Antibiograma: testarea sensibilitatii suseeptibilitatii fata de antibiotiee)

in vitro a mieroorganismelor

fata de antibiotiee (TSA - testarea

Antibiotice substante eu efect antibaeterian produse de diferite microorganisme substante semisintetiee, sintetiee (ehimioterapeutiee)

1. al~tibiotice ~-lactamice
peniciline penicilina peniciline eu speetru larg (ampicilina, amoxieilina) penieiline antistafiloeoeiee (oxaeilina) (piperaeilina, ticarcilina)

penieiline antipseudomonazice cefalosporine (gen I-IV) gen I - cefazolin, cefalotin. gen II - eefuroxim

gen III - eeftazidim, eeftriaxon, cefotaxim, gen IV - cefpirom, cefepim cefamicine (cetoxitin) monobactame carbapeneme (aztreonam) (ertapenem, imipenem, meropenem) c1avulanie,

combinatii ~-lactamine + inhibitori de lactamaza (amoxieilina+acid ampicilina+sulbactam, 2. macrolide, lincosamide eritromicina, c1aritromieina, azitromieina c1indamicina 3. Uuorochinolone norfloxacin, eiprofloxacin, ofloxacin, levofloxacin, moxifloxaein piperaeilina+tazobaetam,

ticarcilina+c lavulanat)

4. tetracicline tetraciclina, doxiciclina, minociclina 5. gJicilcicline tigeciclina 6. aminoglicozide kanamicina, gentamicina, amikacina, netilmicina 7. glicopeptide vancomicina, teicoplanin 7.Oxazolidinone linezolid 8. fenicoli

Illdicatiile efectuarii antibiogramei: - in cazul tuturor bacteriilor semnificative clinic a caror susceptibilitate nu este predictibiHi (~onditie: existenta standardizarii privind specia, antibioticul de testat) ijecesitatea efectuarii antibiogramei se decide de catre medicul microbiolog in functie de: felul produsului din care s-a izolat germenul, specia bacteriana Cand relevanta unui izolat este incerta, medicul microbiolog se consulta cu medicul curant ~i se ia 0 ~ecizie in comun pe baza datelor clinice. Metode: metode calitative o metoda difuzimetrica

metode cantitative o determinarea eMI (concentratia minima inhibitorie)

Metoda difuzimetrica Kirby-Bauer

Se testeaza sensibilitatea unei tulpini bacteriene izolate in cultura pura ~i identificate. Este metoda utilizata de rutina pentru testarea susceptibilitatii izolatelor clinice. FiiJ,'ld metoda calitativa, nu permite cuantificarea nivelului de rezistenta, rezultatele fiind exprimate 0 in sensibil, intermediar sau rezistent: sensibil tulpina este sensibila [ata de antibioticul testat la 0 concentratie realizabila de catre antibiotic in ser bacteriilor sensibile nu dispun de mecanisme de rezistenta

intermediar raspunsul terapeutic in cazul acestor izolate poate fi mai slab decat in cazul izolatelor sensibile aeeasta categorie reprezinta totodata
0

zona de tampon care, in caz de erori tehnice minore

necontrolate, previne crearea unor discrepante majore in interpretare in caz de sensibilitate intermediara antibioticul poate fi utilizat clinic in anumite situatii: o in infectii urinare - acele antibiotice, care se concentreaza in urina (realizeaza concentratii mai mari in urina decat in ser) o candpot fi administrate doze crescute (13-Iactamine)

bacteriile rezistente nu pot fi inhibate de antibiotic la concentratia serica realizabila prin administrare uzuala

in efectuarea ~i interpret area antibiogramelor

calitative se urmaresc standarde intemationale.

In

prezent standardul acceptat in cele mai multe tan (inc1usiv Romania) este eel american, elaborat de CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute). Este in curs de elaborare un standard european de catre EUCAST (European Committee on Antibiotic Susceptibility Testing), care va avea ill vedere caracterisiticile tulpinilor circulante ~i al infectiilor mai importante ill Europa.

Reailizareaantibiogramei conform standardului CLSI .1. Prepararea inoculului: se suspensioneaza 2-3 colomi izolate in ser fiziologic turbiditatea suspensiei se controleaza nefelometric sau comparand cu tuburi etalon (contin suspensii de particule latex/sulfat de Ba avand turbiditate determinata); . se ajusteaza la 0.5 McFarland (1,5xI08 CFU/ml). 2. Insamantare: se alege un mediu corespunzator speciei bacteriene testate Mueller-Hinton pentru majoritatea bacteriilor Mueller-Hinton cu sange pentru pretentio~i (de ex. streptococi) medii speciale (pentru Haemophilus spp . neisserii)

se introduce un tampon in suspensia bacteriana, se stoarce pentru indepiirtarea excesului de lichid se ~terge uniform toata suprafata mediului de 3x 3. Depunerea microcomprimatelor de antibiotice se aleg antibiotice1e care trebuie testate in functie de specia bacteriana testata si in functie de localizarea infec!iei (anexa 1) se depun discurile de antibiotic la 1.5 cm distanta de marginea cutiei Petri si la 3 cm distan unul fata de celi'ilalt(pot fi depuse max. 12 discuri) 15 min. temperatura camerei 4. Incubare in functie de specia bacteriana: in atmosfera obi~nuita sau in atmosfera de CO2 (de ex. streptococi, neisserii.)

16-18 ore (in cazu1 germenilor pretentio~i pana la 20-24 de ore) 24 de ore in cazul testarii vancornicinei

apare 0 cultura bacteriana confluenta, in jurul rnicrocornprirnatelor apar zone de inhibitie (lipsa cre~terii bacteriene) se citesc diametrele zone lor de inhibitie se compara diametrele citite cu diametre standard in funetie de antibiotic, cantitatea de antibiotic din cornprimat, specia bacteriana testata

l)

Tabel: Exemple de diametre standard, conform standardelor Standards Institute USA).

CLSI (Clinical Laboratory

Standard CLSI
i

Specii bacteriene
Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae

Antibiotic
levofloxacin levofloxacin

Rezistent Intermediar sensibil

10 ug S; 15 mm 10 ug S; 13 mm 16-18 14-16

Sensibil
2: 19 mm 2: 17mm

fenomene de sinergisrn/antagonism rezistenta

care reflecta diferite mecanisme de

6. Interpretarea antibiogramelor:
rezultatul se raporteaza: testat fiecare rezultat de antibiograma se interpreteaza! sensibil (S), intermediar sensibil (IS) sau rezistent (R) la antibioticul

nu se comunica diametrele citite (metoda calitativa)

Vartiabilele care influenteaza rezultatele:

compozitia mediului (continut de cationi, timidina)

pH (optim: 7,2-7,4)
grosimea geIozei (standard: 4 nun) inocuIul - 0,5 McFarland microcomprimate (valabilitate, continut, conditii de pastrare)

timpul, temperatura de incubare citirea diametrelor (lumina refractataJreflectata, crenelate) colonii izolate, prezenta unui val, margini

Control de calitate
microcomprimateIe loturile noi de medii de cuItura se testeaza cu tulpini de referinta

- permit stabilirea concentratiei

minime inhibitorii (eMI) a unui antibiotic unei bacterii

CMI: cantitatea cea mai mica de antibiotic care inhiba compIet multiplicarea Este recomandata testarea cantitativa in urmatoareIe situatii: cazuri clinice grave (septicemii, endocardite, meningite)

rezultate incerte cu metoda difuzimetrica / sensibilitate nedeterminata situatii speciale (de ex. testarea sensibilitatii pneumococului la penicilina printr-o metoda

cantitativa cfmd diametrul zonei de inhibitie la oxacilina este sub 20 nun) ~ eMI obtinut se raporteaza la punctele de ruptura superior ~i inferior date de CLSI

~pecii bacteriene Stafilococi Enterococi Enterobacterii

Sensibil :::;0,25 :::;8 :::;8

Intermediar sensibil

Rezistent

16

~ 0,5
~16 ~32

Metoda dilupilor (macro/microdilupe)

se realizeaza dilutii succesive din antibioticul de testat in mediu de cultura lichid se adauga cantitiiti fixe din cultura bacterianii cercetata incubare 18 ore 3SoC

concentratia maxima
Metoda dilupiIor in agar

concentratia minima control de cre~tere

se realizeaza dilutii succesive din antibioticul testat in geloza Mueller-Hinton se insamanteaza cultura bacteriana in spoturi citire: eMI - concentratia cea mai mica care inhiba complet creterea sau apare maximum colonie
E-teste
0

pe suprafata mediului de cultura solid i insamantat se aplica :faiidin plastic impregnate

ell

antibiotic in concentratie crescandii - la un capat concentratia este minima, Ia celalalt este maxima; gradatiile sunt notate pe fa~ie; incubare

Genul Staphylococcus
Stafiloeoci eoagulazo-pozitivi: Stafilococi coagulazo-uegativi S. aureus (SCN) eu importanta clinica: S. lugdunensis, S. schleiferi, $.

hyicus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus

Produs patologic portaj: secretie din cavitatea nazaHi anterioara, secretie faringeana, probe de pe tegumente (zona axilara, perianala) plagi, otite, infectii tegumentare => puroiul (S. aureus) infectii urinare => urina (S. saprophyticus, S. aureus) infectii gastro-intestinale, meningite toxiinfectii alimentare => materii fecale, vomismente, alimente.

=> LCR

septicemie, febra puerperala => sange (S. aureus, SCN) pneumonie => sputa. infectii nosocomiale rezistent 1. Examenul direct aI pp: macroscopic: puroi cremos, filamentos, galbui. microscopic: coloratia Gram: coci gram (+), dispu~i in gramezi asemanatoare - S. aureus meticilino-rezistent (MRSA, SARM) , SCN meticilino-

ciorchinilor de strugure 2. Izolare: mediul de imbogatire: mediul hiperclorurat lichid Chapman (Ch) nepretentios, poate fi cultivat pe geloza simpla sau geloza sange Incubare aeroba la 37C, 18 - 24 ore. 3. Identificarea Caraetere Caractere Caractere bacteriei: morfotinetoriale: de cultura: biochimice: frotiu din cultura pura

=> coci Gram (+), in gramezi.

col "S" cu pigment galben-auriu pana la citrin

catalaza + oxidaza coagulaza libera +: S. aureus;

coagulaza libera -: stafilococi coagulazo-negativi (SCN) coagulaza legata + (clumping factor - CF): S.aureus, S. lugdunesis, S. schleiferi producerea de DN-aza: S. aureus, S. schleiferi, S. hyicus descompunerea manitolului - pe mediul Chapman producere de pigment:

=> Ma(+); tulpini patogene;

galben citrin (S. aureus, S.

de la auriu la portocaliu,

lugdunensis, S. chromogenes, ~.a.) producerea de hemolizine - pe geloza-sange hemoliza ~ (S. aureus, S. haemolyticus, ~.a.) nu prezinta hemoliza (majoritatea tulpinilor SCN) Identificare pe baza rezistentei la novobiocina a S. saprophyticus R. ag-ac: determinarea enterotoxinei produsa de stafilococ 4. Determinarea patogenitiitii: in vitro: producerea de coagulaza, hemolizine, descompunerea manitolului in vivo: inoculare la animale de laborator (cobai, iepure)

pentru identificarea sursei de infectie - prin lizotip ie (determinarea sensibilitatii stafilococului fata de bactreiofagi; este stabilii a stafilococului) - prin metode de biologie moleculara
0

sensibilitate

Genu) Streptococcus

S. pyogenes S. agalactiae S. grup viridans S. pneumoniae (Pneumococ)

S. pyogenes: secretie faringiana, secretie din leziuni tegumentare, siinge pentru serologie S. agalactiae: secretie vaginala, secretia canalului cervical-la LCR, sange, aspirat bron~ic - la nou-nascut S. grup viridans: se gasesc in mod normal in seereiia faringiana; prin leziuni ale mucoasei bueale pot patmnde in sange, cauzand endocardita subacuta la pacienii cu leziuni ale endocardului valvular Pneumococ: sputa, LCR, sange 1. Examen direct mama

a. Exam. macroscopic:
S. pyogenes, S. de gmp vilidans, enterococii - nu este necesar exam macroscopic a produsului patologic Pneumococ

=> sputa mginie

b. Exam. microscopic: col GRAM: eoci gram(+) o o o S. pyogenes: coci rotunzi, dispu~i in lanturi S. de gmp viridans: coci rotunzi sau ovalari dispu~i in laniUri Pneumocoeii: coci lanceolaii, dispu~i dip 10 eu capetele ascuiite spre exterior ~i inconjurati de 2. lzolarca bacterici: mediul de imbogatire: PIKE Geloza-sange Bulion-sange; Bulion ser; Bulion glucozat; Geloza ser
0

capsula proprie.

3. Identificare: emt: (vezi anterior) Caractere o de eultura: eol "S" eu hemoliza ~ (clara, transparenta) => Streptoeoei ~-hemolitici

sensibilitate

rata

de din peretele bacterian prin reacrii de precipitare ~i aglutinare - stabilirea grupelor Lancefield

BACITRACINA

Bila S. de grup viridans Pneumoeoci Rezistent Sensibil

Optochina Rezistent Sensibil

Inulina

Esculina

Rafmoza

+
-

.~
!
i
I

4. Antibiograma Streptococul de grup A: ~i-a pastrat sensibilitatea fata de penicilina - nu se efectueaza ABG (numai in situatii speciale, de ex. alergie la penicilina sau monitorizarea rezistentei' la penicilina ~i alte antibiotice, lara comunicarea rezultatului) Pentru ceilalti streptococi se efectueaza ABG

5. Evidentierea Ac Streptolizina "0" = SLO= Ag => detennina fonnarea de Ac anti-SLO

=

ASLO

ASLO cre~te 'in primele 7 zile pana 'in saptamanile 3-4 dnd se mentine 'in platou ~i apoi scade titrul pana la valori norrnale pana la 6 lun~ daea s-a intervenit eu un tratarnent corespunzator (vindecare); sau poate sa creasca titrul Ac daea nu a fost tratat bolnavul sau sa produs etc.). Tehnica de lucru: o dilutii suecesive ale serului bolnavului (Ae anti-SLO) ~i SLO (timp de reactie) hematii o daca exista Ac ace~tia se leaga de SLO, SLO se neutralizeaza: eritrocitele nu se lizeaza => reactie (+). o daca nu existi'i Ac => SLO lizeaza eritrocitele => hemoliza => reactie (-). o Se cauta ultima eprubeta in care existi'i hematii nelizate => este titrul de Ac cautat.
0

complicatie (RAA, afectare cardiaca, glomerulonefrita renala acuta, coreea minch

Dg (+) la titrul de 1/200 UI/ml Val

< 1/200 ill/ml => nu exista infeqie streptococica

Val> 1/200 VI/ml => este infectie streptococica in evolutie.

- Ac anti-streptokinaza - Ac anti-streptodornaza

= ASK = ASD

Gen ulEnterococcus
enterococii au fost inclusi initial in grupa D Lancefie1d a genului Streptococcus in 1984, pe baza diferente10r genetice, genul Enterococcus s-a separat din genul Streptococcus

Enterococcus faecalis Enterococcus faecium

Podus patologic:
urina secretie uretrala, secretie prostatica, secretia canalului cervical puroi din plagi bila materii fecale sange

1. Examen direct Exam. microscopic:

se face doar pentru produsele pato10gice in mod normal sterile coci Gram +, ova1ari, mari, dispu~i in 1anturi scurte sau in dip10, imobili, necapsu1ati, nesporu1ati

2. Izolarea bacteriei:
geloza sange ABE (agar-bila-escu1ina) incubare la 37e, 18 - 24 ore

3. Identificare:
Cmt: (vezi anterior)

Caractere de cultura:
o colonii S,
<X

hemo1itice sau nehemolitice

C. biochimice:
o o o o cata1azaoxidazarezistent 1abila hidrolizeaza esculina in prezenta a 40% hila sau saruri biliare pe mediu1 ABE - coloratie neagrii

-6-

pe baza fermentiirii zaharurilor se pot impiirti in 5 grupe, in cadrul ciirora se pot diferentia speciile tot pe baza fermentiirii zaharurilor Esculina Enterococcus spp. E. faeeium E. faeealis Xiloza Arabinoza

+ + +

+ +

4. Identificare antigenica latexaglutinare 5. Antibiograma sunt germeni eu rezistenta creseuta la antibiotiee antibiograma se efeetueazii obligatoriu

secretie uretraHi, secretie glande Bartholini, secretie vaginaHi, secretie prostatica la femei se recolteaza in timpul sau la sfar~itul cidului menstrual secretie faringiana secretie conjunctivali'i urina

secretie faringiana sange LCR

Rezistenta: foarte sensibili la temperatura camerei, la uscaciune se fac la patul bolnavului!!!

=> recoltarea ~iinsamantarea

1. Examenul microscopic: coci Gram( -) sub forma de boaba de cafea, dispu~i diplo in infectii acute => se gasesc intracelular in infectii cronice ~i extracelular

coci gram (-), dispu~i diplo sunt capsulati

=> se giisesc intra-

2. Izolarea: (sunt germeni foarte pretentio~i) se insamanteaza imediat dupa recoltare se inciilze~te mediulla 37C mediile de cultura utilizate: Geloza-chocolat, PElZER-STEFFEN, Incubarea se face cu CO2 obligatoriu 10% 24-48 ore la 37C. THAIER-MARTIN

cc- col

"S" friabile, asemanatoare perielor. in genul Neisseria: Testul oxidazei in specie:

Incadrarea Incadrarea

=> oxidazo( +)=Neisseria

- Testul de umflare a capsulei => (+)=> N meningitidis => se stabile~te ~i serogruPlill acesteia - Fermentarea zaharurilor: Gonococ GLUCOZA MALTOZA ZAHAROZA +
-

Meningococ + +
-

Neisserii saprofite + + +
1

Diagnostic rapid: bazat pe reactii Ag-Ac - se pun in evidenta Ag meningococice direct din LCR - Reaqii de precipitare inelara - Reac!ii de aglutinare.

Produs patologic secre!ie nazo-faringiana - de la poarta de intrare puroi -in otite, sinuzite sputa - In pneumonii sange - In septicemie

LCR - In meningita

Recoltare ~i transport ! in meningita - recoltarea LCR o la patul bolnavului o transport rapid la 37C, este interzisa refrigerarea

macroscopic o LCR cu aspect purulent microscopic o direct o frotiu din pp. sau dupa centrifugare pentru concentrarea gerrnenilor colorat Gram sau cu albastru de metilen celule inflamatorii cocobacili G-, capsulati. In culturi vechi l~i pierd capsula izolati,in gramezi sau lanturi scurte, intraJextraleucocitar

gerrnen pretentios necesita incubare in CO2 10%, atmosfera umeda, 370C necesita factori de cre~tere o mediu Chocolat o ! S. aureus produce factor de cre~tere V

c.m.t.

C.c.
o colonii S sau M o asemanatoare cu picaturile de roua o coloniile sunt mai numeroase in jurul coloniilor de S. aureus (satelitism)

c. biochimice o indol pozitive (majoritatea) o fermenteaza inconstant zaharurile o in prezent se folosesc teste API identificare antigenica o identificarea Ag capsular K reactii de umflare a capsulei RIP, ELISA, latexaglutinare

identificarea AN o se folosesc sonde nucleotidice produse comercial

Diagnostic serologic folosit pentru verificarea raspunsului imun dupa vaccinare ELISA, RIA

Antibiograma obligatorie se face pe medii speciale (Haemophilus test medium - HTM)

Produsul patologic
falsa membrana, secretie faringiana, secrelie nazala la purtatori secretie conjunctivaH'i, vulvara, din plagi

Recoltarea se face cu 3 tampoane 1. eu primul tampon se efectueaza 3 frotiuri frotiu colorat Gram - pentru observarea morfologiei ~idispozitiei spatiale o C. diphtheriae - bacil Gram pozitiv, u~or Incurbat, cu capetele maciucate, dispus caracteristic (litere chineze~ti, chibrituri aruncate pe masa) frotiu colorat Neisser - pentru evidentierea corpusculilor metacomatici Babe~-Ernst o C. diphtheriae - prezinta corpusculi metacromatici la capete frotiu colorat Giemsa - pentru diagnosticul diferential cu angina fuso-spiralara o pe frotiu se evidentiaza fusobacterii ~i forme spiral ate (Treponema vincenti) 2. Tamponul al doilea se insamanteaza pe mediul de imbogapre oeST

incubare 12-18 ore, dupa care se izoleaza pe medii caracteristice 3. Tamponul al treilea se descarca pe medii de cultura folosite pentru izolare, identificare mediul Loffier - colonii caracteristice, circulare, u~or crenelate, alb-galbui geloza sange - colonii albe-gri, perlate, friabile mediul Gundel Tietz - se diferentiaza cele trei tipuri de bacil difteric o tipul gravis - colonii negre, de tip R, plate, cu margini crenelate,
0

centrol

mamelon at, cu striatiuni radiare, ca o tipul mitis - colonii negre, de tip S o tipul intermedius

"floare de margareta",

- colonii de tip S-R

bulion: tipul gravis - formeaza pelicula la suprafata,restul mediului ramane clar o tipul mitis - tulbura uniform mediul o tipul intermedius - formeaza inella suprafata, depozit ~i tulbura uniform mediul

Caractere biochimice
producerea de H2S - se studiaza pe mediul PISU (cu cistina)

fermentarea zaharurilor
o In funciie de fermentarea glucozei, maltozei ~i zaharozei, bacilii difterici se pot Incadra In specie (c. difteriae, hoffmanii, xerosis) o in funciie de fermentarea dextrinei, amidonului ~i glicogenului,

ti

incadram In tip (gravis, mitis ~i intermedius)

Caractere de patogenitate - cercetarea

teste in vivo teste in vitro

producerii de exotoxina difterica

o testul Elek - reaciie de precipitare In gel se toarna geloza peste

0

hfutie de filtru impregnatii fn ser antidifteric

se insamanieaza In striuri tulpinile de cercetat daca

0

tulpina produce exotoxina difterica (Ag), aceasta este eliberata

0

Jh

mediu ~i apare

banda de precipitare

o testul Ramon - reactie de floculare prin care se dozeaza putere toxica a toxinei

Diagnosticul indirect
IDR Shick - IDR de neutralizare
o se injecteaza strict intradermic 1 unitate de toxina dad organismul nu are anticorpi, toxina i~i exercita efectul eritematos ~i la locul inocuIarii apare un eritem - organism receptiv. dadi organismul are anticorpi, ace~tia vor neutraliza toxina, deci nu apar modificiiri la locul inoculiirii - organism imun

Bacillus anthracis - diagnosticul de laborator al infectiei dirbunoasc

in dirbunele cutanat - exudat din pustula maligna In carbunele intestinal - materii fecale In carbunele pulmonar - sputa In formele septicemice - sange pentru diagnostic retrospectiv - fragmente de organe

o bacB Gram pozitiv, cu capetele retezate sau u~or concave, a~ezati in lanruri, aspect ce imita trestia de bambus.

Cll

o pe medii solide - colonii de tip R cu suprafata rugoasa, centrul ombilicat, margini dantelate
Cll

prelungiri laterale (cap de Medusa)

diagnostic diferential fata de alti germeni din genul Bacillus (B. cereus) -6-

sensibilitatea la penicilina - B. Anthracis este sensibil, B. cereus esterezistent

sensihilitatea fata de bacteriofagi

4. Diagnostic retrospectiv
reaclia Ascoli - reaqie de precipitare inelara o evidenliaza prezenla antigenelor in fragmente de organe recoltate de la cadavre