca urmare a cross-imunizarii cu Ag bacteriene ( enterobacteriaceae ) care poseda in membrana externa oligozaharide similare cu antigenele A si B. Se vor dezvolta Ac (in general de tip IgM; persoanele de grup O pot dezvolta si IgG) impotriva Ag care lipsesc de pe membrana hematiei gazdei ( clonele care produc Ac anti-Ag gazdei sunt deletate in cursul procesului de toleranta ). Grup Ag Ac-antiA O H + A A B B + AB A+B *** pacientii cu grup hh dezvolta Ac anti-A, anti-B si chiar anti-H. Ac anti-B + + -

Pentru aflarea grupei ABO a pacientului se pun in contact hematiile pacientului cu ser anti-A, anti-B, respectiv anti-A+B (test Beth-Vincent): Grupul pacientului + ser anti-A O (-) hemaglutinare A (+) B (-) AB (+) ***pacientii cu grup hh se comporta ca cei de grup O. + ser anti-B (-) hemaglutinare (-) (+) (+) + ser antiA+B (-) hemaglutinare (+) (+) (+)

Test Simonin: serul pacientului se pune in contact cu hematii care contin antigene: H, A, B,A+B: Grupul de sange al pacientului O Ac prezenti in serul pacientului In contact cu hematii care au Ag de suprafata O(H) (-)hemaglutinare In contact cu hematii care au Ag de suprafata A (+)hemaglutinare In contact cu hematii care au Ag de suprafata B (+)hemaglutinare (+) (-) (-)

anti-A anti-B A anti-B (-) (-) B anti-A (-) (+) AB (-) (-) ***pacientii cu grup hh prezinta aglutinare cu toate tipurile de hematii folosite in test

Pentru transfuzii, grupele pot primi sange izogrup; toate grupele pot primi grup O; grupul AB poate primi sange de la toate grupele: transfuzie de la grup donor Grup primitor Grup O Grup A Grup B Grup O DA NU NU Grup A DA DA NU Grup B DA NU DA Grup AB DA DA DA *** pacientii cu grup hh nu pot primi sange decat de la alte persoane de grup hh.

Grup AB NU NU NU DA

 Transfuzie de sange incompatibil grup ABO: Ex transfuzie de sange grup B la un pacient grup A: IgM anti-A prezenti in sangele pacientului vor recunoaste Ag B de pe suprafata hematiilor donorului si vor declansa liza hematiilor intravascular prin activarea cascadei complemetului cu formare de MAC. Manifestari clinice si paraclinice(se dezvolta rapid de la momentul transfuziei): stare de rau, febra, frisoane, dureri lombare, hemoglobinemie, hiperbilinemie neconjugata, hemoglobinurie, necroza tubulara renala ( prin precipitarea unei cantitati mari de Hb care ajunge la nivelul tubilor contorti; +/insuficienta renala), soc. Grup Rh Sistemul antigenic Rh = proteine transmembranare, exprimate strict pe membrana eritrocitelor; codificate de 2 gene: RhD si RhCE ( situate pe cr. 1 ). Gena RhD, alela D codifica pentru proteina D. (alela d = lipsa codificarii Ag D) Gena RhCE codifica proteinnele C/c si E/e. Exista variate subtipuri de proteine si combinatii.

Lipsa expresiei pe hematii a Ag D = Rh (-) Daca Ag D este exprimat = Rh (+). Lipsa (codificata genetic) a unei proteine (ex. D) apartinand acestui grup face ca, in urma expunerii persoanei respective la eritrocite care au exprimata pe suprafata lor Ag D, in sangele primitorului sa apara Ac antiD. Acesti Ac sunt din clasa IgG. Expunerea la hematii Rh(+) a unei persoane Rh(-) se poate face in urma transfuziilor, sau in urma sarcinii: femei Rh(-) cu fat Rh (+). Transfuzii cu sange Rh(+) la persoane cu Rh (-) Se dezvolta Ac anti-D. La transfuzii repetate cu Ac anti-D vor reactiona cu Ag D de pe hematiile Rh(+) ale donorului si vor opsoniza aceste hematii, care vor fi recunoscute de Mf splenice si indepartate din circulatie. Semnele apar de obicei la cateva zile dupa transfuzie: febra si anemie hemolitica ( extravasculara). Mame Rh(-) cu fat Rh(+) Daca mama nu a fost anterior imunizata prin transfuzii de sange Rh(+), ea va dezvolta Ac anti-D in cursul primei sarcini, cand va fi expusa la eritrocitele fatului ( mai ales in timpul nasterii, cand se separa placenta de peretele uterin, o cantitate din sangele fetal ajunge in circulatia materna). Se formeaza initial IgM care reactioneaza cu eritrocitele fetale ajunse in circulatia materna; apoi IgG ( LB cu memorie). La urmatoarea sarcina IgG anti-D din sangele matern pot traversa placenta si ajung in sangele fatului si afecteaza eritrocitele fatului care dezvolta anemie forme variate, de la usoara la severa cand riscul de moarte intrauterina a fatului e crescut. Post-partum in cazurile de hemoliza severa la fat apare exces de bilirubina indirecta, lipofila, care se poate depune la nivelul structurilor cerebrale, cu afectarea acestora. Preventia aparitiei Ac anti-D la femeia insarcinata se realizeaza prin administrarea cu ~ 48 ore inaintea nasterii /avortului/amniocentezei unei doze de Ig anti-D care vor reactiona cu eritrocitele fetale si impiedica reactia materna la acestea. B) HEMAGLUTINAREA PASIVA Hematiile sunt tratate cu acid tanic sau clorura de crom ( care promoveaza adsorbtia Ag pe membrana hematiei), dupa care se amesteca cu o solutie ce contine un Ag solubil, Ag care va fi ulterior adsorbit pe suprafata hematiei. Serul pacientului care contine sau nu Ac specific pentru Ag adsorbit se pune in contact cu hematiile asfel tratate. Daca serul pacientului contine Ac se observa aglutinarea. C) HEMAGLUTINAREA INDIRECTA TESTUL COOMBS = testul antiglobulinei y TESTUL COOMBS DIRECT = detecteaza prezenta pe hematiile pacientului a Ac anti-hematie si sau/a complementului. Se folosesc hematiile pacientului si un ser anti-Ig umana/ ser anti complement uman Daca hematiile pacientului au pe suprafata lor Ac anti-hematie si sunt puse in contact cu ser anti-Ig umana atunci Ac anti-hematie sunt recunoscuti de Ac anti-Ig umana si se produce aglutinarea. Daca hematiile pacientului au pe suprafata lor depuse componente ale complementului si sunt puse in contact cu ser anti-complement uman, atunci complemetul depus va fi recunoscut de Ac anti-complement uman si se produce aglutinarea hematiilor. y TESTUL COOMBS INDIRECT = detecteaza prezenta in serul pacientului a Ac anti-hematie liberi Se folosesc hematii normale (din alta sursa); serul pacientului; ser anti-Ig umana

Se incubeaza initial hematiile cu serul pacientului; daca serul pacientului contine Ac anti-hematie, acestia se vor depune pe suprafata hematiilor; ulterior se incubeaza hematiile cu serul anti-Ig umana; daca exista depusi Ac pe suprafata hematiilor, acestia sunt recunoscuti de Ac anti-Ig umnaa si se produce aglutinarea. Test Coombs (in)direct pozitiv = se produce aglutinarea. Se foloseste pentru diagnosticul AHAI; dar si pentru tipizarea grupelor de sange (testul Coombs indirect se pot evidentia prezenta Ac anti-A, anti-B, anti-D etc. mai important de evaluat in plasma primitorului); pentru evaluarea fetilor Rh(+) din mame Rh(-) ( se pot pune in evidenta IgG anti-D materni pe suprafata hematiilor fetale ). AGLUTINAREA BACTERIANA Met. tip Widal = detectarea Ac (in serul pacientului) Un pacient infectat cu o bacterie produce Ac specifici pentru determinanti Ag ai bacteriei respective. Din serul recoltat de la pacientul banuit infectat cu o anume bacterie se efectuaza dilutii seriate care se pun in contact cu bacteria respectiva. Daca pacientul prezinta infectia si Ac respectivi va apare aglutinarea bacteriana. In functie de cea mai mare dilutie la care apare aglutinarea se calculeaza titrul Ac aglutinanti ai pacientului; titrul se exprima ca inversul dilutiei respective; ex. daca aglutinarea apare la dilutie 1/320 si nu mai apare la dilutie 1/640 atunci titrul Ac aglutinanti este de 320; daca apare la dilutie 1/1280 si nu mai apare la dilutie 1/2560 atunci titrul este de 1280; etc. Se poate folosi pentru dg. febrei tifoide/paratifoide - Salmonella (para)typhi cu o modificare: serul pacientului se pune in contact cu antigene bacteriene separate: O, H, Vi obtinute prin prelucrare in laborator a unor culturi de germeni. Titrul semnificativ pentru diagnostic pentru adulti: >500 pentru aglutininele anti-O si > 1000 pentru aglutininele anti-H reprezinta Ac protectori care asigura imunitatea durabila dupa boala. Ac. anti-Vi apar tarziu in convalescenta si numai la cei care raman purtatori dupa boala ( rezervor) titru semnificativ > 40. Reactia Weil-Felix (1915) pentru diagnosticul unor Rickettsii; serul pacientului infectat aglutineaza cu unele Ag ale unor tipuri de Proteus: pentru Rickettsile care dau tifosul exantematic se foloseste Proteus vulgaris tulpina OX.19 (cross-reactivitate). Reactia poate fi adaptata cu alte tulpini de Proteus pentru alte tipuri de Rickettsii. Nu toate Rickettsiile pot fi diagnosticate astfel. Reactii fals (+) in infectiile cu Proteus!!! Met. Gruber = detectarea Ag: Se recolteaza de la pacient probe biologice din care se realizeaza culturi bacteriene; aceste culturi sunt ulterior ?transferate intr-un mediu lichid? si incubate cu Ac specifici pentru specie/tip de bacterie. Prezenta aglutinarii poate pune diagnosticul de specie, tip, etc. in functie de Ac folositi.

AGLUTINAREA PE PARTICULE DE LATEX (a) Particule de latex pe care sunt adsorbiti Ac cunoscut = reactie de aglutinare pasiva In acest caz se evalueaza prezenta unui Ac pe care vrem sa il evaluam calitativ/semicantitativ ( se folosesc dilutii seriate din serul pacientului se evalueaza astfel titrul Ac respectivi in serul pacientului) (b) Particule de latex pe care sunt adsorbiti Ag cunoscut = reactie de aglutinare pasiva reversa In acest caz se determina prezenta unui Ag pe care vrem sa il evaluam

Ex. prin metode de latex-aglutinare se evidentiaza prezenta factorului reumatoid (FR) la pacientii cu PR. Pe particule de latex sunt adsorbite IgG (care aici joaca rol de Ag!) care se pun in contact cu serul pacientului. Daca FR este prezent se produce aglutinarea. FR = IgM anti Ig. Deasemenea s-au dezvoltat teste de evaluare rapida a infectiilor se folosesc particule latex pe care sunt adsorbiti Ac specifici.

REACTII DE AGLUTINOINHIBARE Sunt de tip calitativ; se evidentiaza prezenta sau absenta unui Ag intr-un produs biologic. Ex. unele teste de sarcina sunt pe acest principiu. In cursul sarcinii creste nivelul -hCG in plasma si se elimina si in urina. Un prim pas: se pun in contact Ac anti-Ag cu produsul biologic de evaluat: adica in exemplul nostru Ac anti- hCG cu urina persoanei. Daca in urina exista -hCG atunci acesta va fi legat de Ac anti- -hCG. Al II-lea pas: se adauga -hCG adsorbit pe particule de latex (exogen). Daca Ac anti- -hCG sunt deja legati de -hCG care a provenit din urina, ei nu se mai pot lega de -hCG de pe particulele de latex, si astfel nu se produce aglutinarea. Daca in urina nu exista -hCG atunci Ac anti- -hCG sunt liberi sa lege Ag de pe particulele de latex si astfel se produce aglutinarea. Deci un astfel de test se considera pozitiv daca nu se produce aglutinarea.

REACTII DE AGLUTINARE NON-IMUNA exista virusuri, toxine bacteriene, compusi chimici, care induc hemaglutinare non-imuna. HEMAGLUTINAREA VIRALA = Exista virusuri care pot determina aglutinarea hematiilor in absenta unei reactii Ag-Ac: vir. urlian, rujeolei, gripal datorita prezentei unor proteine de suprafata hemaglutinine. Acest tip de hemaglutinare poate fi inhibata de prezenta Ac neutralizanti ai virusului respectiv = HEMAGLUTINOINHIBARE VIRALA Reactie de neutralizare = o reactie Ag-Ac in care efectele (negative) ale unei exotoxine bacteriene sau ale unui virus sunt blocate. Testul este folosit pentru subtipizarea virusurilor gripale.