REACTIA DE PRECIPITARE IN AMESTEC

-TITRAREA TOXINEI DIFTERICE

Reactia de floculare Ramon
cantitati egale cantitati
variabile
de ag=toxina + de
Ac
difterica de titru
cunoscut
(componenta
de titrat)
Cantitatea maxima de precipitat
apare in tubul in care exista
raportul de echivalenta a
sistemului antigen-anticorp.
Cunoscand titrul anticorpilor aflam
titrul toxinei: se masoara in Lf=
limes floculans = cantitatea de
toxina care se combina cu o
 REACTIA DE PRECIPITARE IN INEL
R. ASCOLI- antrax (B.
carbunos)
Sol de ag se prepara pornind
de la organe, de ex splina,
recoltate de la animal care a
decedat cu suspiciune de
antrax.

3 tuburi, (1 pt reactie si 2
martori)
1st tub martor: 0.5 ml ser
anticarbunos + 0.5 ml SSF
(pozitiv)
2nd tub martor: 0.5 ml ser
de cal + 0.5 ml sol de ag
(negativ)
Tub de reactie: 0.5 ml ser
anticarbunos + 0.5 ml sol de
 PRECIPITAREA IN GEL DUBLA DIFUZIE
TEST ELEK
Este o metoda de
depistare a tulpinilor
toxigene de
Corynebacterium
diphteriae; prezenta
toxinei e demonstrata prin MN = TULPINA NE-
aparitia unor linii de TOXIGENA
precipitare.
In placa Petri se Antico
decupeaza un sant in rpi
mediu pe unul din TULPINA TESTATAanti
toxina
diametre si se pipeteaza
difteri
0.5 ml de ser antidifteric ca
(anticorpi anti toxina
difterica de 1000UI/ml)
Anticorpii vor difuza in
mediu. MP = TULPINA
Dupa 2 ore insamantam TOXIGENA
perpendicular pe sant MP
(1 tulpina toxigena) si MN
 REACTIA DE AGLUTINARE
Aglutinarea directa = Ag natural (bacterie
+ Ac specifici
diagnostic bacteriologic, identificarea enerobacteriilor
diagnostic serologic, determinarea grupelor sangvine

Aglutinarea indirecta = Ag sau Ac se

cupleaza in vitro
cu diferite particule ( latex, cristale ) si apoi intra in react
se utilizeaza in determinarea factorului reumatoid, CRP, grupului
streptococic

Hemaglutinarea = hematiile pot aglutina in

prezenta unor
toxine bacteriene
 AGLUTINAREA PE LAMA
SCOP
Direct: identificarea
rapida a unor tulpini
izolate din produsul
patologic
Indirect: detectarea Ac in
ser si stabilirea titrului

TEHNICA
ser cu Ac cunoscuti +
colonie bacteriana =
grunji fini (1)
ser fiziol.+ colonie
bacteriana =
susp.omogena (2)
 AGLUTINAREA IN
TUBURI

1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 Neg.
ctrl
 Reacii Ag-Ac care utilizeaz
componente marcate

Reacii imunoenzimatice, variante

Reacii de imunofluorescen
ELISA
understanding the acronym
ELEnzyme-linked
An enzymes activity is used as a
reporter to test for the
presence/amount of a protein of
interest.
The enzymatic reaction will produce a
colored species.
ELISA
understanding the acronym
EL Enzyme-linked
IS Immunosorbent
An antibody or antigen (immuno) is
adsorbed (sorbent) onto the
polystyrene wells in which we
conduct the test.
One antibody is already adsorbed
added to the wells and a second
antibody with our enzyme will be
added in the type of ELISA we will
perform today.
ELISA
understanding the acronym
EL Enzyme-linked
IS Immunosorbent
A Assay
We could determine the amount
(quantitative assay).
We will use concentration standards
to construct a standard curve.
ELISA: uses antibodies
What is an antibody?
What types of antibodies exist?
What kinds of antibodies are used in
our lab today?
What is an antibody?
Protein secreted by B-cells
that specifically bind a
foreign substance
(antigen)
Immunoglobulin domains
Complementarity-
determining Regions
(CDRs)
Fab= Fragment antigen
binding
Hinge
Fc= Fragment crystalline
F(ab)2= Protease
producing polyclonal
antibodies
 producing monoclonal
antibodies
1 2

3
Metode imunoenzimatice (ELISA - enzyme-linked
immunosorbent assay)
Permit detectarea antigenelor libere i a anticorpilor. Este posibil
determinare cantitativ.

La reacii particip:
1. un reactant imunologic cunoscut ataat de un suport solid (plci cu godeuri,
lame, baghete). Se pot folosi antigene, anticorpi, anticorpi monoclonali,
proteina A)

2. un reactant imunologic marcat enzimatic peroxidaza

3. un substrat specific (cromogenic). Se produce o modificare de culoare

detectabil spectrofotometric (determinare cantitativ)

4. substane pentru stoparea reaciei (baze sau acizi puternici)

Reaciile au loc n aparate automate, semiautomate.

ntre reacii splare cu soluii tampon
 A B C D E
F G H
Distribuirea probelor cu
pipeta automata

Spalat
or
autom
at
 ELISA

Microplate ELISA for antibody: colored wells indicate reactivity

Spectrofotometru
 ELISA de detectie a
anticorpilor

ETAPE
1. Incubare ser pacient 1h la 37C
2. Spalare
3. Incubare conjugat (Ac anti IgG uman x enzima)- 1h la
37C
4. Spalare
5. Incubare substrat 20 30 min la temp camerei
6. Citire la spectrofotometru DO probe, martori, cut of
ELISA de captura

ETAPE

1. Incubare ser pacient 1h la 37C

Ag marcat 2. Spalare
enzimatic
= 3. Incubare conjugat 30 min la 37C
conjugat
4. Spalare
IgM
5. Incubare substrat 20 min la t.

Anti-IgM camerei

6. Citire la spectrofotometru
 ELISA de detectie a
ETAPE
Antigenelor
1. Incubare ser pacient 1h la
37C
2. Spalare
3. Incubare conjugat 30min la
37C
4. Spalare
5. Incubare substrat 20 min la
t.camerei
6. Citire la spectrofotometru

Anticorp
cuplat cu o
enzima =
conjugat

Ag

Anticorp
Reacia de imunofluorescen (RIF)

Fluorocromii:
se leag covalent de proteine
(imunoglobuline) = conjugat
emit fluorescen dac se expun la
raze UV
izotiocianatul de fluorescein (galben-
verzui), rodamina (portocalie)
nu sunt stabili n timp
 Reactia de Imunofluorescenta directa =
detectia antigenelor ID
PP

Amprenta se va usca bine:

pp. amprentat direct pe lama

Imersie in acetona la 2-8C timp de 10

minute si uscare.
Reactivii trebuie sa fie la temp.camerei

Incubare cu anticorp fluorescent (30 min la 37 C)

Spalare
Citire la MO in lumina UV
Anticorpi monoclonali
marcati cu ITC
fluoresceina sau
rhodamina anti epitopi
specifici de la nivelul
bacteriei

ID
PP
Immunofluorescence Microsco
FLUORESCENCE MICROSCOPY
 Celule negative
Testul este
1. pozitiv daca pe lama sunt
cel putin 2 celule IFD in celule epiteliale
fluorescente
2. negativ daca sunt cel putin
20 de celule fara
fluorescenta
Metoda indirect = detectia
anticorpilor

1. Ag pe lama, este cunoscut.

2. Se adauga ser de cercetat pt detectia anticorpilor
specifici.
3. Se adaug anticorpi antiglobulina umana marcai cu
fluorocrom
4. Examinarea: la fel ca la metoda direct.