Diagnostic HIV 2.

10 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
Diagnosticul infec iei HIV se bazeaz pe metode serologice. Tehnicile se mpart n investiga ii de triaj (imuno-enzimatice ELISA), de confirmare (imunoamprente, radioimunoprecipitare i imunofluorescen ), de diferen iere (HIV 1 / 2) i tehnici rapide de diagnostic.

2.10.1 Testul ELISA

Testul ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) este testul cel mai accesibil i mai frecvent folosit. Tehnica folose te antigene ale nveli ului i miezului HIV 1 i HIV 2. Rezultatul se exprim n pozitiv sau negativ. Acest test folose te antigene HIV produse prin culturi celulare sau prin metode moleculare recombinante. Antigenele solubile sunt introduse n godeuri. Anticorpii pacientului se leag cu ele specific i sunt detectate printr-un conjugat format din anticorpi antiumani de animal, marca i enzimatic. Prin ad ugarea substratului enzimatic specific mpreun cu o substan cromogen , reac ia poate fi vizualizat prin dezvoltarea unei culori m surabile spectrofotometric. Intensitatea culorii este propor ional cu cantitatea de anticorpi din e antionul testat (figura ). Rezultatele pot fi interpretate ca pozitive, negative sau la limit (cutoff). Testul poate da pn la 5% rezultate false, prin erori tehnice. De aceea serologia ELISA pozitiv trebuie confirmat prin folosirea altor teste ELISA bazate pe alte principii, (reactivitate repetat ), urmate fiind de un test de confirmare tip Western Blot (WB). Testele fals pozitive apar la indivizi cu boli de colagen, hepatite cronice, malarie i la persoane cu anumite fenotipuri HLA.

Fig.2.6 Interpretarea testului Elisa la 3 pacien i

Testul ELISA este un test de triaj, care are foarte pu ine rezultate fals negative. Este primul test care se efectueaz pentru depistarea unei infec ii HIV. Rezultatul poate fi pozitiv (caz n care se face confirmarea repetnd testul tot prin tehnica ELISA cu alt trus , folosind alte principii, din alt prob de snge, iar apoi Western Blot), negativ (f r infec ie HIV) i la limit (caz n care se repet ELISA cu alt trus , folosind alte principii, din alt prob de snge). Testul WB este un test de confirmare, cu foarte pu ine rezultate fals pozitive. Nu se folose te niciodat naintea testului ELISA. Rezultatul poate fi pozitiv (caz de infec ie HIV), negativ (f r infec ie HIV) i nedeterminat (caz n care se repet WB la 3 luni). Testele rapide au o simplitate ce le fac u or de folosit, chiar de c tre orice categorie de personal i n lipsa unor laboratoare scump echipate.

2.10.2 Testul Western Blot (WB)

Testul Western Blot (WB) permite identificarea individual a anticorpilor anti-HIV specifici antigenelor virale. Antigenele sunt separate prin electroforez i transferate pe membrane de nitroceluloz care se incubeaz cu serul pacientului. Anticorpii din ser leag specific proteinele virale i sunt identifica i prin comparare cu controale standard. n general, o prob este pozitiv dac prezint benzi pozitive pentru cel pu in dou din cele trei antigene majore gag, pol, env. Criteriile CDC recomand cel pu in 2 din urm toarele benzi: p24, gp41 sau gp160/120 pentru un test pozitiv sau nici una pentru un test negativ i prezen a oric rei alteia pentru un rezultat indeterminat (figura ).

Fig.2.7 Interpretarea testului Western Blot la 3 pacien i 2.10.3 Testele rapide

Testele rapide con in suspensii microscopice de particule (latex, gelatin , hematii tanate) cuplate cu antigen viral. Anticorpii din serul testat aglutineaz aceste particule care formeaz un depozit care poate fi citit cu ochiul liber sau la microscop dup numai 5 minute. Aceste teste sunt utile n zone endemice, dac este necesar rapiditatea n orientarea diagnosticului serologic (nu necesit echipamente speciale), mai ales dac sunt efectuate de persoane cu experien .

2.10.4 Teste directe (virusologice)

Replicarea viral poate fi demonstrat prin: eviden ierea i dozarea antigenului p24, detectarea unor secven e genomice prin amplificare genic i prin izolarea virusului. Aceste tehnici evidentiaz infec ia n timpul ferestrei imunologice (seroconversiei).

2.10.5 Determinarea antigenului p24

Aceast metod determin i/sau m soar cantitatea de antigen p24 liber din plasm sau supernatantul din culturi celulare. Antigenemia p24 are valori mai mari ini ial i apoi mai mici, tardiv n timpul infec iei cu HIV. Este folosit o tehnic ELISA de tip sandwich, n care anticorpii anti-p24 se g sesc n godeuri i se incubeaz cu serul sau plasma pacientului. Antigenul liber se leag specific i este m surat intensitatea culorii. O caracteristic a infec iei cu HIV este coexisten a antigenului p24 cu anticorpii anti-p24 pe tot parcursul bolii, n concentra ii diferite. Cre terea antigenului p24 la valori detectabile n faza de seroconversie sau n faze terminale limiteaz utilizarea acestui test numai n aceste perioade. Determinarea antigenului p24 se efectueaz prin metode de tip ELISA - deci este o metod ieftin i nu necesit echipament sau laborator special. Permite diagnosticul precoce al infec iei HIV, n special n supravegherea transmiterii verticale a HIV. Este un factor de prognostic nefavorabil ce reflect replicarea viral intens .

2.10.6 Reac ia de polimerizare n lan (PCR)

Reac ia de polimerizare n lan (PCR) este deosebit de util n diagnosticul multor infec ii, inclusiv HIV. Tehnica const n amplificarea ADN existent n cantit i foarte mici printr-o serie de cicluri replicative. Reac ia PCR se bazeaz pe dou propriet i fundamentale ale ADN: denaturarea/refacerea ADN dublu catenar prin cre terea/sc derea temperaturii i complementaritatea bazelor purinice i pirimidinice ce alc tuiesc catenele ADN, permi nd astfel refacerea prin complementaritate cu orice alt caten ADN de aceea i lungime sau mai scurt . Oligonucleotidele introduse n reac ie (primeri de replicare) sunt atent selectate, astfel nct s fie complementare cu secven e bine determinate din ADN int . Tehnica PCR se poate aplica i pentru ARN. Acesta este reverstranscris n ADN, care se amplific ulterior. Pentru HIV se folosesc ADN viral, ARN genomic i ARNm. Cre terea ADN i ARNm viral reprezint un marker important de progresie a bolii. Problema PCR este contaminarea ADN-ului int care poate duce la rezultate fals-pozitive chiar i n laboratoarele cele mai bune, deoarece procesul de amplificare este exponen ial. Metoda este folosit i pentru diagnosticul precoce al infec iei cu HIV. Determinarea ARN-ului sau ADN-ului viral plasmatic ofer informa ii despre nc rc tura viral . Cuantificarea acesteia este util n: - diagnosticul infec iei, ndeosebi la nou-n scu ii din mame seropozitive;

- urm rirea evolu iei bolii; -evaluarea eficacit ii diverselor tratamente antiretrovirale

2.10.7 Monitorizarea imunologic

Num rul CD4 este unul dintre markerii stadiului de infec ie. CD4 i CD8 se determin cu ajutorul anticorpilor monoclonali specifici marca i fluorescent sau cu alte metode. Folosirea flow-cytometriei (figura 16) permite calcularea procentului de celule care exprim markeri CD4 sau CD8. Num rul absolut de CD4 poate fi determinat din formula:

CD4 absolut = num r total leucocite x procent limfocite x procent CD4

Num rul de CD4 se folose te n stadializare, de i procentul de CD4 este mai pu in supus fluctua iilor. Valorile normale pentru procentul de CD4 sunt de 40% pn la 70%, iar valoarea absolut variaz ntre 500 i 1600/mm3 la adult. Variabilitatea CD4 n timp poate reprezenta o problem . Varia ia diurn prezint diferen e de chiar 150 300/mm3 de diminea a pn seara la persoane s n toase. Timpul lung de la recoltare pn la m surare sau congelarea probei ridic artificial valoarea CD4. Alt metod de urm rire a pacien ilor este raportul CD4/CD8. La persoane neinfectate acest raport are valori ntre 1 i 2.

Fig.2.8 Exemplu de rezultat prin tehnica flowcitometric

2.10.8 Interpretarea testelor

Singurul marker biologic, care are valoare n supravegherea imunologic a pacien ilor seropozitivi, este subpopula ia limfocitar CD4, ce se poate determina cantitativ i procentual. Istoria natural a infec iei cu HIV are semnifica ie deosebit n interpretarea testelor. Timpul mediu de la momentul infectant la seroconversie este de 2,1 luni, 95% din pacien i avnd anticorpi la 6 luni de la infectare. n infec ia acut se produce o replicare viral accentuat , eviden iat prin nivele mari de ARN viral plasmatic sau de antigen p24. Dup infec ia acut , anticorpii devin detectabili i titrul lor cre te rapid. Odat r spunsul imun instalat, el r mne de obicei detectabil toat via a. Cre terea anticorpilor se asociaz cu o sc dere a nivelului de antigen p24 i a viremiei plasmatice. Acestea din urm vor cre te din nou n fazele tardive ale bolii. Totu i nc rc tura viral m surat prin PCR cantitativ poate fi urm rit pe tot parcursul bolii. Replicarea viral are loc n toate stadiile infec iei cu HIV. Num rul de CD4 scade n timpul infec iei acute i seroconversiei (ca n toate infec iile virale),dar revine apoi la normal. n c iva ani acest num r scade. Orice discu ie despre testele folosite trebuie s in cont de sensibilitate, specificitate, valoare predictiv pozitiv i negativ . Sensibilitatea se refer la capacitatea de a depista o modificare particular printre persoanele care au cu adev rat acea modificare. n contrast, specificitatea este capacitatea de a depista persoanele care nu au acea modificare n popula ia neafectat . Ace ti parametri depind de testul folosit, nu de popula ia pe care au fost folosite testele. Valorile predictive pozitive sau negative se refer la puterea testului de a prezice corect cine are sau nu acea modificare i sunt legate de prevalen a modific rii n popula ia testat . Rezultatele fals negative pot apare n perioada de fereastr imunologic pn la seroconversie. Din fericire aceast perioad este scurt . Alte cauze de reac ii fals negative includ transplant de m duv osoas sau truse de anticorpi numai anti-p24. Rezultate fals-pozitive pot apare prin reac ii ncruci ate cu al i anticorpi, cum ar fi cei contra antigenelor leucocitare de clasa II. Ace ti anticorpi se g sesc mai ales la femei multipare sau la cei care au primit transfuzii multiple. Exist i al i autoanticorpi care pot da rezultate falspozitive. Rezultatele fals-pozitive ale testelor ELISA pot fi corectate prin Western Blot. Exist i teste Western Blot fals-pozitive, dar frecven a acestora este mult mai mic . Anticorpii anti antigen HLA clasa I pot da benzi false gp41, iar cei clasa II pot da benzi false p31.

O alt situa ie dificil este interpretarea unui profil Western Blot indeterminat. Dac datele clinice i epidemiologice contrazic rezultatul, se recomand retestarea n alt laborator. n situa ia aceluia i rezultat, persoana va fi retestat la 3 i 6 luni pentru a se stabili dac nu se afla n perioada de seroconversie n timpul test rii. Genomconversia precede seroconversia i evit falsele negativit i nregistrate timpuriu, n cursul ferestrei imunologice. nainte i dup seroconversie, individul este infectant. Un rezultat pozitiv nu se comunic dect dup confirmarea prin metoda Western Blot. Testul ELISA (numai pentru confirmare i WB) este singurul test care poate fi recomandat i de al i speciali ti dect infec ioni ti.

2.10.9 Diagnosticul infec iei HIV

Cazul raportat ca infec ie HIV trebuie s ntruneasc oricare din urm toarele criterii: de laborator sau clinic. Criterii de laborator:
 dou test ri pozitive efectuate cu truse de tip ELISA, la dou probe de snge prelevate

separat, urmate de confirmare cu Western Blot, sau

 rezultat pozitiv la oricare din urm toarele teste virologice pentru HIV: detectarea acidului

nucleic prin PCR (ADN sau ARN), antigen p24, izolarea HIV (cultur viral ). Criterii clinice (dac nu sunt ntrunite criteriile de mai sus): boli definitorii SIDA la care diagnosticul a fost stabilit prin criterii de certitudine. Pentru copiii cu vrsta mai mic de 18 luni, n scu i din mame HIV pozitive, diagnosticul este mai complex i nu ntotdeauna definitiv:


diagnostic definitiv de infec ie HIV dac

copilul are un rezultat pozitiv, din alt snge dect cel din cordonul ombilical, la oricare din urm toarele teste virologice pentru HIV: detectarea acidului nucleic prin PCR (ADN sau ARN), antigen p24, izolarea HIV (cultur viral ) sau are o boal definitorie SIDA.

diagnostic prezumptiv de infec ie HIV dac

copilul nu ntrune te criteriile definitive pentru infec ia HIV, dar are rezultate pozitive la un singur test virusologic pentru HIV (din cele enumerate mai sus) cu excep ia sngelui din cordonul ombilical i nu are ulterior teste negative virologice pentru HIV sau de detectare a anticorpilor anti-HIV.

copilul nu ntrune te criteriile pentru infec ia HIV, dar are cel pu in 2 teste negative pentru anticorpi antiHIV din probe separate sau ob inute la vrst > 6 luni, sau cel pu in 2 teste virusologice negative din probe separate, amndou fiind ob inute la o vrst > 1 lun , iar cel pu in una dintre ele la vrsta de > 4 luni i nici un alt semn de infec ie HIV, clinic sau de laborator (adic nu a avut nici un test virusologic pozitiv, dac a fost efectuat, i nu a avut o boal definitorie SIDA). copilul nu ntrune te criteriile pentru status-ul definitiv de neinfectat, dar care are un test ELISA negativ ob inut la vrsta > 6 luni i nici un test virologic pozitiv (dac a fost efectuat), SAU un test virusologic negativ efectuat la vrsta > 4 luni i nici un test virusologic HIV pozitiv (dac a fost efectuat), sau un test virusologic pozitiv cu cel pu in 2 teste virusologice ulterioare negative, din care cel pu in unul este efectuat la vrsta de > 4 luni; sau rezultate negative la testul anticorpi antiHIV, din care cel pu in unul este efectuat la vrsta de > 6 luni.

diagnostic definitiv de neinfectat HIV dac

diagnostic prezumptiv de neinfectat HIV dac

diagnostic de infec ie HIV indeterminat

dac nu ntrune te criteriile pentru infec ie HIV sau criteriile pentru neinfectat HIV (se aplic i copiilor cu un test de anticorpi anti-HIV pozitiv i f r manifest ri de boal definitorie SIDA sau cu mame netestate).

Problem : "Fereastra de diagnostic"

Dup ce infec ia cu HIV a avut loc, este nevoie de cteva s pt mni nainte ca anticorpi sa devina detectabili. Acest fenomen se nume te "fereastra de diagnostic" i este determinta de perioada de timp in care organismul necesit pentru a produce niveluri detectabile de anticorpi. (Busch 1997). Trecerea de la anticorpi-negativ la anticorpi pozitivi-se nume te "seroconversie". Testele de screening utilizate n prezent sunt n m sur s recunosca o infectie HIV la ase s pt mni dup infec ie primar n proportie de80% i dup s pt mna 12 n proportie de 100% din cazuri, numai n cazuri foarte rare se ajunge si pana la 6 luni pentru recunoastrea unei infectii.. Testele de screening de a patra genera ie ncearc s scurteze durata de , prin detectarea anticorpilor HIV i a antigenului p24HIV simultan (Grtler 1998, Ly 2001).

Christian Hoffmann, Jrgen K. Rockstroh, Bernd Sebastian Kamps, HIV Medicine 2007 15 edition capitolul 3 paginile 49-50

Diagnosticul coinfecti HIV/VHB