Ionica Deliu

BACTERIOLOGIE
MEDICALĂ
– LUCRĂRI PRACTICE –

2020
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice

III. DIAGNOSTICUL MICROBIOLOGIC ÎN BOLILE INFECŢIOASE

În bolile infecţioase (bacteriene, virale, micotice, parazitare) diagnosticul microbiologic se

poate realiza utilizându-se două căi:
- calea microbiologică (metode de diagnostic direct), realizată prin:
o metode microbiologice clasice (care evidenţiază agentul patogen); acestea presupun:
 recoltarea şi transportul produsului biologic sau patologic corespunzător de la pacient, cât mai
aproape de debutul bolii, în funcţie de manifestarea clinică a bolii, înainte de administrarea
oricărui antibiotic sau chimioterapic, respectând regulile de asepsie;
 cultivarea produsului biologic sau patologic pe un mediu de cultură adecvat:
 bacteriile pe medii selective;
 virusurile pe medii celulare;
 izolarea în cultură pură a agentului patogen;
 identificarea agentului patogen prin teste adecvate:
 a bacteriilor prin teste biochimice şi serologice, după observarea caracterelor de cultură,
coloniale, tinctoriale, cu completarea caracterelor de patogenitate şi antigenitate;
 a virusurilor prin reacţii serologice (hemaglutinoinhibare, fixarea complementului,
seroneutralizare, teste imunoenzimatice);
o metode imunologice (evidenţiază antigenele caracteristice agentului patogen, direct în produsul
prelevat de la pacient, prin reacţii serologice de tip imunoenzimatic sau de imunofluorescenţă,
realizate cu ajutorul unor baterii de seruri imune cunoscute, cu anticorpi specifici pentru
antigenele căutate);
o metode moleculare (evidenţiază genomul agentului patogen); se pot utiliza sonde moleculare
speciale, marcate de exemplu cu izotopi radioactivi, cu ajutorul cărora se identifică gena sau
genele de interes prin metode genetice (reacţii de hibridizare a acizilor nucleici), urmate de
autoradiografie;
- calea imunologică (serologică, metode de diagnostic indirect) pune în evidenţă în serul
pacientului anticorpii specifici agentului patogen incriminat, în dinamică, utilizând antigene
standard în reacţii serologice de aglutinare, precipitare, liză, tehnici imunoenzimatice,
autoradiografie; diagnosticul imunologic se bazează pe specificitatea reacţiilor antigen - anticorp şi
prezenţa anticorpilor specifici se apreciază în dinamică, pentru diferenţierea afecţiunilor acute de
cele cronice. Se poate studia şi reactivitatea pacientului faţă de un anumit antigen inoculat (de
exemplu intradermoreacţia la tuberculină sau la candidină).

Tabel 2. Metode de diagnostic în bolile infecțioase

(http://materiale-studiu.microumftgm.ro/Lucrari%20practice/Asistenta%20medicala%20si%20Moase/02_dg_morfologie.pdf)
Boli bacteriene Boli virale Boli parazitare
METODE CLASICE DE DIAGNOSTIC (DIRECTE)
1. Examen direct al produsului Examen direct al Examen direct al produsului
Examen biologic/patologic produsului biologic/patologic
direct biologic/patologic
examen macroscopic - examen macroscopic
examen microscopic - microscopie optică: examen microscopic: examen microscopic:
 preparate native,  evidenţierea incluziilor  metode directe:
 coloraţie simplă, virale – microscopie  preparat nativ în ser fiziologic,
 coloraţii complexe; optică,  preparat nativ în soluţie Lugol,
 microscopie  frotiu colorat,
electronică;  metode de examinare în strat gros,
 metode de concentrare,
 metode larvoscopice,
 amprenta anală;
2. Izolarea germenului în cultură pură: Cultivarea virusurilor: Cultivarea paraziţilor:
Cultivare  cultivare pe medii de cultură,  culturi celulare,  pt. unicelulari se folosesc medii de
 inoculare la animale de laborator;  ouă embrionate, cultură la 37°C,
 animale de laborator,  pe animale de laborator;
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice

3. Identificarea germenului izolat în cultură Identificarea virusului Identificarea parazitului

Identificare pură: izolat:
 studiul caracterelor de cultură și  prin modificările
morfotinctoriale, caracteristice produse
 studiul caracterelor biochimice şi pe culturile de celule,
metabolice, ouă embrionate, la
animale de laborator,

 determinarea structurii antigenice:  reacţii antigen –  prin reacţii antigen anticorp,

o r. de aglutinare, anticorp;
o r. de precipitare,
o r. de umflare a capsulei,
 antibiograma,
 lizotiparea,
 tehnici de detectare a ADN-ului  detectarea ADN-ului  detectarea ADN-ului (reacţii de
bacterian (reacţii de hibridizare, viral (reacţii de hibridizare, amplificare genică -
amplificare genică - PCR), hibridizare, amplificare PCR);
 determinarea patogenităţii: genică - PCR);
o teste in vitro,
o teste in vivo (boală experim.);
METODE INDIRECTE
Diagnostic Detectarea anticorpilor specifici din Detectarea anticorpilor Detectarea anticorpilor specifici din
serologic serul bolnavilor (în dinamică); specifici din serul serul bolnavilor:
bolnavilor:
 seroconversia: creşterea  anticorpii se urmăresc în dinamică,
titrului de anticorpi în
probele de ser recoltate
la interval de 10-14
zile,
 demonstrarea unei Reacţii biologice cutanate de
infecţii acute; diagnostic (rar).

1. ETAPELE DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR

Diagnosticul de laborator bacteriologic are mai multe etape, şi anume:

a) Recoltarea şi transportul produsului biologic/patologic - cât mai aproape de debutul bolii,
înainte de administrarea vreunui tratament local sau general cu antibiotice cu spectru larg; se
realizează în funcţie de manifestările clinice ale bolii, într-o manieră corectă; se respectă
regulile de asepsie pentru a se preveni contaminarea produsului.
b) Examinarea macroscopică şi microscopică a produsului recoltat este uneori foarte utilă.
 Examinarea macroscopică a produsului poate oferi uneori informaţii preţioase, de exemplu
culoarea albastră sau albastru-verzui a puroiului sugerează că este cauzat de o infecţie cu
Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic).
 Examinarea microscopică, la microscopul optic cu imersie, reprezintă uneori o etapă
esenţială, deoarece orientează paşii ulteriori de diagnostic. Se realizează din produsul
recoltat două frotiuri, care se colorează cu albastru de metilen şi prin coloraţie Gram (iar în
cazul unei suspiciuni de infecţie cu Mycobacterium tuberculosis se realizează un al treilea
frotiu, colorat Ziehl-Neelsen). Pe frotiu se observă prezenţa diferitelor celule, eventual cu
modificări, a celulelor inflamatorii (de exemplu polimorfonucleare neutrofile), a celulelor
bacteriene.
În cazul în care produsul recoltat e reprezentat de sânge, materii fecale, urină, nu se execută
de obicei frotiu colorat; în cazul materiilor fecale se poate executa un preparat proaspăt între lamă şi
lamelă (coprocitogramă) în care se pun în evidenţă în special leucocitele; în cazul infecţiilor urinare
se obţine prin centrifugare un sediment urinar, care se observă de asemenea la microscop între lamă
şi lamelă, apreciindu-se prezenţa leucocitelor, a celulelor bacteriene şi a altor tipuri de celule,
normale sau modificate.
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice

Coloraţia Gram
Fișa de lucru

Principiul tehnicii:
Se face o coloraţie a celulelor bacteriene cu un colorant bazic (violet de genţiană), care va
pătrunde în celule şi va reacţiona cu componenţii acizi din citoplasmă. Se tratează celulele cu un
mordant (soluţie Lugol) care va forma un complex intracelular substrat – mordant - colorant. Se
decolorează celulele cu o soluţie alcool:acetonă, complexul format rămâne în celulele Gram (+), pe
când din cele Gram (-) iese. Se face o recolorare cu fuxină, care colorează în roşu doar bacteriile
Gram (-) decolorate, pe când cele Gram (+) rămân colorate în violet (Fig. 3).
Materiale necesare:
- soluţie cristal violet sau violet de genţiana;
- soluţie mordant (Lugol: iod în iodură de potasiu);
- soluţie decolorantă (alcool:acetonă = 3:1);
- soluţie fuxină diluată;
- produs patologic recoltat (sau culturi pure bacteriene de 24 ore);
- lame degresate;
- ansă bacteriologică; pipete Pasteur;
- bec de gaz; cristalizor; suport pentru lame; suport pentru uscarea lamelor;
- vas cu amestec dezinfectant; vas cu apă de robinet
- pipete pentru coloranți;
- microscop; lichid de imersie.
Tehnica de lucru:
- se fac frotiuri fixate la flacără din produsul patologic (sau cultura bacteriană) cu ajutorul ansei
bacteriologice sau cu pipeta Pasteur;
- se colorează cu soluţie violet de genţiana 1 - 3 minute;
- se spală cu apă de robinet;
- se mordansează cu soluţie Lugol 2 - 4 minute;
- se varsă mordantul;
- se spală cu apă de robinet;
- se decolorează cu amestecul alcool:acetonă, turnând decolorantul pe lama înclinată 5 - 8 secunde;
- se spală abundent cu apă de robinet deasupra cristalizorului;
- se recolorează cu soluţie fuxină bazică 1 minut;
- se spală prelung cu apă de robinet;
- se usucă la temperatura camerei în suport;
- se examinează la microscop cu obiectivul cu imersie.
Interpretarea rezultatelor:
După colorarea cu violet de genţiana, toate bacteriene sunt colorate în violet. După
decolorarea cu amestecul alcool - acetonă, celulele Gram (+) rămân colorate în violet, cele Gram (-)
sunt decolorate. După recolorarea cu fuxină bazică, celulele Gram (-) sunt colorate în roşu, cele
Gram (+) rămânând colorate în violet. Celulele eucariote se colorează ca şi bacteriile Gram (-), cu
excepţia levurilor, care sunt colorate ca bacteriile Gram (+).

Fig. 3 - a. Staphylococcus aureus, colorație Gram

(http://www.studyblue.com/notes/note/n/micro-lab-exam-1/deck/5682780)
- b. Escherichia coli – colorație Gram
(http://visualsunlimited.photoshelter.com/image/I0000zNfHTdJRuEo)
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice

Exemple:
Bacterii Gram (+) Bacterii Gram (-)
- Staphylococcus sp. - Salmonella sp.
- Streptococcus sp. - Escherichia coli
- Bacillus anthracis - Proteus mirabilis
- Corynebacterium diphteriae - Neisseria sp.

Coloraţia Ziehl - Neelsen

Fișa de lucru
Principiul tehnicii:
Această coloraţie este utilizată pentru evidenţierea microorganismelor acido-alcoolo-
rezistente (Mycobacterium tuberculosis). Bacteriile de acest gen sunt greu de colorat cu tehnicile
uzuale datorită cantităţii mari de lipide care formează un înveliş protector în jurul celulelor (în
special acizii micolici). Colorarea lor e posibilă doar în condiţii energice, cu fuxină fenolată
concentrată, la cald. În urma decolorării cu acid rămân coloraţi bacilii acido-rezistenţi (cei
tuberculoşi şi cei paratuberculoşi) şi se decolorează celelalte bacterii. După decolorare cu alcool se
vor decolora bacilii paratuberculoşi (acido-rezistenţi, dar nealcoolo-rezistenţi), pe când bacilii
tuberculoşi rămân coloraţi. Se face recolorare de contrast cu soluţie albastru de metilen fenicat, în
urma căreia bacilii paratuberculoşi și bacteriile decolorate anterior se vor colora în albastru, pe când
bacilii tuberculoşi vor rămâne coloraţi în roşu.
Materiale necesare:
- soluţie fuxină fenolată concentrată,
- soluţie H2SO4 20%,
- soluţie alcool etilic 76o sau 96°,
- alcool metilic absolut,
- soluţie albastru de metilen fenicat,
- vas cu apă de robinet,
- produs patologic sau cultură bacteriană,
- lame de microscop, cutii Petri, ansă bacteriană,
- bec de gaz, cristalizor, suport pentru colorarea frotiurilor, suport pentru uscarea lamelor,
- microscop, lichid de imersie, hârtie de filtru.
Tehnica de lucru:
- se fac frotiuri fine din produsul patologic sau din cultura bacteriană şi se usucă la termostat în cutii
Petri acoperite,
- se fixează frotiurile prin căldură sau cu alcool metilic pur, care e lăsat să se evapore complet,
- se colorează frotiurile cu fuxină fenolată concentrată, lama încălzindu-se la flacăra becului de gaz 5
- 10 minute până la emisie de vapori (se evită fierberea, care ar produce artefacte),
- se spală cu apă de robinet,
- se tratează frotiurile cu H2SO4 20% timp de 2 minute,
- se spală cu apă de robinet; vor rămâne colorate toate bacteriile acido-rezistente;
- se tratează frotiurile cu alcool etilic 96o timp de 3 - 5 minute,
- se spală cu apă de robinet; în această fază se vor decolora germenii acido-rezistenţi, dar nealcoolo -
rezistenţi (bacilii paratuberculoşi) care ar putea fi în preparat;
- se face recolorare de contrast cu albastru de metilen 30 - 60 secunde,
- se spală cu apă de robinet,
- se usucă la aer,
- se examinează frotiurile la microscop cu obiectiv cu imersie.
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice

Interpretarea rezultatelor:
Bacilii acido-alcoolo-rezistenți (BAAR) apar colorați în roşu strălucitor, pe când bacteriile
nerezistente la acţiunea decoloranţilor (acizi, alcooli) apar colorate în albastru (Fig. 4).

Fig. 4. Mycobacterium tuberculosis - coloraţie Ziehl – Neelsen din spută

(http://www.digitalpathology.uct.ac.za/topics/classic_cases_of_tb/post_pulmonary_tb.html)

c) Izolarea microorganismului în cultură pură se face prin metode adecvate, care permit
obţinerea de colonii izolate pe mediul solid şi apoi obţinerea culturii pure din aceste colonii
izolate. Se utilizează medii de cultură care se aleg în funcţie de situaţie şi de microorganismul
presupus că ar cauza infecţia. Metodele de obţinere a coloniilor izolate sunt:
 Tehnica epuizării ansei: Bucla ansei, în care se recoltează o cantitate mică de inocul,
descrie un traseu lung pe suprafaţa mediului solidificat, lăsând în fiecare sector al plăcii un
număr din ce în ce mai mic de celule, astfel încât, în ultimul sector, şansa de a depune
celule izolate spaţial este mai mare. Prin incubarea ulterioară a plăcilor la termostat, la
37°C, timp de 24 - 48 ore, prin multiplicarea celulelor izolate, vor rezulta colonii izolate.
Cele două variante ale metodei sunt: epuizarea ansei pe sectoare, în striuri paralele (Fig. 5,
a) şi epuizarea ansei prin fracţionarea striurilor (Fig. 5, b).
 Tehnica diseminării inoculului diluat pe suprafaţa mediului solid cu ajutorul baghetei de
sticlă, care presupune obţinerea coloniilor izolate (în scopul obţinerii de culturi pure) în
cazul probelor puternic contaminate prin distribuirea omogenă pe suprafaţa mediului a
unui inoculul diluat zecimal, cu ajutorul baghetei sterile ”în L”.
 Tehnica însămânţării prin încorporarea inoculului, care se practică pentru cultivarea unor
microorganisme ce necesită o presiune parţială a oxigenului mai scăzută decât cea
atmosferică; inoculul sub formă de diluții zecimale este inclus în mediul de cultură solid,
care a fost lichefiat anterior în baie de apă și lăsat să se răcească până la 50°C (Fig. 6).

b
Fig. 5. Tehnica epuizării ansei
(a - http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160500002531)
(b - http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/Lecture4-Microbio.htm)
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice

Fig. 6. Tehnica diseminării inoculului diluat pe suprafaţa mediului solid cu ajutorul

baghetei de sticlă și tehnica însămânţării prin încorporarea inoculului

d) Identificarea microorganismului patogen se face parcurgând mai multe etape, pentru o

caracterizare cât mai completă:
 Aprecierea caracterelor de cultură şi ale coloniilor, în medii lichide şi pe medii solide,
stabilind caracterele diferenţiale care să permită identificarea germenilor; caracterele
observate timp de 48 de ore pot da informaţii asupra tipului respirator al bacteriilor
(anaerobe sau aerobe stricte, microaerofile, aerobe facultativ anaerobe) şi asupra mobilităţii
acestora; coloniile pe mediu solid pot fi de tip “S” sau “R” (majoritatea bacteriilor
patogene dau colonii de tip ”S”, dar Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium
tuberculosis, Bacillus anthracis dau colonii de tip ”R”, iar Klebsiella pneumoniae
capsulate determină formarea de colonii mucoase, de tip ”M”).
Colonia bacteriană este rezultatul multiplicării într-un spaţiu limitat a unei singure celule,
aparţinând unei specii bacteriene. Se înregistrează:
- momentul apariţiei coloniilor;
- gradul de uniformitate a coloniilor;
- forma coloniilor (Fig. 7); marginea coloniilor ciliată (Fig. 8); profilul coloniilor (Fig. 9);
- consistenţa coloniilor;
- culoarea coloniilor;
- gradul de transparenţă a coloniilor;
- aspectul suprafeţei coloniilor;
- gradul de emulsionare a coloniilor în apă; caracterul suspensiei rezultate după emulsionare;
- mărimea coloniilor.

Fig. 7. Forme de colonii Fig. 8. Marginea coloniilor

 Bacteriologie medicală – Lucrări practice

Fig. 9. Profilul coloniilor

 Studiul morfologic al germenilor, pe preparate microscopice native şi fixate, utilizând

diferite coloraţii, stabileşte forma şi gruparea celulelor, mobilitatea acestora, dimensiunea
lor, prezenţa structurilor caracteristice. Investigaţia microscopică se poate realiza cu
ajutorul mai multor tehnici de microscopie:
 microscopie optică – materialul din preparat este străbătut de un fascilul luminos; se folosesc
preparate proaspete (native), cu microorganisme în stare vie, eventual colorate prin colorație
vitală sau frotiuri (preparate cu microorganisme omorâte prin fixare, colorate prin colorații
simple sau complexe);
- cu fond clar, cu obiectiv:
- uscat - între lentila obiectivului şi preparat se interpune aerul, diferenţa dintre indicele
de refracţie al sticlei (n = 1,5) şi cel al aerului (n = 1) determină refracţia razelor de
lumină, astfel încât o parte dintre ele nu mai intră în obiectiv;
- umed (cu imersie) - între lama de sticlă şi lentila obiectivului se interpune o picătură
de lichid de imersie, cu un indice de refracţie aproximativ egal cu al sticlei, astfel încât
claritatea imaginii este mai mare; ca lichide de imersie se pot utiliza: uleiul de cedru (n
= 1,51), balsamul de Canada (n = 1,53), uleiul de parafină (n = 1,47);
- cu fond întunecat, pentru observarea microorganismelor care sunt foarte transparente în
stare vie (de exemplu Treponema pallidum) şi nu pot fi observate la microscopul cu fond
clar; se utilizează un condensator special (cardoid sau paraboloid), cu două fante laterale,
care permit iluminarea laterală a preparatului, câmpul microscopic rămânând întunecat;
- cu contrast de fază, tehnică bazată pe fenomenul de interferenţă a două unde luminoase,
imaginea microorganismelor apare mai întunecată în raport cu fondul preparatului, când
razele transmise şi cele difractate de particula obiect ating planul imaginii (la nivelul
ochiului) cu o diferenţă de fază.
 microscopie electronică - materialul din preparat este străbătut de un fascicul de electroni;
- de transmisie, care redă contrastul rezultat din străbaterea materialului celular de către
fluxul de electroni; pentru observarea structurilor interne fine, materialul trebuie fixat,
deshidratat, inclus în material polimeric şi secţionat, secţiunile extrem de fine depuse pe
grilele de microscopie colorându-se apoi cu săruri de metale grele;
- de baleiaj (de scanare), care utilizează alt principiu pentru formarea imaginii, o amplificare
electronică a semnalului generat de iradierea suprafeţei materialului cu un fascicul foarte
îngust de electroni.
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice

Examinarea microorganismelor în stare vie

Fișa de lucru

Materiale necesare:
- cultura de microorganisme în mediu lichid sau o suspensie în mediu lichid dacă germenii au fost
cultivaţi pe mediu solid;
- lame şi lamele degresate, curate; cristalizor, suport de colorare,
- pipete Pasteur sterile; bec de gaz; vas cu amestec oxidant; hârtie de filtru; microscop.
Tehnica de lucru:
- se flambează lama de sticlă, se aşteaptă răcirea ei sau se folosesc lame sterilizate în pachet la
etuvă;
- se recoltează steril cu pipeta Pasteur un fragment din cultura bacteriană şi se depune o picătură pe
lama de sticlă;
- peste picătura de suspensie bacteriană se aşează cu grijă o lamelă, evitând formarea de bule de aer;
- se îndepărtează excesul cu hârtia de filtru (se recomandă să nu se formeze exces de lichid);
- se examinează imediat la microscop, cu obiectiv 40, diminuând intensitatea luminoasă a câmpului;
- dacă examinarea durează mai mult, se pot unge marginile lamelei cu ulei de parafină, pentru a nu
se evapora preparatul.
Interpretarea rezultatelor:
- celulele bacteriene vor apărea mai refringente pe fondul clar, dar nestrălucitor al câmpului
microscopic; se poate aprecia forma și gruparea bacteriilor, precum și mobilitatea acestora:
- deplasarea activă a microorganismelor în toate direcţiile este dovada unei mobilităţi reale;
- deplasarea într-o singură direcţie este deplasarea bacteriilor imobile antrenate de curentul
de lichid ca urmare a înclinării platinei microscopului;
- mişcările trepidante fără o deplasare reală în spaţiu sunt urmări ale mişcărilor browniene ale
lichidului suspensiei.

Coloraţia vitală
Materiale necesare:
- colorant vital - albastru de metilen 0,2%; roşu neutru 0,5%;
- preparatul bacterian proaspăt, executat anterior; vas cu amestec dezinfectant; hârtie de filtru;
microscop.
Tehnica de lucru:
- se pune pe lama de microscop o picătură de colorant peste cea de suspensie bacteriană;
- se acoperă cu o lamelă de sticlă;
- se examinează la microscop cu obiectivul 40.
Interpretarea rezultatelor:
- celulele bacteriene apar mai colorate în raport cu fondul preparatului şi sunt mobile dacă au
flageli.

Examinarea microorganismelor pe preparate fixe

Fișa de lucru

A. Prepararea frotiurilor
Materiale necesare:
- cultură bacteriană;
- T.F.S. soluţie de lucru sau apă fiziologică sterilă;
- lame de sticlă curate, degresate; ansă de platină/pipete Pasteur; cristalizor;
- stativ pentru colorarea lamelor; suport pentru uscarea lamelor;
- bec de gaz; vas cu amestec dezinfectant.
Tehnica de lucru:
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice

A.1. Executarea frotiului cu germeni crescuţi în mediu lichid

- se flambează lama de sticlă;
- se aşteaptă răcirea lamei;
- se depune pe lamă o picătură din proba de examinat, cu o pipetă Pasteur sau cu ansa
bacteriologică;
- se etalează suspensia în strat subţire, circular, ţinând pipeta paralel cu lama de sticlă;
- se usucă frotiul la 37°C sau la temperatura camerei.
A.2. Executarea frotiului cu germeni crescuţi pe mediu solid
- se flambează lama de sticlă;
- se aşteaptă răcirea lamei;
- cu bucla unei anse sterile se depune în centrul lamei o picătură de apă fiziologică sterilă sau TFS;
- se recoltează în bucla ansei o cantitate mică de bacterii;
- bacteriile se dispersează omogen în picătura de pe lamă şi suspensia se etalează, descriind traseuri
concentrice, ovale, pe lama de microscop, cu ajutorul ansei;
-se sterilizează ansa, după uscare în partea rece a flăcării;
- preparatul se usucă la temperatura camerei sau la termostat la 37°C, eventual acoperit cu capacul
unei cutii Petri.

B. Fixarea frotiurilor
Materiale necesare:
- frotiul bine uscat;
- bec de gaz;
Tehnica de lucru:
B.1. Fixarea cu ajutorul căldurii
- se trece frotiul de 2 - 3 ori prin flacăra unui bec de gaz, timp de o secundă, ţinând lama de margini
la una din extremităţi, cu preparatul în sus;
- încălzirea lamei se face la 60 - 70°C, temperatură suportată de dosul mâinii, deasupra degetului
mare;
- preparatul nu trebuie supraîncălzit; el trebuie să fie bine uscat, altfel picăturile din frotiu
antrenează germenii în mediul înconjurător prin aerosolii formați.
Fixarea se poate face și prin metode chimice, utilizând alcool etilic sau metilic.

C. Colorarea frotiurilor
Materiale necesare:
- coloranți utilizați: colorant Loëffler = soluţie hidroalcoolică de albastru de metil sau fuxină bazică
în soluţie hidroalcoolică;
- frotiuri bacteriene uscate și fixate; vas cu apă de robinet;
- cristalizor; suport pentru lame; suport pentru uscarea lamelor; vas cu amestec dezinfectant;
Tehnica de lucru:
- frotiurile fixate se aşează pe suport metalic sau de sticlă deasupra unui cristalizor;
- se aplică pe frotiu colorantul, cu o sticluţă picurătoare sau cu o pipetă şi se lasă timp de 1 - 2 min;
- se spală excesul de colorant cu apă de robinet;
- lamele se usucă la temperatura camerei în stative speciale de lemn sau pe hârtie de filtru.

D. Examinarea frotiurilor
- examinarea frotiurilor la microscop se face întâi cu obiective mici, pentru fixarea imaginii, apoi cu
obiectiv cu imersie, mărind cantitatea de lumină.
 Bacteriologie medicală – Lucrări practice

 Studiul caracterelor biochimice ale bacteriilor cultivate, prin însămânţare pe medii

adecvate, pentru studiul metabolismului glucidelor, proteinelor, lipidelor, activităţii
catalazice, activităţii hemolitice etc. Se utilizează frecvent medii multitest, care relevă în
acelaşi timp mai multe proprietăţi ale tulpinii bacteriene studiate;
Testele biochimice care determină capacitatea enzimatică a bacteriilor pot detecta:
 o singură enzimă:
o testul catalazei, testul coagulazei, testul oxidazei,
o testul pentru indol,
o testul ADN-azei,
o testul PYR,
o testul hidrolizei hipuratului,
o testul ONPG,
o testul ureazei;
 căi metabolice:
o oxidarea și fermentarea carbohidraților:
 testele de oxidare – fermentare,
 testele de fermentare a carbohidraţilor,
 testul Roșu Metil,
 testul Voges Proskauer;
o degradarea aminoacizilor:
 reacţiile de decarboxilare,
 reacţiile de deaminare,
 reacţii de decarboxilare și deaminare;
o utilizarea unui anumit substrat:
 testul utilizării citratului,
 testul utilizării acetatului,
 testul utilizării acetamidei;
Stabilirea profilului de sensibilitate/rezistență se realizează prin:
 testul sensibilităţii la bacitracină,
 testul sensibilităţii la biseptol (sulphamethoxazole - trimethoprim),
 testul sensibilităţii la novobiocină,
 testul sensibilităţii la vancomicină,
 testul sensibilităţii la antibiotice.
 Studiul caracterelor serologice ale microorganismelor studiate, pentru evidenţierea
serotipului, serogrupului. În reacţii antigen - anticorp (de obicei de aglutinare pe lamă şi în
tub) se utilizează baterii de seruri imune cu anticorpi specifici (monovalente sau
polivalente), pentru identificarea antigenelor caracteristice microorganismului studiat
(serotipizare);
 Studiul caracterelor de patogenitate şi toxigeneză prin inocularea culturii pure la
animale de laborator sensibile.
 Studiul sensibilităţii microorganismelor izolate la bacteriofagi specifici (lizotipia);
 Studiul caracterelor genetice se realizează prin tehnici de microbiologie moleculară (de
exemplu reacţii de polimerizare în lanţ = PCR);
 Studiul sensibilităţii microorganismelor izolate la antibiotice cu stabilirea antibiotipului
se realizează prin antibiograme calitative şi cantitative, care pun în evidenţă spectrul de
sensibilitate la antibiotice şi concentraţia minimă inhibitorie. Aceasta din urmă poate fi
stabilită numai prin metode cantitative.