LP4 imuno

L. P. 4 IMUNOLOGIE SI IMUNOPATOLOGIE 2016-2017

Reacţia de aglutinare. Aglutinarea directă. Aglutinarea indirectă. Hemaglutinarea
(TPHA)
Reacţia de fixare a complementului (RFC). Principiu, aplicabilitate. Reacţia Bordet
Wasserman.
Reacţia de seroneutralizare. Principiu, aplicaţii. Reacţia ASLO

Reactia de aglutinare consta in reactia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafata unor

particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol), determinind aglutinarea acestora prin
scaderea fortelor electrostatice de repulsie dintre particule si formarea unor punti de legatura.
Antigenele sunt de natura corpusculara.
Aglutinarea este mai sensibila decit precipitarea, Ag fiind o particula si nu o molecula
solubila. Ac de tip IgM sunt mai aglutinanti decit Ac de tip IgG (pentru ca au mai multe
valente). Exista si Ac neaglutinanti (incompleti / blocanti) sau care aglutineaza numai la rece.

Tipuri de aglutinare:
- aglutinarea directa
- aglutinarea indirecta
- inhibarea aglutinarii
- aglutinarea in coloana
- aglutinarea mediata de Ac anti-imunoglobuline

1. Aglutinarea directa
Aglutinarea directa este aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii, celule) de catre
Ac specifici.
Aplicatii:
- in diagnosticul bacteriologic: de exemplu pentru identificarea enterobacteriaceelor
(Shigella, Salmonella, E. col, Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae) pe baza
structurii antigenice
- in diagnosticul serologic al unor boli infectioase (febra tifoida, bruceloza,
leptospiroza, rickettsioza)
- determinarea grupelor sanguine (AB0)
Aglutinarea directa pe lama – in diagnosticul bacteriologic
Materiale necesare:
- cultura de identificat (colonii de tip S, de 18-24 ore)
- solutie salina fiziologica
- Ac cunoscuti fata de Ag pe care dorim sa le identificam (Ac polivalenti, Ac
monovalenti de grup/ tip
- lame de microscop curate
- pahar Berzelius cu amestec dezinfectant
Tehnica:
- se pune pe o lama o picatura suspensie omogena din colonia de identificat in ser
fiziologic (daca suspensia se limpezeste si apar grunji, tulpina este netipabila, apare
aglutinare nespecifica, fiind probabil dintr-o colonie de tip R)

1
LP4 imuno

- se adauga o picatura de ser cu Ac cunoscuti si se realizeaza o suspensie omogena

- in cazul reactiei pozitive (corespondenta intre Ac cunoscuti si Ag de identificat) se
produce aglutinarea
Aglutinarea directa pe lama – reactia Huddleson
Aplicatii:
- diagnosticul brucelozei
Materiale:
- lame de microscop
- Ag brucelos inactivat (colorat in violet)
- ser de cercetat
Tehnica:
- se adauga o picatura de de solutie de Ag brucelos si una de ser de cercetat pe o lama
de sticla
- se omogenizeaza
- reactia este pozitiva daca apare aglutinare – Ac anti-Brucella spp sunt prezenti in serul
pacientului; reactia pozitiva pe lama trebuie confirmata prin aglutinare in tuburi.

2
LP4 imuno

3
LP4 imuno

2. Aglutinarea indirecta (pasiva)

Aglutinarea indirecta (pasiva) este o reactie in care particule artificiale (globule rosii
formolate, particule de latex, cristale de colesterol, colodiu etc) sau naturale sunt “incarcate”
in vitro cu Ag sau Ac si sunt aglutinate de catre Ac sau Ag corespondente din proba de
cercetat.

Aplicatii:
- determinarea factorului reumatoid, CRP
- determinarea grupului streptococic, a pneumococilor, meningococilor
- identificarea E. coli tip capsular K1, H. influenzae tip capsular b
- detectarea unor enterotoxine (stafilococice, clostridiene)
- detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp)
sau virusuri
- identificarea unor exotoxine in filtratul de cultura
- identificarea E. coli O:157, Legionella pneumophilla, Listeria monocytogenes

Hemaglutinarea pasiva - TPHA (Treponema pallidum hemaglutinatinare)

Metoda calitativa:
 Se face dilutia serului 1/20 (190µl diluent si 10 µl ser de analizat);
 se pun cite 25 µl proba diluata in cite 2 godeuri;
 se agita usor reactiv test si reactiv de control;
 se adauga 75µl de reactiv test in godeul 1 si 75 µl reactiv de control in godeul 2;
 se incubeaza pentru 45 minute pe o suprafata fara vibratii, la temperatura camerei;
 se citesc rezultatele

Metoda cantitativa:
 Se face dilutia serului 1/20 (190µl diluent si 10 µl ser de analizat);
 Se lasa primul godeu gol si se adauga cite 25 µl TPHA diluent pina la godeul 8;
 Se adauga 25 µl de proba in godeul 1;
 Se adauga 25 µl de proba in godeul 2 se agita si se fac dilutii seriale
 Se adaua 75 µl reacti test in toate godeurile
 Se obtin titruri de la 1/80- 1/10240
 Se incubeaza la temperatura camerei pe o suprafata fara vibratii timp de 45 de minute
 Se citesc rezultatele
DETERMINAREA TPHA :

Dupa terminarea timpilor de reactie se face citirea reactiei, notandu-se cu :

4
LP4 imuno

4+ voal neted de celule acoperind in intregime fundul godeului, uneori cu

margini cu falduri.

3+ voal neted de celule acoperind partial fundul godeului.

2+ voal de celule conturat printr-un cerc de celule.

1+ voal de celule conturat printr-un cerc de celule bine evidentiat.

+/- buton de celule cu o mica deschidere centrala.

- - buton de celule cu sau fara o foarte mica deschidere centrala.

POZITIV: de la 4+ la 1+
INCERT: +/-
NEGATIV : --
Aspectul reactivului de control nu trebuie utilizat drept comparatie pentru
esantioanele negative. Reactivul de control va da un buton de celule mai compact decat
reactivul antigen.
O aglutinare in godeul de control (3) indica prezenta aglutininelor nespecifice.
Totodata, reactiile nespecifice sunt foarte rare prin utilizarea eritrocitelor de pasare, un
esantion cu acest rezultat neputand fi interpretat.
Un rezultat pozitiv in godeurile cu esantion indica prezenta anticorpilor anti-
T.pallidum rezultanti ai unei infectii trecute sau prezente.
Un rezultat negativ in godeurile cu esantion indica absenta anticorpilor.
Un rezultat la limita in testul calitativ poate corespunde la un titru scazut de anticorpi
din stadiile precoce de sifilis sau un titru rezidual din sifilisul tratat. In acest caz, o proba
suplimentara va trebui testata pentru a demonstra o posibila crestere a titrului de anticorpi.
In metoda cantitativa titrul aproximativ va corespunde ultimei dilutii care va da o reactie
pozitiva.
LIMITELE REACTIEI

5
LP4 imuno

Tehnica TPHA poate da reactii incrucisate cu alte forme de infectii cu treponeme si reactii
fals pozitive cu probele pacientilor cu mononucleoza infectioasa, lepra sau maladii
autoimune.
Reactii fals pozitive pot cauza si serurile lipemice sau icterice.
Ocazional, in unele cazuri de sifilis primar precoce, anticorpii specifici ar putea sa nu fie
detectati prin tehnicile TPHA.
Anticorpii specifici pot persista o lunga perioada de timp, chiar daca tratamentul acestei boli
a avut succes.

6
LP4 imuno

3. Inhibarea aglutinarii
Reactia consta in inhibarea aglutinarii particulelor “incarcate” cu Ag, dupa ce in prealabil Ac
reactioneaza cu Ag corespondent.
Aplicatii:
- decelarea mioglobinei
- diagnosticul imunologic al sarcinii

7
LP4 imuno

Aglutinarea in coloana
Metoda permite o mai buna vizualizare a reactiei.
Dispozitivul utilizat are 2 compartimente, partea in care se introduc reactivii (situata
superior) si o coloana situata inferior, plina cu microparticule de sticla.
Dupa introducerea hematiilor si a serului de cercetat si incubarea acestora,
dispozitivul este centrifugat. In cazul unei reactii pozitive complexul Ag-Ac se va vizualiza la
nivelul coloanei, in timp ce in cazul unei reactii negative, hematiile se depun in portiunea
inferioara a coloanei

Aglutinarea mediata de Ac anti-imunoglobuline

Ac anti-Ig se vor cupla cu particule incarcate cu Ac si vor duce la aparitia unor aglutinate
(prin aparitia complexului imun).
Aplicatii:
- decelarea factorului reumatoid (tehnica Waaler-Rose).

8
LP4 imuno

Reacţia de fixare a complementului (RFC). Reactia Bordet - Wasserman

Principiu:
Reacţia de fixare a complementului (RFC) se bazeaza pe proprietatea sistemului C’ de
a se fixa pe complexul imun Ag-Ac.
In prima faza a reactiei se introduce serul de cercetat iar daca acest ser contine Ac
specifici fata de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fixarea C’, care se va
activa pe calea clasica si nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul hemolitic
indicator (hematii + Ac antihematie).
In cazul in care serul de cercetat nu contine Ac specifici fata de Ag cunoscut, nu va
avea loc formarea unui complex Ag-Ac in prima etapa a RFC.
Dupa introducerea in reactie a sistemului hemolitic indicator, hematiile si Ac-
antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun, iar C’ liber se va fixa pe acesta.
Dupa fixare va urma activarea C’ si respectiv liza hematiilor, hemoliza putind fi
examinata cu ochiul liber.
Pentru vizualizarea reactiei este nevoie de utilizarea unui sistem hemolitic indicator;
Ag este sub forma macromoleculara sau corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar
complexul Ag-Ac format nu devine vizibil cu ochiul liber, daca nu se adauga sistemul
hemolitic.
Aplicatii:
- diagnosticul serologic al sifilisului – reactia Bordet-Wasserman
- diagnosticul serologic al infectiilor produse de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia
spp., Rickettsia spp., Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp, virusuri
Materiale:
- serul de cercetat
- seruri de referinta (martor pozitiv si negativ)
- Ag cunoscut (suspensie corpusculara sau solutie coloidala)
- sistemul C’ obtinut din ser prospat sau conservat recoltat de la cobai
- sistemul hemolitic indicator format din: hematii de berbec si ser hemolitic anti-
hematii de berbec (obtinut prin injectari repetate de hematii de oaie la iepurele de
laborator)
- baie de apa cu temperatura reglabila
- placi cu godeuri, tuburi de hemoliza, pipete diferite
Tehnica de lucru:
- serul de cercetat se va mentine 30 minute la 56ºC, in baia de apa, pentru inactivarea C’
propriu
- etape:
 se pun in reactie C’, serul de cercetat si Ag cunoscut; sunt doua posibilitati:
 in serul de cercetat exista Ac specifici, rezultind un complex Ag-Ac pe care se va fixa C’;
 in serul de cercetat nu exista Ac specifici, nu se formeaza complex Ag-Ac, C’ ramine
liber
 se introduce in reactie sistemul hemolitic indicator (hematii+Ac anti-hematie);
exista 2 posibilitati:
 C’ nu este liber, nu are loc hemoliza
9
LP4 imuno

 C’ se fixeaza pe sistemul hemolitic, lizeaza hematiile si apare hemoliza

- se dilueaza conform indicatiilor din protocolul de lucru reactivii utilizati
- se repartizeaza in godeurile corespunzatoare serurile de cercetat, Ag si C’
- pe o placa separata se prepara martorii (martor pentru sistemul hemolitic, pentru C’,
Ag, serul de referinta si martor sigur negativ)
- placile se tin pina a doua zi la 4 ºC
- a doua zi, placile se mentin la 37 ºC timp de 30 min
- se adauga in toate godeurile sistem hemolitic
- placile se mentin la 37 ºC timp de 30 min
- se pun placile la 4 ºC, pina la sedimentarea hematiilor
- in RFC Bordet-Wasserman, metoda calitativa, reactia se realizeaza in eprubete, 2
pentru reactia propriu-zisa (una cu ser diluat 1/8, cealalta cu ser diluat 1/16, 2 pentru
martori sigur pozitiv si sigur negativ si cite una pentru fiecare din ceilalti martori,
respectiv martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C’, martor
pentru serul hemolitic).
- interpretare: se verifica reactia martorilor; in tubul cu serul de cercetat, testul este
negativ (lichidul din tub are un aspect rosu, limpede), inseamna ca nu exista Ac; testul
este pozitiv atunci cind in tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliza, hematiile se
depun formind un buton in partea inferioara a tubului (in serul de cercetat exista Ac)
Pentru a stabili diagnosticul final, este necesar ca RFC-BW sa fie confirmata prin reactii
specifice.

10
LP4 imuno

Reacţia de seroneutralizare
Principiu:
Ag are o anumita proprietate biologica (toxica, enzimatica) care poate fi blocata prin
cuplarea cu Ac specific.
Neutralizarea efectului biologic respectiv se poate realiza doar in cazul in care
determinantul pentru toxicitate sau pentru activitatea enzimatica respectiva este acelasi cu
determinantul antigenic (epitop). RSN are nevoie de un artificiu tehnic pentru a permite
vizualizarea rezultatelor.
Aplicatii:
- diagnosticul microbiologic direct:
 identificarea Clostridium perfringens prin metoda placilor semineutralizate
 testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de seroprotectie)
 toxinotipia in cazul suspicionarii unei toxiinfectii alimentare cu Clostridium botulinum
- diagnosticul serologic:
 reactia ASLO
- prevenirea unor boli infectioase prevenibile prin vaccinare si evaluarea eficacitatii
vaccinale:
 vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, ATPA, ADPA)
 titrarea prezentei Ac anti-toxine (difterica, tetanica)
 testarea prin IDR (intradermoreactie) a susceptibilitatii fata de o anumita boala infectioasa
care are la baza drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine
- tratamentul/ profilaxia unor boli infectioase prin utilizarea de imunoglobuline
specifice omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe

Reactia ASLO
Reactia ASLO determina titrul Ac antistreptolizina O (SLO).
Aplicatii:
- diagnosticul retrospectiv al unei infectii streptococice
- confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice
Principiu:
Titrarea Ac anti-SLO se bazeaza pe faptul ca SLO are efect hemolitic asupra hematiilor
de iepure sau de berbec. In cazul in care in serul de cercetat exista Ac anti-SLO, actiunea
hemolitica a SLO este neutralizata. Combinind dilutii din serul de cercetat cu o cantitate
constanta de SLO se poate determina titrul ASLO.
Materiale si reactivi necesari:
- ser de cercetat
- SLO liofilizata
- singe defibrinat de iepure/ berbec
- solutie salina izotona, solutie de rivanol 0,3%
- eprubete, pipete gradate
- baie de apa, centrifuga
Tehnica:
- se omogenizeaza suspensia de hematii

11
LP4 imuno

- se indeparteaza inhibitorii SLO din serul de cercetat (se utilizeaza solutie de rivanol si
suspensie de carbune activ, se realizeaza o dilutie de 1/10 a serului care se va mentine
30 minute la 56ºC)
- se realizeaza dilutiile de ser si se repartizeaza in tuburile de reactie (ser in dilutii
succesive) impreuna cu SLO (in cantitate constanta, cite 0,5 ml/tub); combinarea
serului de cercetat cu SLO reprezinta prima etapa a reactiei;
- se agita tuburile pentru omogenizare si se mentin 15 minute la 37 ºC
- urmeaza a doua etapa a reactiei ASLO, respectiv adaugarea suspensiei de hematii
(5%), cite 0,5 ml in fiecare tub
- se agita pentru omogenizare si se incubeaza timp de 45 minute la 37 ºC
- se centrifugheaza tuburile timp de 1 minut (1500 rotatii/ minut) si se mentin pina a
doua zi la 4 ºC
- interpretare: pornind de la o dilutie initiala a serului de 1/10, dupa adaugarea tuturor
reactivilor titrul (numarul de unitati ASLO) va fi 12, 50 in tubul urmator, 100, 125,
166, 250, 333 etc in tuburile urmatoare. Titrul reactiei ASLO este dat de cea mai mare
dilutie de ser la care lipseste complet hemoliza. Valoarea normala este de 200- 250
unitati ASLO.

Utilizarea RSN in profilaxia si tratamentul unor boli infectioase

12
LP4 imuno

Vaccinarea in scopul obtinerii unei protectii prin seroneutralizare

Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) in faza I,
combinata cu anatoxina difterica si tetanica.
Primovaccinarea se incepe cu virsta de 2 luni a nou-nascutului, administrindu-se 3
doze la interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni).
Pentru mentinerea imunitatii se practica revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare,
iar revaccinarea a II-a se practica la 36 luni de viata a copilului respectiv.

Evaluarea eficacitatii vaccinurilor

Se recomanda testarea starii de imunitate indusa prin vaccinare; metodele au la baza
titrarea Ac anti-toxina (difterica, tetanica) in seruri prelevate de la copii vaccinati. Se
considera ca un copil este protejat (prezinta rezistenta specifica in cazul unei infectii
difterice) daca titrul Ac-anti toxina difterica este mai mare de 0,03 UAI/ ml (UAI =
unitate anti-toxica internationala)
Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica daca persoana
investigata este sau nu protejata fata de o anumita infectie prin IDR. IDR Dick permite
testarea susceptibilitatii fata de scarlatina (toxina este elaborata de catre streptococul de
grup A lizogenizat).
IDR Schick permite testarea susceptibilitatii fata de difterie (toxina este elaborata de
catre bacilul difteric lizogenizat.
Tehnica:
Se injecteaza in treimea medie a antebratului, strict intradermic o cantitate de 0,1 ml
toxina diluata corespunzator.
In cazul in care in singele persoanei testate se gaseste o cantitate de Ac anti-toxina mai
mare de 0,03 UAI/ ml, toxina inoculata va fi neutralizata si nu va aparea nicio modificare
la locul inocularii (lipsa eritemului semnifica faptul ca persoana testata nu este
susceptibila sa faca difterie, in cazul in care se infecteaza cu un bacil difteric toxigen).
In cazul in care persoana respectiva nu prezinta Ac anti-toxina difterica, Ag inoculat
va conduce la aparitia unui eritem la locul de inoculare.

Terapia sau profilaxia specifica (imunoterapie pasiva)

 administrarea de Ig specifice omologe, obtinute de la persoane imunizate (natural
sau artificial) fata de o anumita boala infectioasa; de exemplu in imunoterapia
infectiei cu Clostridium tetani (tetanos) se pot administra im 3-6.000 UAI
 administrarea de seruri imune heterologe, obtinute prin hiperimunizarea cailor, in
tratamentul tetanosului, difteriei, botulismului
Terapia bolilor in care mecanismul patogenic implica exotoxine trebuie instituita cit mai
rapid, deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci cind se gasesc in circulatie.

13