Sunteți pe pagina 1din 29

TESTELE DE

IMUNOFLUORESCENŢĂ
 se bazează pe reacţia Ag-Ac în care
Ac (imunoglobuline), purificaţi sau
existenţi în serul speciei donatoare,
sunt legaţi chimic de un fluorocrom,
cel mai utilizat fiind izotiocianatul
de fluoresceină (FITC).

 Ig marcate în acest mod îşi


păstrează capacitatea de a
recunoaşte antigenul specific lor
(complexul Ag-Ac devine vizibil sub
lumină UV)
 Antigenele corpusculare:

 bacterii, virusuri, paraziţi, celule


etc.

 devin observabile în urma


adsorbţiei Ac specifici fluorescenţi

 imaginea microscopică reproduce


morfologia substratului respectiv
 Antigenele moleculare

 toxine, extracte etc.

 trebuie adsorbite în prealabil pe un


suport corpuscular (hematii, cărbune
etc.).

 pentru a putea forma cupluri Ag-Ac


vizibile în spectrul UV
Condiţii pentru obţinerea rezultatelor

 puritatea produsului fluorocromat

 valoarea ridicată a serului ce urmează a


fi prelucrat pentru obţinerea conjugatului

 asigurarea unei serii cât mai complete de


martori care să elimine posibilitatea de
eroare în interpretare
Obţinerea anticorpilor
 Serurile specifice se obţin prin hiperimunizare cu Ag a
căror identitate este urmărită prin IF.
 Titrul în anticorpi al acestor seruri trebuie să fie ridicat
şi să aibă o specificitate strictă şi o aviditate ridicată.

 Marcarea cu fluorocromi a serurilor prezintă o


serie de inconveniente, motiv pentru care se
recomandă marcarea Ig purificate.
 Separarea imunoglobulinelor se realizează prin diferite
procedee:
 precipitările cu săruri;
 separarea cu ajutorul unor solvenţi organici;
 separarea prin ultracentrifugare;
 separarea cu ajutorul schimbătorilor de ioni de structură
celulozică – cele mai bune rezultate.
Prepararea anticorpilor fluorescenţi
 Ac marcaţi cu substanţe fluorescente
constituie cel mai important material
în IF, de calitatea cărora depinzând
fidelitatea rezultatelor.
 Substanţa fluorescentă utilizată trebuie să
îndeplinească următoarele calităţi:
 să se cupleze cu Ac fără a le altera
specificitatea sau activitatea;
 să nu-şi piardă fluorescenţa prin cuplarea cu
Ac sau printr-o iluminare mai îndelungată;
 să prezinte o fluorescenţă diferită de cea
naturală a ţesuturilor;
 substanţa fluorescentă necuplată cu Ac să
poată fi îndepărtată uşor prin spălare.
Principiul metodei
 Metoda se bazează pe conjugarea chimică
a Ac cu anumite substanţe care au
proprietatea de a fi fluorescente în cazul
iradierii în lumină UV.

 O substanţă fluorescentă se caracterizează


prin capacitatea de absorbţie a energiei
luminoase cu lungime de undă diferită de cea
pe care o emite.
Metodele de IF - clasificare
 a) metode curente:
 imunofluorescenţa directă (IFD)
 imunofluorescenţa indirectă (IFI).

 b) metode cu utilizare restrânsă:


 inhibarea imunofluorescenţei (IIF)
 complement imunofluorescenţă (CIF).
IMUNOFLUORESCENŢA DIRECTĂ (IFD)

 IFD este una dintre cele mai comode şi


rapide tehnici de IF, fiind din punct de
vedere cronologic şi prima metodă pusă
la punct (1942).

 Principiul metodei - producerea


reacţiei Ag-Ac într-un singur timp.
Materiale necesare
 Antigene virale
 din culturi celulare sau din ţesuturile în
care se fixează cu predilecţie virusurile
în infecţiile naturale sau experimentale

 Anticorpii specifici
 din serul hiperimun se separă IgG-ul
care apoi este cuplat cu un fluorocrom
(FITC).
Tehnica de lucru
 Etalarea materialului cercetat pe lamă sub formă de:
frotiu, amprentă sau secţiuni crio;
 Fixarea preparatului în acetonă;
 Rehidratarea preparatului cu (PBS);
 Cuplarea cu anticorpii marcaţi - acoperirea suprafeţei
preparatului cu conjugatul Ac-FITC şi menţinerea lui
într-o cameră umedă la 37ºC;
 Spălarea suprafeţei preparatului într-o baie cu tampon
(PBS) şi agitare;
 Montarea preparatului prin aplicarea unei lamele cu
ajutorul unei picături de glicerină (nefluorescentă);
 Citirea preparatului la un microscop cu lumină U.V.
 Se execută şi o serie de martori pozitivi şi negativi.
Interpretare
 Ex. - IF directă pentru diag.
pestei porcine clasice (se folosesc
frotiuri din măduvă hematogenă obţinută din
sternebre):

 Reacţie pozitivă – fluorescenţă verzuie


sau galben-verzuie în citoplasma celulelor
 Reacţie negativă - fluorescenţă roşu-
orange sau, uneori, o nuanţă de galben
în citoplasma celulelor.
TESTUL DE IMUNOFLUORESCENŢĂ
INDIRECTĂ (IFI)
 Metoda indirectă a apărut în mod firesc ca
o variantă derivată din primul procedeu.
 Faţă de metoda directă, intervine o nouă
etapă, deci un al doilea cuplu antigen –
anticorp.

 Anticorpii se pun în evidenţă după


reacţia lor cu antigenul (etapa 1)
utilizând un conjugat anti-IgG
fluorescent (etapa 2).
Principiul metodei
 În primul timp are loc cuplarea
anticorpilor nemarcaţi (cunoscuţi sau
de cercetat) cu antigenul corespondent
(cunoscut sau necunoscut).

 Prezenţa anticorpilor specifici este


pusă în evidenţă, în timpul al doilea,
cu un ser antiglobulinic marcat.

 Anticorpul nemarcat se foloseşte de


obicei sub formă de ser total.
IFI pentru Ac anti-nucleari (boli autoimune)
IFD - IgG murin (Ac monoclonal marcat cu FITC) pentru
tubulina β2 umană (verde) – celule HeLa fixate cu alcool
metilic (cultură)
IF triplă
Citoscheletul celulelor eucariote – filamente de actină (roşu),
microtubuli (verde)
Citoscheletul celulelor eucariote –microtubuli (verde)
IFD – celule HeLa
verde – α tubulină marcată cu Ac monoclonal murin HDAC2
conjugat cu Chromeo 488
IFI – 1. Ac monoclonal murin anti-proteină neglicolizată din
componenţa mitocondriilor. 2. Ig de capră anti-şoarece conjugat cu
Alexa Fluor 56
****Mitocondrii (roşu) – cultură celule HEK 293
IF cu marcare triplă – rinichi de şoarece
- roşu – panxilina (proteină)
- verde – filamentele de actină ale citoscheletului
- albastru - nucleii
IFI – celulă glială din cultură
1. Ac monoclonal murin pentru receptorul β al IFN-γ
2. IgG de capră anti-şoarece conjugat cu Alexa Fluor 568
Celule epiteliale umane
albastru-gri – nuclei; galben – mitocondrii; verde – microtubuli;
roşu – filamente de actină
Celule în cultură infectate cu virusul hepatitei C (verde)
IFI - Herpes simplex virus
verde – complexe Ag – Ac marcat cu FITC
roşu-portocaliu – celule neinfectate (colorant Evans)
IFI - Herpes simplex virus
verde – complexe Ag – Ac marcat cu FITC
roşu-portocaliu – celule neinfectate (colorant Evans)
Giardia lamblia
Ac conjugat cu 4,6-diamidino 2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI).
IFI pentru diagnosticul ulcerului provocat de H. pylori