Padina Maria

Grupa 8, an V

IFN-gamma si tehnica ELISA

1) IFN-gamma
Ce este din punct de vedere structural?
Interferonul gamma este o citokină solubilă dimerizată si este singurul membru al
clasei de interferoni de tip II. La începutul istoriei sale a fost cunoscut sub numele
de interferon imun.
Monomerul IFNγ este alcatuit dintr-un miez de șase elice α și o secvență extinsă
desfășurată în regiunea C-terminală. Elicele α din miezul structurii sunt numerotate
de la 1 la 6.

De catre cine este produs?

IFNγ este produs in principal de catre limfocitele T helper de tip 1 (ca raspuns la
stimularea antigenica si mitogena), de celulele NK (consecutiv actiunii IL-2,
anticorpilor anti-CD16 si in prezenta macrofagelor) si de celulele T citotoxice7.
Receptorii ei specifici:
Receptorul specific pentru IFNγ se afla in special pe suprafata macrofagelor,
celulelor NK (natural killer)10. Din punct de vedere structural, acest receptor
apartine superfamiliei receptorilor citokinici (de tip interferon). Este un
heterodimer compus din 2 subunitati, IFNGR1 si IFNGR2 (sau IFNγRα si
IFNγRβ). Mutatii ale genelor ce codifica subunitatile IFNGR1 si IFNGR2 sunt
responsabile de susceptibilitatea crescuta la infectii cu mycobacterii si Salmonella.

Roluri biologice:
- în apărarea antivirală (efect antiviral)
- blocare multiplicare celulară (apărare antitumorală)
- apărare antiparazitară
- activarea unor componente ale sistemului imun
- implicați și în generarea unor procese patologice
IFNγ mediaza cresterea expresiei moleculelor de histocompatibilitate (MHC) de
clasa I si II. IFNγ stimuleaza in principal prezentarea antigenului si productia de
citokine a monocitelor, precum si celelalte functii efectoare ale acestor celule:
aderenta, fagocitoza, secretia, arderile respiratorii si productia de NO (monoxid de
azot). Astfel, IFNγ favorizeaza acumularea macrofagelor la nivelul situsului
raspunsului imun celular precum si abilitatea acestora de a distruge
microorganismele intracelulare7;9;10. De asemenea IFNγ stimuleaza si capacitatea
altor celule de a distruge microorganisme, precum a celulelor NK si a
neutrofilelor7. Asemanator celorlalti interferoni (in special INFα si IFNβ) inhiba
replicarea virala.
Recomandari pentru determinarea prin metode specifice de laborator:
Nivelele cantitative ale IFNγ determinate in diverse lichide biologice pot fi
utilizate in diagnosticarea unor afectiuni imune si in monitorizarea tratamentelor
doar in corelatie cu date clinice si paraclinice complementare. Deocamdata nu sunt
suficiente informatii de ordin statistic necesare stabilirii indicatiilor specifice ale
determinarilor serice ale IFNγ.

Recoltarea:

Pregatire pacient – à jeun sau postprandial.

Specimen recoltat – sange venos.

Recipient de recoltare – vacutainer fara anticoagulant, cu/fara gel separator.

Cantitate recoltata – minim 0.5 mL ser.

Cauze de respingere a probei – specimen intens hemolizat, icteric, lipemic sau

contaminat bacterian; probe care nu au sosit la laborator congelate.

Prelucrare necesara dupa recoltare – se separa serul prin centrifugare cat mai
repede dupa formarea completa a coagulului, iar proba va fi imediat congelata la
-20°C; probele recoltate in afara punctelor laboratorului vor fi transportate in
recipientul destinat probelor congelate.

Stabilitate proba – serul este stabil 1 luna la -20°C; nu decongelati/recongelati.

Metoda:

Metoda – EIA.

Valori de referinta – < 0.1 UI/mL.

Interpretarea rezultatelor

Niveluri crescute ale marker-ului se intalnesc in:

– artrita idiopatica juvenila; boala celiaca, boala Wilson

– hepatita cronica cu virus hepatic C (VHC), constatandu-se valori mai mari in

cazul asocierii consumului de alcool;

–diabet zaharat de tip I (evolutiv).

2) Tehnica ELISA:

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbet Assay) reprezintă la ora actuală, una din
cele mai des folosite metode, de indentificare şi apreciere cantitativă pentru
anticorpi, antigene, hormoni, citokine şi o paletă largă de alte molecule, inclusiv
peptide sintetice.
Tehnica ELISA a fost inventată de un grup de cercetători de la Universitatea din
Stokholm condus de Peter Perlmann şi Eva Engval, aceştia publicând primul
articol despre ELISA in 1971. Articolul descri aprecierea cantitativă a lgG in serul
de iepure folosind fosfatază alcalină ca enzimă de indentificare Avantaje de
siguranţă crescută şi cele economice, fată de testarea radioimună(RIA) au făcut din
tehnica imunoenzimatica ELISA una indispensabilă pentru domeniul medicinel
clinice, biologiei si al biotehnologiei.

Principiul tehnicii:

Principiul metodei, indiferent de tipul de ELISA ales, este în esentă acelaşi şi se

bazează pe reactia antigen-anticorp. Antigenul sau anticorpul de captură este fixat
pe un suport solid după care este pus in contact cu o imunoglobulină, un antigen
sau respectiv orice molecula pentru care are specificitate. O enzima cuplată fie
direct de imunoglobulina sau de un alt anticorp anti imunoglobulina degradează un
substrat cromogen incolor producând un compus colorat ce poate fi detectat
spectrofotometric la o lungime de undă corespunzatoare
Prepararea conjugatulul
Conjugatul este reprezentat de un antigen sau un anticorp cu specificitate pentru
molecula de determinat, cuplat cu o enzima.
Deși un grup mai mare de enzime au fost utilizate, de-a lungul timpului, fosfatază
alcalină şl
peroxidază din hrean(HRP-horseradish peroxidase) ramân cele mai populare
datorită
randamenulul oferit prin prelucrarea rapidà a substratului si a gamei vaste de
tehnici de
developare existente.
Fixarea antigenului sau anticorpului de captura pe placa
Incubarea antigenului sau anticorpului de determinat în placă
Adaugarea diluției de antigen sau anticorp în placa de reactie reprezintă prima
etapă efectivă a tehnicii ELISA şi nu un pas pregătitor.
În această etapă molecula de determinat se ataşează prin legături de hidrogen,
ionice, interacțiuni hidrofobice și forțe de interacțiune van der Waals, de
anticorpul/antigenul completentar, de captură.
Incubarea se realizează de obicei la temperatura camerei timp de 2 ore.
Indepărtarea reactanţilor liberi din placă (Spălarea)
Un pas foarte important in tehnica ELISA il reprezintă etapele de spălare.
Moleculele nefixate fie in timpul aderării la placă fie în timpul legărilor specifice
cu anticorpii de captură trebuiesc eliminate din godeuri pentru a nu inhiba legarea
reactanţilor ce urmează a fi adăugați ceea ce ar conduce la un rezultat eronat.
Incubarea conjugatului în placă
In funcţie de tipul de ELISA aplicat, adăugarea conjugatului în reacție presupune
legarea acestuia de anticorpul de determinat sau de antigenul specific.
După incubare, placile sunt spălate şi pot fi păstrate la 4°C câteva luni până la
adăugarea substratului cromogen.
Adăugarea substratului cromogen
Adăugarea substratului cromogen reprezintă o etapă critică în tehnica ELISA
deoarece este etapa in care rezultatul pozitiv sau negativ poate fi apreciat. Este de
asemenea prima etapă în care putem semnala dacă vreo etapă în protocol a fost
executată greşit sau unul dintre reactivi nu funcționează.
Interpretarea rezultatelor
Constă în aprecierea culorii probei. Intensitatea culorii se apreciază mai întâi
vizual, pentru determinarea virării de culoare după adăugarea substratului şi
stabilirea timpului de menţinere a lui până la stoparea reacţiei.
Densitatea optică a fiecărei probei se apreciază la stectrofotometru, la o lungime de
undă corespunzatoare.
Aprecierea rezultatelor se face prin două metode :
1. Metoda calitativa de apreciere a pozitivității probelor, prin calcularea valorilor
prag (cut off) faţă de care se raportează absorbanța fiecărei probe.
Probele cu valoarea absorbantei sub limita prag sunt considerate negative lar cele
peste această valoare sunt considerate pozitive.
2. Metoda cantitativa- presupune folosirea unor probe standard, de concentrații
cunoscute, cu ajutorul cărora se trasează o curba standard. Aceasta se realizează
prin introducerea concentraților probelor standard pe axa X a unui grafic, a
valorilor densităților optice respective pe axa Y şi stabilirea punctelor de
intersecţie.

Aplicabilitatea metodei in practica diagnosticului de laborator:

Testul ELISA este realizat in laboratoarele de analize atunci cand medicul

recomanda un examen de sange pentru identificarea anticorpilor unei infectii sau a
proteinelor unui virus. Acest tip de test este de referinta pentru depistarea HIV
(virusul imunodeficientei umane), care determina SIDA (sindromul
imunodeficientei umane dobandite). Dar poate fi utilizat si pentru alte boli
infectioase si nu numai. Se aplica uneori pentru confirmarea sarcinii, iar alteori in
diagnosticul unor alergii. Iata care sunt indicatiile testului ELISA.

Testul ELISA si HIV

Acesta este principalul test de depistare a bolii HIV/SIDA. Se bazeaza pe

detectarea anticorpilor anti-HIV in sangele pacientului si a antigenului P24,
specific virusului imunodeficientei umane. Testul permite identificarea urmelor
infectiei in aproximativ 6 saptamani de la contaminare. Prin acest test,
specialistii pun in evidenta prezenta virusului prin complementaritatea antigen-
anticorp. Asadar, se cauta anticorpii specifici produsi de organism si indreptati
catre HIV-1 sau HIV-2. Detectarea acestora semnaleaza seroconversia. Tehnica
ELISA nu identifica virusul propriu-zis, ci reactia imunitara pe care acesta o
induce.

Testul ELISA si Covid-19

In contextul pandemiei Covid-19, tehnica ELISA este utilizata pentru depistarea

anticorpilor dezvoltati de pacient fata de virusul SARS-CoV-2. Daca anticorpii
sunt prezenti, este foarte probabil ca persoana sa fi avut boala. Insa testul ELISA
nu este validat de autoritati ca metoda de diagnostic a infectiei cu coronavirus.
Principala tehnica de testare Covid-19, care confirma coronavirusul, ramane testul
PCR – un test molecular de reactie in lant a polimerazei. Testarea PCR este folosita
doar pentru cazurile active de Covid-19, nu arata daca o persoana a avut infectia.
Acest lucru se poate afla printr-un test serologic de detectare a anticorpilor din
sange: IgM si IgG. Anticorpii IgM apar in 7 zile de la infectare si dispar dupa 3-4
saptamani. Anticorpii IgG apar in 14 zile de la infectare si se mentin in timp.

Testul ELISA si boala Lyme

Boala Lyme (cauzata de muscatura de capusa) poate fi detectata prin testul ELISA,
dar nu este suficient in protocolul de diagnostic al bolii. Procedeul ELISA trebuie
completat prin testul Western-Blot. Acesta din urma este recunoscut la ora actuala
ca test standard in diagnosticul bolii Lyme. In acest scop, sensibilitatea sa este de
100%, specificitatea de 92,5% si fiabilitatea de 99,5%, potrivit profesorului Ulrich
de la Universitatea din Munchen, intr-un raport al Asociatiei Lyme fara Frontiere.

Testul ELISA si febra dengue

In detectarea febrei dengue se izoleaza antigenul NS1 (proteina virusului dengue)

in sangele pacientilor suspecti. Se utilizeaza testul Elisa direct, in faza precoce a
maladiei.

Testul ELISA si sarcina

In cazul sarcinii, metoda ELISA detecteaza prezenta: gonadotropinei corionica

umana (HCG) in sarcina. Acest hormon este secretat doar de embrion si placenta,
fiind detectabil atat in urina (printr-un test rapid de sarcina), cat si in sange.

Testul ELISA si alergiile

Alergiile pot face obiectul testelor ELISA. Sunt detectati anticorpi contra unui
alergen, cum ar fi glutenul, acarienii sau polenul.

Avantaje si dezavantaje:

Avantaje:

Sensibila
Reproductibila
Necesita cantitati mici de reactivi
Determina si Ag, si Ac
Automata (rapida)
Noniradianta
Dezavantaje:

Masrarea activitatii enzimatice poate fi mai complexa decat masurarea unor tipuri
de radioizotopi
Activitatea enzimatica poate fi influentata de constituentii plasmei
Trusele sunt disponibile comercial, dar nu sunt ieftine
Foarte specifica unui anumit tip de antigen, nu va recunoaste alt tip de antigen
Unele probe pot contine inhibitori naturali

Bibliografie:

Material din cursul 4

http://www.scumc.ro/interferon-gamma/

http://may2017.archive.ensembl.org/Homo_sapiens/Gene/Summary?
db=core;g=ENSG00000111537;r=12:68154768-68159747;t=ENST00000229135

https://www.jbc.org/article/S0021-9258(18)38292-9/fulltext

Cacagli P., Verderio A., Experimental layout, data analysis, and thresholds in
ELISA testing of maize for aphid-borne viruses, Journal of Virological Methods.
Volume 110

Clarck M. F., Lister R.M., Bar-Joseph M.., ELISA Techniques, Methods in

enzymology, vol 118, 1986

Eva Engvai, Enzyme immunoassay ELISA and EMIT, Methods in enzymology,

1980
https://www.youtube.com/watch?v=Y9OdiogwYOM
https://sfaturimedicale.ro/testul-elisa/#2