Diagnosticul bacteriologic al infectiilor determinate de bacterii patogene din

Familia Neisseriaceae

Definitie:
- coci rotunzi, Gram (-), dispusi in perechi, cu fetele adiacente aplatizate (aspect
caracteristic in boabe de cafea, reniformi), tetrade, gramezi,
- oxidaza-, catalaza- pozitivi,
- imobili,
- nesporulati,
- speciile patogene prezinta capsula,
- sunt germeni pretentiosi nutritiv,
- se dezvolta optim la 35C- 37C, in atmosfera imbogatita cu CO2 (5-10%).
Familia Neisseriaceae cuprinde genurile:
- Neisseria,
- Moraxella,
- Kingella,
- Eikinella,
Propunere pentru noul Manual Bergey de Bacteriologie (taxonomie):
Familia Moraxellaceae:
- Branhamella catarrhalis,
- Acinetobacter.
Habitat si Implicatii in patologie:
Cele mai multe specii de Neisseria sunt comensale: colonizeaza mucoasa orofaringiana
si nasofaringiana, in special la adulti si copii. Speciile comensale pot determina infectii cu
localizari diverse la pacientii imunodeficienti (meningite, osteomielite, celulite, artrite,
conjunctivite, pneumonii, septicemii).
Genul Neisseria- implicatii in patologia umana:
Neisseria meningitidis si Neisseria gonorrhoeae sunt specii strict parazite pentru om.
1. Neisseria meningitidis: are ca habitat mucoasa cailor aeriene superioare si se
transmite aerogen.
- local determina rino-faringite,
- in conditii de imunodepresie, N. meningitidis difuzeaza in sange, determina
bacteriemii cu localizari secundare meningeale,
- meningita meningococica se manifesta prin forme controlabile prin tratament
antibiotic corect, rapid si tintit, sau imbraca forme deosebit de grave, fulminante
(sindromul Waterhouse- Friedrichsen/ CIDD- coagulare intravasculara diseminata).
- Portajul naso- faringian reprezinta sursa epidemica majora, si punctul de plecare al
mecanismului de producere a meningitei.

2. Neisseria gonorrhoeae: este foarte agresiva pentru orice fel de mucoasa: genitala,
rectala, faringiana, conjunctivala,
- determina infectii acute, localizate cu tendinta invaziva tisulara si, apoi, sistemica.
Netratate, infectiile gonococice evolueaza spre cronicizare cu fibroze.
- La barbat: uretrita acuta, epididimita,
- La femeie: endocervicita, boala inflamatorie pelvina (salpingita, metrita,
pelviperitonita), infectii gonococice diseminate (eruptie cutanata, artrite, meningita,
endocardita)
- La nou- nascut: conjunctivita, endoftalmita.
Diagnosticul de laborator:
1. Infectii determinate de Neisseria meningitidis:
a) Recoltare:
- In meningitele meningococice se recolteaza LCR: 3-5 mL, inainte de administrarea de
antibiotice ar fi ideal,
- Transport imediat la laborator, ferit de variatii de temperatura si lumina (se transporta
la temperatura corpului/ 37C),
- Uneori se recomanda insamantarea LCR la patul bolnavului, imediat dupa punctia
lombara, cu transportul rapid al mediilor de cultura la laborator,
- Sange (hemocultura): volum 3-5 mL la copil, 10 mL/ flacon de hemocultura la adult,
- Exudat nazal si faringian (important pentru determinarea punctului de plecare a
infectiei, precum si la purtatori- contacti pentru stabilirea sursei de infectie, utile in
ancheta epidemiologica).
- Medii de conservare si transport: Stuart si Amies (tampoane nazo-faringiene)
b)Examen macroscopic: aprecierea aspectului macroscopic (LCR opalin, tulbure,
purulent),
c) Examen microscopic direct:
- numaratoare elemente/ mmcub (camera de numarat Fuchs Rosenthal (se foloseste
LCR brut, in diferite dilutii, in functie de gradul de opacitate),
- se centrifugheaza restul de LCR (20 min la 3500 rotatii) si din sediment se efectueaza
frotiuri (Gram, Giemsa) si insamantari pe medii de cultura (geloza- sange berbec si
geloza chocolat),
- din supernatant de determina prezenta antigenelor bacteriene solubile (Neisseria
meningitidis, Str pneumoniae, Haemophilus influenzae, Str. agalactiae/ grup B).
* Latex aglutinarea si coaglutinarea: detectia rapida direct din supernatant LCR, inactivat
prin fierbere, a antigenelor solubile de N. meningitidis, serogrup A, B, C, Y, W 135.
Rezultatul pozitiv al uneia dintre reactii impreuna cu aspectul microscopic al frotiului
colorat Gram, permite medicului inceperea de urgenta a tratamentul antibiotic, inainte de
obtinerea culturilor.

- Examen microscopic: frotiuri colorate Gram si Giemsa sau albastru de metilen

(aspectul celularitatii): prezenti coci Gram (-), rotunzi, in diplo, fete adiacente aplatizate,
in boabe de cafea, reniformi, intra si extra- leucocitari, frecvente PMN. Prezenta
leucocitelor pledeaza pentru un prognostic favorabil. Examinarea frotiurilor dureaza aprox
10 minute, deoarece, in meningita meningococica, frotiul este sarac in germeni.

d) Izolarea:
- Medii de cultura imbogatite: geloza Columbia sau geloza BHI (brain, heart infusion)sange berbec 7- 10%, geloza chocolat, pentru prelevate normal sterile (LCR, sange,
lichide de punctie),

- mediul Thayer Martin, NY, selective, cu adaos de antibiotice, pentru insamantare

exudate nazale si faringiene (prelevate pluribacteriene).
- incubare la 37C,atmosfera de 5- 10% CO2, umiditate 50%, timp de 24- 48 ore,
- incubare in sistem automat de detectie (BacT/ALERT, BACTEC): in flacoane uz
pediatric (1-3 mL sange sau LCR, la copii) sau flacoane Standard aerobe- anaerobe
(pacienti care nu au primit tratament cu antibiotice), FAN aerobe- anaerobe (pacienti deja
tratati), in care se inoculeaza 10 ml sange/ flacon sau 3-5 mL LCR/ flacon.
e) Identificarea:
- Neisseriile sunt bacterii strict aerobe; N. meningitidis necesita pentru izolare atmosfera
imbogatita cu CO2 5-10%,
- Pe mediile de izolare, N. meningitidis se dezvolta sub forma de colonii gri, translucide,
nepigmentate, convexe, lucioase, tip S. Grupurile A si C, incapsulate au aspect mucoid.
- Identificarea coloniilor se bazeaza pe aspectul macroscopic al acestora, aspectul
microscopic si pe testele oxidazei (test pozitiv) si catalazei (test pozitiv).

* Testul oxidazei: pe suprafata coloniilor suspecte se depune o picatura de solutie apoasa

1% de tetrametilen- p- parafenilendiamina preparata extemporaneu. Testul este pozitiv
daca coloniile devin roz, rosu purpuriu, apoi se innegresc in 10 sec. Testul poate fi efectuat
si prin depunerea coloniilor pe hartie de filtru impregnata cu acelasi reactiv. Aparitia unei
culori violet intens, in 3-10 sec, indica pozitivitatea testului.
* Testul de fermentare a zaharurilor:
- Coloniile suspecte se repica in sectoare pentru obtinerea de cultura pura, in cantitate
suficienta pentru inoculare pe medii solide, inclinate ce contin zaharuri 1% (glucoza,
maltoza, lactoza, zaharoza), ser de cal 10%, indicator de pH. Tuburile cu zaharuri se
incubeaza in atmosfera CO2, timp de 20 ore. Meningococul fermenteaza glucoza si
maltoza fara producere de gaz, si nu fermenteaza lactoza si zaharoza.

* Relativ recent, pentru diferentierea speciilor de Neisseria au fost introduse teste bazate
pe substraturi cromogene. Trei dintre acestea, - galactozidaza (ONPG), glutamiltransferaza (GGT) si hidroxiprolin- aminopeptidaza (HPAP) au fost preluate si in
unele galerii comerciale de microteste:
Testul

Neisseria
meningitidis

Neisseria
gonorrhoeae

Moraxella
catarrhalis

ONPG

GGT

HPAP

* Sisteme comerciale de identificare biochimica: bazate pe caractere exoenzimatice

(VITEC/ bioMerieux, Micro Scan etc).
* Identificare antigenica: determinarea grupului antigenic al meningococilor este o metoda
curenta efectuata prin reactia de aglutinare, ori variante ale acesteia, reactiile de coaglutinare

si latexaglutinare. Sunt cunoscute in prezent 12 grupe antigenice ale meningococilor: A, B, C,

W135, Y etc. Peste 95% din izolatele europene apartin grupelor B, C, A si Y. In functie de
aglutinarea cu antiseruri de grup, tulpinile de meningococi pot fi:
- grup aglutinabile: pot fi incadrate intr-un grup definit,
- poliaglutinabile: aglutineaza cu mai multe seruri,
- neaglutinabile: nu aglutineaza cu niciun ser.
* Tipizarea meningococilor: Tipizarea antigenica vizeaza antigene polizaharidice, proteice si
lipopolizaharidice.
- antigenele polizaharidice determina serogrupele,
- antigenele proteice sau antigenele de membrana externa (OMP- Outer Membrane Proteins)
determina tipurile si subtipurile de meningococi,
- antigenele lipopolizaharidice determina imunotipurile (8 clase diferite de LPS/
lipopolizaharid = 8 imunotipuri).
* Antibiotipia (sensibilitatea la antibiotice): meningococii au pastrat in general
sensibilitatea la penicilina. Tulpinile de meningococ producatoare de penicilinaza sunt rare, de
aceea, rezistenta la penicilina a meningococilor ramane un marker epidemiologic cu
capacitate discriminatorie buna.
2. Diagnostic bacteriologic al infectiilor produse de Neisseria gonorhoeae:
a) Recoltarea:
- produsul patologic este reprezentat de secretii exudative de la nivelul mucoaselor
inflamate: aspect purulent, cremoase, opace, tenta galbuie.
- La femei se recolteaza secretie endocervicala, de catre ginecolog. Se recolteaza din
endocol cel putin 2 tampoane: unul pentru frotiuri si unul pentru insamantare.
- La barbati se recolteaza secretie uretrala: dimineata, inainte de urinare, sau la cel putin
1 ora dupa ce pacientul a urinat. In uretritele gonococice secretiile sunt abundente, iar
recoltarea se face cu tamponul sau cu ansa.
- Nou- nascutii ai caror mame au infectie gonococica pot face la nastere oftalmie
gonococica, ce trebuie tratata imediat deoarece duce la orbire. La nastere se practica
profilaxie cu penicilina sau azotat de argint (Protargol). Recoltarea secretiilor
conjunctivale se face cu tamponul steril din unghiul intern al ochiului si fundul de sac
conjunctival.
b) Transportul probelor: pentru ca gonococii sunt foarte sensibili la conditiile mediului
extern, si se gasesc in numar mic in prelevatele patologice, se recomanda insamantarea
direct dupa recoltare.
- Daca insamantarea imediata nu este posibila, se utilizeaza medii de conservae si
transport Stuart si Amies.
c) Examen macroscopic: secretii purulente, de culoare galbuie si consistenta specifice.
d) Examen microscopic direct al produsului patologic: etapa foarte importanta in
diagnosticul infectiilor gonococice. Frotiurile se coloreaza Gram.
- in uretritele acute la barbati, sensibilitatea de diagnostic microscopic este de peste
95%; in multe laboratoare diagnosticul se opreste aici, renuntandu-se la izolarea
gonococului.
- Pe frotiu se vede un numar f. mare de PMN care contin diplococi Gram (-), dispusi in
diplo (in boabe de cafea). In uretritele cronice cultivarea gonococului este
obligatorie, interpretarea frotiului Gram fiind ingreunata de flora de asociatie, de data
aceasta f. abundenta.
- La femei, examenul microscopic direct din colul uterin, ca metoda de diagnostic, are o
sensibilitate de doar 50-70%. Pe frotiu se vad frecvente PMN, diplococi

caracteristiciintracelulari, dar interpretarea frotiului este ingreunata de flora polimorfa

vaginala. Cultura este si in acest caz, obligatorie.

e) Izolarea: Neisseria gonorrhoeae este un germen foarte pretentios. Izolarea se face pe

mediul geloza- chocolat. Pentru prelevate pluribacteriene se recomanda mediul HYL,
cu adaos de antibiotice (vancomicina, colistin, nistatin).
- Incubarea la 35-37C, in conditii de aerobioza, cu adaos de 5% CO2, atmosfera
umeda., timp de 24-48 ore.
f) Identificarea:
- caractere culturale: colonii mici, 0,5- 1mm diametru, translucide, gri, lucioase,
margini netede, convexe (tip S). Din prelevatele clinice se izoleaza intre 1 si 5 tipuri
de colonii (T1- T5), tinere, lucioase, reflecta lumina, care, dupa repicare, devin mai
opace, nu reflecta lumina.
- Caractere microscopice: coci Gram (-) dispusi in diplo, boabe de cafea,
reniformi,
- Caractere biochimice, exoenzimatice:
Testul catalazei pozitiv,
Testul oxidazei pozitiv,
Fermentarea zaharurilor (gonococul fermenteaza doar glucoza),

Degradare cromogena a unui substrat, pe baza enzimelor elaborate de

gonococ (HPAP),
Kituri comerciale de diagnostic in sistem automat (API, VITEC),
Caractere antigenice: teste care au la baza reactii antigen- anticorp
(latex- aglutinare, coaglutinare, imunofluorescenta).
Sensibilitatea la antibiotice: s-au semnalat tot mai multe tulpini producatoare de
penicilinaza.Tratamentul in astfel de situatii se face cu spectinomicina (aminoglicozid
cu spectru ingust, specific pentru gonococ).
In ultimul timp circula tulpini rezistente la tetraciclina si eritromicina, asadar, este
importanta antibiogama difuzimetrica si cantitativa (valori CMI/ E-test). Rezultatele

terapeutice cele mai bune se obtin cu cefalosporine generatia a III-a si

fluoroquinolone.
3. Branhamella catarrhalis:
- coci Gram negativi, comensal al cailor respiratorii superioare, ce poate determina la
om angine, otite medii, sinuzite, pneumonii, bronhopneumonii (pe fond de
imunodepresie post- gripala, rujeola, tuse convulsiva).
- Diagnostic: importanta majora o are frotiul colorat Gram din sputa, aspirat bronsic,
secretii traheo- bronsice: coci Gram (-) dispusi in diplo, gramezi, intra si extraleucocitari, mucus, fibrina. Izolarea se face pe geloza sange si geloza chocolat, dupa
incubare 24-48 ore, la 37C, in atmosfera imbogatita cu 3-5% CO2, umiditate.
- Identificarea: colonii lucioase, gri, rotunde, 3-5 mm diametru. Examenul microscopic
din coloniile caracteristice confirma prezenta cocilor Gram negativi in diplo.
- Testele oxidazei si catalazei: pozitive, ca si la neisserii,
- Nu fermenteaza zaharurile (G-, L-, M-, Z-),
- DNA-aza : (+),
- Este beta- lactamazo- producatoare,
- Singurul coc Gram (-), oxidazo- catalazo- (+), betalactamazoprducator izolat din
secretii otice, sinusale, tract respirator superior si inferior este Branhamella
catarrhalis.