Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

IDENTIFICARE VIRALA

REACTIA DE SERONEUTRALIZARE (RSN)

Capacitatea anticorpilor de a neutraliza infectivitatea virusurilor este metoda

cea mai recomandata atat in identificarea virusurilor (reactia de virusneutralizare),
cat si in titrarea anticorpilor (reactia de seroneutralizare).

In reactia de virusneutralizare se folosesc dilutii de virus si se mentine

serul constant (se identifica virusul necunoscut), in timp ce in reactaia de
seroneutralizare se foloseste serul in dilutii, in timp ce virusul ramane constant (se
identifica prezenta anticorpilor protectori).

Modalitatile de recunoastere a efectului neutralizant asupra unor virusuri

depind de substratul folosit. Pe culturile de celule se constata neutralizarea
efectului citopatic.

Etapele RSN sunt:

1. TITRAREA INFECTIVITATII VIRALE

2. BLOCAREA INFECTIVITATII VIRALE

3. DEMONSTRAREA NEUTRALIZARII INFECTIVITATII VIRALE

1. TITRAREA INFECTIVITATII VIRALE

Metoda plajelor:

Aceasta metoda necesita manopere sterile si are urmatoarele etape:

Ø Inoculare dilutii zecimale suspensie virala, succesive pe placi CC

Ø Adsorbtie 30-60 min. 37 grade Celsius

Ø Indepartare inocul

Ø Adaugare mediu semisolid incolor (agar)

Ø Incubare culturi 3-5 zile

Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Ø Colorare plaje cu rosu neutru si numararea lor.

Liza celulara produsa ca ECP de unele virusuri (enterovirusuri) poate fi

focalizata daca se acopera culturile infectate cu un mediu semisolid (agar). In
monostratul celular apar zone punctiforme sau circulare de liza numite plaje.
Numararea plajelor e cea mai precisa metoda de evaluare a infectivitatii virale.
Numarul de plaje produs pe un monostrat de celule, prin inocularea unui volum
dintr-o dilutie de virus, da titrul conform ecuatiei:

Titrul = nr plaje / Vol x dil [PFU]

Titrul se exprima in unitati formatoare de plaje (plaques forming units-PFU).

Numarul de plaje obtinut pe flacoane, inoculate cu dilutii diferite, e invers

proportional cu dilutia. Relatia e corecta daca nu apar plaje confluente. Toate
flacoanele care dau plaje confluente se elimina din calcul.

2. BLOCAREA INFECTIVITATII VIRALE : consta in adaugrea la suspensia

virala de anticorpi antivirali specifici.

3. DEMONSTRAREA NEUTRALIZARII INFECTIVITATII VIRALE consta

in repetarea etapei 1 folosind dilutii zecimale ale amestecurilor antigen-anticorp.
Daca s-a folosit anticorpul antiviral specific nu va mai parea un ECP, ca urmare a
blocarii infectivitatii virale si astfel va fi identificat si virusul corespunzator
anticorpilor antivirali specifici.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Diagnostic in viroze eruptive

Virozele eruptive care vor fi studiate sunt: rujeola, rubeola si varicela (dg.
infectiei cu virusul varicelo-zoosterian va fi studiat la dg. infectiei cu
herpesvirusuri, familia din care face parte).

1. Diagnosticul infectiei cu virusul rujeolos

Suspiciunea de infectie cu v. rujeolos este data de manifestarile clinice

caracteristice (eruptie maculo-papulara cu tendinta la confluare, triplu catar :
conjunctivita, rinoree, diaree, semnul Koplik, febra), de contextual epidemiologic
(epidemie de rujeola, persoana nevaccinata).

Produsele patologice care pot fi recoltate in vederea diagnosticului de

laborator sunt : secretii nazo-faringiene ,sange ,urina,LCR.

De prima intentie si cel mai usor de realizat este diagnosticul serologic, care
poate fi realizat pe proba unica (detectie de anticorpi anti v. rujeolos IgM, prin
ELISA de captura) sau pe proba pereche (seroconversia, respectiv cresterea
semnificatica a titrului de anticorpi de peste 4 ori titrul initial, sustin diagnosticul
de rujeola).
Detectie de anticorpi se poate face si in LCR pentru diagnosticul PESS, alaturi de
alte metode de diagnostic). Daca ac anti v. rujeolos IgM sunt prezenti in LCR si
absenti in sange, sugereaza o sinteza locala si sprijina dg. de PESS.

Izolarea virala pe culturi de celule se face in anumite contexte

epidemiologice (epidemii) sau in scop de cercetare. ECP este de tip sincitial si
incluzionar mixt.

Detectie directa consta in detectia:

ü ARN viral : RT-PCR (secventiere nucleotidica - genotipare);

ü Antigene virale in SNF (IF)- rar utilizat

2. Diagnosticul infectiei cu virusul rubeolos

Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Suspiciunea de infectie cu v. rubeolos este data de manifestarile clinice

caracteristice (eruptie maculo-papulara fara tendinta la confluare, mai pala decat
cea din rujeola, febra, adenopatie occipitala, retroauriculara, latero-cervicala), de
contextual epidemiologic (epidemie de rubeola, persoana nevaccinata, femeie
gravida – v. rubeolos este teratogen, TORCH). Exista multe forme asimptomatice
de rubeola sau cu simptomatologie frusta.

Produsele patologice care pot fi recoltate in vederea diagnosticului de laborator

sunt : SNF, sange, urina.

3. Diagnostic serologic (ser, LCR)

De prima intentie si cel mai usor de realizat este diagnosticul serologic, care poate
fi realizat pe proba unica (detectie de anticorpi anti v. rubeolos IgM, prin ELISA
de captura) sau pe proba pereche (seroconversia, respectiv cresterea semnificativa
a titrului de anticorpi de peste 4 ori titrul initial, sustin diagnosticul de rubeola).
Prezenta ac antiRubella IgM la nou-nascut sugereaza infectie congenitala.

Izolarea virala pe culturi de celule se face rar, pentru a confirma infectia in timpul
sarcinii .

Detectie directa a ARN-lui viral se face prin teste molecularea RT-PCR , de obicei
pentru dg. infectiei congenitale. In acest caz se pot folosi pentru diagnostic si alte
produse patologice: lichid amniotic, biopsie de cordon ombilical, biopsie de
placenta.

3. Diagnosticul infectiei cu virusul urlian

Oreionul (parotidita epidemica) produs de catre virusul urlian NU este o

viroza eruptiva. Se studiaza alaturi de rujeola si rubeola, avand in vedere ca aceste
viroze pot fi prevenite printr-un vaccin comun : ROR/MMR.

Infectia cu virusul urlian intereseaza in afara glandelor salivare si alte organe

: pancreas, SNC, testicule, ovare.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Suspiciunea de infectie cu v. urlian este data de manifestarile clinice

caracteristice (parotidita uni sau bilateral, febra, faringita, orhita, meningita,
pancreatita), de contextul epidemiologic (epidemie de oreion, persoana
nevaccinata).

Produsele patologice care pot fi recoltate in vederea diagnosticului de

laborator sunt : saliva, SNF, sange, LCR, urina.

De prima intentie si cel mai usor de realizat este diagnosticul serologic, care
poate fi realizat pe proba unica (detectie de anticorpi anti v. urlian IgM, prin
ELISA de captura) sau pe proba pereche (seroconversia, respectiv cresterea
semnificativa a titrului de anticorpi de peste 4 ori titrul initial, sustin diagnosticul
de oreion).
Izolarea virala pe culturi de celule (Vero) se realizeaza rar, de obicei in scop
de cercetare.
Detectie directa a ARN-lui viral se face prin teste molecularea RT-PCR.