Tehnica imunoenzimatică ELISA

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay – reprezintă la ora actuala una din cele
mai des folosite metode de identificare și apreciere cantitativă pentru anticorpi, antigene,
hormoni si o paletă largă de alte molecule, inclusiv peptide sintetice.
Testele ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) reprezintă o metodă sensibilă
deoarece fiecare moleculă de enzimă poate converti multe molecule de substrat servind ca
amplificator al reacției. Enzimele dau în reacție produși colorați care precipită, astfel incât nu
difuzează de la locul de formare.
In cele mai multe laboratoare testele ELISA sunt automatizate și sunt utilizate pentru
determinarea de testosteron liber, 17-OH progesteron, Ac anti-LKM1, Ac anticardiolipinici
IgG, Ac antispermatozoizi, serologie paraziti, etc.
I. PRINCIPIUL METODEI
Se bazează pe recunoastere unui antigen de catre un anticorp conjugat cu o enzima a
carei reactie determina o schimbare de culoare ce poate fi evaluata.
II. MOD DE LUCRU
Implementarea unei tehnici ELISA in laboratorul clinic implică parcurgerea
următoarelor etape:
1. Prepararea conjugatului
Conjugatul reprezintă un Ag sau un Ac cu specificitate pentru molecula de determinat,
cuplat cu o enzimă.
Desi un grup mai mare de enzime au fost utilizate de-a lungul timpului, fosfataza
alcalina si peroxidaza raman cele mai utilizate enzime datorita randamentului oferit prin
prelucrarea rapida a substratului si a gamei vaste de tehnici de developare existente. În cazul
in care conjugatul folosit este reprezentat de un grup enzima-Ac, Ac respectiv trebuie să fie
ales in asa fel incat sa recunoasca alt determinant antigenic al moleculei de determinat cum ar
fi fragmentul Fc al imunoglobulinei sau alt epitop al Ag.
2. Fixarea Ac de captură pe placă
In general se folosesc plăci cu 96 godeuri fabricate din plastic.
Majoritatea proteinelor pot fi adsorbite pe suprafețe din plastic datorită interacțiunilor
hidrofobe intre structurile proteice nepolare si structurile nepolare ale matricei polimerului.
Există mai multe protocoale de fixare, dar cel mai des folosite, implică incubarea unei diluții a
Ac de captura in godeul plăcii de microtitrare, intr-un tampon carbonat la pH 9 – 10.
Incubarea poate fi de câteva ore sau peste noapte și se face la 37 0C sau la temperatura
camerei.
Placa de microtitrare astfel pregătită poate fi păstrată la 40C până la 6 luni
3. Incubarea Ag sau Ac de determinat in placă
Adăugarea diluției de Ag in placa de reacție reprezintă prima etapă efectivă a tehnicii ELISA.
In această etapă molecula de determinat se atașează prin legături de hidrogen, ionice
interacțiuni hidrofobe și forțe de interacțiune van der Waals de Ac complementar, de captură.
Incubarea se realizează de obicei timp de 2 ore, la temperatura camerei.
4. Indepărtarea reactanților liberi din placă (spalarea)
Spalarea se realizeaza cu un tampon de spalare, de obicei fosfat salin (TFS) la care se poate
adauga 0,05% azida de sodiu (NaN3).
Se fac mai multe spalari pentru indepartarea a oricarei urme de tampon. Foarte importante
sunt spalarile dupa fixarea Ag de placa, dupa prima incubare si dupa incubarea cu solutia de
conjugat.
5. Incubarea conjugatului in placa
In functie de tipul ELISA aplicat, adaugarea conjugatului in reactie presupune legarea
acestuia de Ac de determinat sau de Ag specific. Dupa incubare, placile sunt spalate si pot fi
pastrate la 40C cateva luni pana la adaugarea substratului cromogen.
6. Adăugarea substratului cromogen
Substratul cromogen este adăugat in godeuri și placa este incubată la intuneric o anumita
perioada de timp, in functie de caracteristicile enzimei si ale substratului, si reactia este oprita
prin adaugarea unei solutii de stopare. Timpul de incubare al substratului cromogen in proba
cu conjugatul fixat se determina empiric prin observarea modificarii culorii amestecului de
reactie pana la o intensitate comparabila cu cea teoretica a produsului final. Conjugatul poate
fi reprezentat de o enzima cuplata cu streptavidina, o proteina tetramerica obtinuta din
bacteria Streptomyces avidinii, ce are o afinitate foarte mare pt biotina (vitamina H). Biotina
poate fi cuplata prin diverse procedee la un anticorp si astfel, pe baza afinitatii streptavidinei
pt. biotina, conjugatul se poate cupla la Ac biotinilat fara a fi nevoie de un conjugat enzima –
Ac specific.
7. Interpretarea rezultatelor
Constă in aprecierea culorii probei. Intensitatea culorii se apreciază mai intâi vizual, pentru
determinarea virării de culoare dupa adăugarea substratului și stabilirea timpului de menținere
a lui până la stoparea reacției.
Densitatea optică a fiecarei probe se apreciază la spectrofotometru, la o lungime de
unda corespunzătoare.
Aprecierea rezultatelor se face in doua moduri:
Metoda calitativă de apreciere a pozitivității probelor, prin calcularea valorilor prag (cut off)
față de care se raportează absorbanța fiecarei probe.
Metoda cantitativă presupune folosirea unor probe standard, de concentrații cunoscute, cu
ajutorul cărora se trasează o curbă standard.

III. TIPURI DE ELISA

Cele patru tipuri de ELISA difera prin reactantii utilizati si ordinea titrarii acestora.
A. ELISA direct
Antigenul este adsorbit pe o placă de plastic, in godeuri, apoi urmeaza etapa de incubare.
Se titreaza in godeuri, antigenul diluat in solutia tampon de ligare (coating buffer). Urmeaza etapa de
incubare. Timpul si temperatura de incubare pot varia foarte mult. De ex se poate incuba la 37 C timp
de o ora sau la 4 C timp de 12 ore. Etapa de spalare este necesara pentru a elimina din godeu
moleculele de antigen libere. Se titreaza anticorpii conjugati cu enzima diluati ln solutie tampon ce
lmpiedica adsobtia lor la suprafata suportului solid si se incubeaza. Se adauga substratul cromogen și
se lasa un timp predeterminat pentru desfasurarea reactiei catalizate de enzima conjugata cu
anticorpii de recunoastere. Se opreste reactia, iar dupa expirarea timpului se face citirea.
B. ELISA indirect
Presupune metoda indirecta unde se titreaza intai anticorpul de recunoastere si apoi anti-
anticorpul conjugat cu enzima.
Se spala godeurile pentru lndepartarea antigenului liber. Se titreaza anticorpul, se incubeaza si
apoi se spala pentru îndepartarea anticorpilor liberi. Se titreaza anti-anticorpii conjuagati cu
enzima. Anti-anticorpii recunosc regiunea Fc (fragment crystallizable) a anticorpilor primari
de care se leaga. Se incubeaza pentru a permite legarea anti-anticorpilor de anticorpi, se spala
pentru indepartarea moleculelor libere.Se adauga substratul cromofor si se initiaza
reactia. Conversia substratului cu generarea semnalului de schimbare a culorii este catalizata
de enzima conjugata cu anti-anticorpii. Se opreste reactia dupa un timp predefinit si face
citirea semnalului.
C. ELISA sandwich
Se pipetează proba (cu Ag) in godeurile cu Ac1 fixat
Se incubează si rezulta complexe Ag-Ac1
Se spală excesul de Ag (Ag liber)
Se pipetează Ac2 (marcat enzimatic)
Se incubeazăsi rezulta complexe Ac1-Ag-Ac2
Se spală excesul de Ac2 (Ac2 liber)
Se adaugă substratul si se obtine colorarea mediului de reacție ~ cantitatea de Ag din probă
Se citește la spectrofotometru
D. ELISA competitiva
Faza solida este identica; Proba biologică nediluata se adauga concomitent cu conjugatul;
Prezenta anticorpilor in proba blocheaza fixarea conjugatului;
Adaugarea substratului enzimatic si reactia de culoare.
Interpretare: intensitatea culorii este invers proportionala cu cantitatea de anticorpi din proba.

Bibliografie:
https://colegiul-medicilor.ro/elisa

www.studocu.com

https://www.jacksonimmuno.com/technical/products/applications/elisa?utm_term=elisa
%20assay&utm_campaign=Products+%5BSearch,+Europe+-+Incl+UK
%5D&utm_source=adwords&utm_medium=ppc&hsa_acc=9495885278&hsa_cam=1317422
778&hsa_grp=57074230481&hsa_ad=589235151497&hsa_src=g&hsa_tgt=kwd-
14388521&hsa_kw=elisa
%20assay&hsa_mt=b&hsa_net=adwords&hsa_ver=3&gclid=Cj0KCQjwu-
KiBhCsARIsAPztUF3cRgBkXgsZqGXOSoNhQ21EpZwHffRvDuIZGZJNGMIhpV-
8Folp1sIaAgEDEALw_wcB