Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

ALGORITM DE DIAGNOSTIC VIRUSOLOGIC

1. Suspiciune viroză - date clinice / paraclinice / epidemiologice

2. Recoltarea probelor - locul şi timpul potrivit
3. Transport probe - rapid, la rece, în siguranţă
4. Directiile diagnosticului virusologic

1. SUSPICIUNEA DE VIROZĂ
Pentru o buna orientare a diagnosticului se apeleaza la trei categorii de
informatii despre pacient:
1. Date clinice
2. Date paraclinice
3. Date epidemiologice

Pentru a sumariza aceste date se pot introduce intr-un formular – tabel 1.1

Tabel 1.1. Formular de trimitere pentru diagnostic virusologic.

Adresa spitalului/policlinicii/ cabinetului Medicul caruia i se va comunica rezultatul (tel,
ce trimite produsul patologic fax, e-mail)

Nume, prenume pacient Sex, Varsta

Date clinice, suspiciune diagnostic Data debutului simptomatolgiei

Tipul produsului patologic Data, ora recoltarii

Tipul tratamentului administrat in Date epidemiologice (contact cu boli infectioase
prealabil transmisibile, vectori, calatorii in zone endemice
pt o anumita boala, vaccinari)
Analiza solicitata
Semnatura, parafa medicului
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

2. RECOLTAREA PRODUSULUI PATOLOGIC

Reguli de aur al recoltarii. Există trei condiţii importante în recoltarea produselor

patologice:
1. recoltarea din locul şi la timpul potrivit
2. recoltarea steril pentru pacient, pentru proba si pentru personalul medical
3. etichetare corecta a recipientelor utilizate

1. Recoltarea din locul şi la timpul potrivit.

Produsele patologice recoltate variază în funcţie de perioada de evoluţie:
- incubaţie + faza prodromală - izolarea virusului de la poarta de intrare
- prodromală + stare - izolarea virusului din organul-ţinta şi diagnosticul
serologic - răspunsului imun de fază acută (Ig M)
- de la jumătatea fazei de stare - diagnostic serologic (IgG)

ATENŢIE:

→ organul implicat clinic nu este totdeauna locul multiplicării maxime a

virusului (de ex.: meningitele acute virale sunt determinate cel mai frecvent de
enterovirusuri, produsul patologic de elecţie sunt materiile fecale, aceste virusuri având poartă
de intrare digestiva şi eliminându-se prin exfolierea celulelor epiteliului intestinal, si nu
lichidul cefalo-rahidian, mai greu de recoltat şi în care s-a demonstrat prezenţa de anticorpi
antivirali secretaţi intratecal care pot impiedica diagnosticul).
→ gravitatea bolii nu este întotdeauna proporţională cu şansele de izolare, există
viroze cu simptomatologie “zgomotoasă” la care nu se poate izola agentul etiologic.

2. Cum recoltam/alegem produsul patologic?

SÂNGE
• se recoltează 3-5 ml prin puncţie venoasă aseptică (excepţii, la copii prin punctie
digitală, la nou-nascut – puncţie in călcâi, cordon ombilical)
• se recolteaza pe anticoagulant (EDTA, heparina, citrat-dextroza A) sau simplu (pentru
diagnosticul serologic)
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

• risc de contaminare crescut (măsuri de protecţie: manusile trebuie purtate pentru toate
procedurile; nu se folosesc decat seringi de unica utilizare; acele nu trebuie
reacoperite, rupte, indoite sau indepartate din seringile de unica folosinta
• colectat în - tuburi etanşe;
- microcapilare ;
- rondele de hârtie uscată ;
Virusuri frecvent izolate: virusuri care disemineaza viremic si agentii etiologici ai febrelor
hemoragice

LICHID CEFALORAHIDIAN (LCR)

• Se recoltează 2-3 ml prin puncţie rahidiană la nivelul L4-L5, inainte de inceperea
tratamentului antibiotic; se prelucrează cât mai rapid.
• Se pastreaza la 2-8 C, fara adaos de mediu de transport viral (MTV); transport cat mai
rapid posibil, pe gheata sau la -70 C.
• Pleiocitoza (numărul crescut de celule limfomonocitare din LCR) poate apărea
macroscopic ca turbiditate (lichid opalescent sau chiar cu aspect cremos), de obicei in
meningitele bacteriene.
• In meningitele virale LCR este clar, are celularitate scazută
Virusuri frecvent izolate: virusul rabic, unele arbovirusuri, enterovirusuri; se mai utilizeaza
pentru aprecierea permeabilitatii barierei hematoencefalice si a sintezei intratecale de
anticorpi.

SECRETII NAZO - FARINGIENE

a) spalatura nazo faringiana (Exsudat naso-faringian) se obtine cu ajutorul unor tampoane
sterile cu coada introduse in cornetul nazal inferior - mişcări rotative, se introduce tamponul
în mediu transport viral (soluţie salină tamponată Hanks sau Earle), se lasa o ora pentru eluţia
virusului şi apoi centrifugare 1200 rpm. / 10 minute, se foloseşte sedimentul.
b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml
ser fiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub de plastic.
• Atenţie la evitarea administrarii antisepticelor/antibioticelor anterior recoltarii şi la
toaleta cavităţii bucale.
• Se evita atingerea tamponului de limba, obraji sau buze pentru evitarea cotaminarii.
• Sputa recoltata in urma tusei si lichidul veziculelor din mucoasa bucala nu sunt utile
pentru diagnosticul virusologic.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Virusuri frecvent izolate: virusurile gripale, virusurile paragripale, adenovirusuri,

rhinovirusuri, coronavirusuri, virusul respirator sinciţial, v.rujeolos, v. rubeolos, v. urlian; mai
rar: herpes simplex I, varicelozosterian, citomegalic

MATERII FECALE (MF)

• Se recoltează 4-8 grame MF în soluţie MgSO4 1M în suspensie 20% (MgSO4
stabilizeaza infectivitatea enterovirusurilor - agentii meningitelor virale
• Unele virusuri se elimină săptămâni la rând (enterovirusurile), altele doar la
debutul bolii: 2-4 zile (rotavirusuri)
• Se face o suspensie 1 - 2 g materii fecale + 15 ml soluţie Hanks
• Centrifugare în tub de centrifugă pe bile de sticlă sterile, pentru izolarea virală
se foloseşte supernatantul clarificat.
• Se recomanda recoltarea a 2 probe de la pacient la interval de 24-48 ore pentru
izolarea enterovirusurilor
Virusuri frecvent izolate: enterovirusuri, rotavirusuri, calicivirusuri, mai rar adenovirusuri
enterice; pentru diagnosticul etiologic in epidemii de boli diareice acute la copii si
enterovirusuri mai ales in epidemii de meningita aseptica sau pentru supraveghere infectiilor
cu virusuri poliomielitice si alte enterovirusuri.

URINA
• Se recoltează steril 100 ml, preferabil urina de dimineata, dar orice specimen
urinar obtinut prin abstinenta de la mictiune timp de 2 ore este adecvat pentru
diagnosticul virusologic.
• Cel mai frecvent se utilizează în diagnosticul v. citomegalic (CMV )
• Centrifugare 20 min la 2000 rot./min. se foloseşte sediment, reluat l/10 în
mediu de cultură
• şansele de izolare sunt reduse, fiind necesare de obicei 2 - 3 probe.
• Există, de asemenea, posibilitatea recoltării cu tampoane sterile din uretră
Virusuri frecvent izolate: V. citomegalic, v. rujeolos.

LICHID DIN VEZICULE

• Colectarea lichidelor din vezicule, bule, pustule se face după dezinfectarea
tegumentului, se aspiră lichidul si se recoltează material raclat de la baza leziunii cu
un ac ataşat la seringa de tuberculină sau cu pipeta Pasteur.
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

• Lichidul vezicular contine titruri inalte de virus in cazul leziunilor recente (1-2 zile)
• Se inoculeaza ca atare pe culturi de celule pentru izolare sau daca se urmareste
evidentierea antigenelor virale se fixeaza cu acetona pe lame de sticla si se identifica
cu anticorpi specifici marcati cu fluorocromi.
Virusuri frecvent izolate: HSV I, HSV II şi VZV.

SALIVA.
• Se recolteaza saliva de lângă ductul Stenon cu tampon steril.
• Practic, utilizarea salivei este limitata la diagnosticul infectiei rabice - numai in
laboratoarele specializate cu nivel de biosecuritate ridicat.
• Exista si tehnici imunoenzimatice pentru detectia anticorpilor anti-HIV, anti-VHC din
saliva (diagnostic rapid)

TAMPOANE VAGINALE, LAVAJ CERVICO-VAGINAL, TAMPON URETRAL

• Recolatarea de la nivelul colului uterin si uretrei - cu tampoane sterile, fără toaleta
prealabilă a regiunii/ la nivelul colului uterin se poate folosi si periuta de recoltare
endocervicala (utilizata pentru testul Babes-Papanicolau)
• Lavajul cervico-vaginal se obtine cu ajutorul unei seringi la care este atasata o pipeta
de plastic; 10 ml de TFS sau ser fiziologic se introduc in vagin la nivelul fornixului
posterior; se aspira repetat de 2-3 ori; produsul patologic astfel obtinut se stocheata la -
700C.
Virusuri frecvent izolate: virusuri herpetice

TAMPON CONJUNCTIVAL

• Se recolteaza cu tampon steril de la nivelul sacului conjunctival al pleoapei inferioare

in mediu de transport viral sau intr-un tub steril cu 0,5 ml TFS (daca se foloseste
imediat)
Virusuri frecvent izolate: herpesviridae, paramixoviridae, adenovirusuri si enterovirusuri
(Coxsackie A24, enterovirus 70). Este utilizat pentru diagnosticul etiologic in conjunctivite si
keratoconjunctivite .

BIOPSIA DE ORGAN
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

• fragmentul de organ se introduce în câţiva mililitri soluţie salină + ser fetal de

viţel 10 % + antibiotice în concentratiile folosite în culturile de celule
(prelucrare cât mai rapidă / asepsie obligatorie).
• Daca se intentioneaza izolarea de virusuri sau initierea unui explant tisular
produsul nu va fi fixat si se vor lua toate masurile pentru prelucrarea rapida
• Tesuturile destinate diagnosticului molecular trebuie neaparat inghetate dupa
prelevare. Tumorile si tesutul solid sunt surse de nucleaze si proteaze (inhiba
testele moleculare).

3. RECOLTAREA ŞI ETICHETAREA PROBELOR

Recoltarea probelor biologice se realizează în containere sterile pentru evitarea contaminării
cu germeni comensali sau din surse externe; acestea trebuiesc închise ermetic, pentru evitarea
contaminării mediului şi este necesară marcarea vizibilă a containerelor cu semn de biorisc ce
atensemn de biorisc ce atenţionează asupra con asupra coţinnutuui produse infecţioase.

Figura 1.1. Semnul de bio-risc.

În plus este indispensabilă etichetarea corectă, pentru a nu apărea erori (folosind etichete şi
creioane speciale, care să asigure marcaj rezistent la umezeală, îngheţ, fierbere)

3. TRANSPORTUL PRODUSELOR PATOLOGICE VIRUSOLOGICE

Pentru a garanta mentinerea infectivitatii virale transportul
produselor patologice trebuie sa se realizeze:
a) rapid, la rece
b) în siguranţă
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

a) conservarea infectivităţii virale implică temperaturi scăzute, de preferat transport în termos

cu gheaţă sau pe pungi de refrigerare (4 oC), azot lichid ( -190oC), zăpadă carbonică (-70oC),
baia de izopentan (-70oC). Mediul de transport viral contine soluţie salină tamponată (Hanks/
Earle), albumină bovină, antibiotice.
Atenţie: Nu sunt admise congelări şi decongelări repetate, care afectează infectivitatea virală!

b) pentru siguranţa transportului este necesară etanşeitatea perfectă, plus:

- semn de biorisc
- într-un ambalaj special (3 containere) pentru expediţie poştală.
Legătura clinician/medic laborator este indispensabilă deoarece diagnosticul
virusologic este scump, necesită aparatură complicata şi personal calificat.

4. Cum alegem metoda de diagnostic cea mai eficienta?

DIRECŢIILE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC SUNT:

1. Izolarea virală
2. Demonstrarea prezenţei virusului / componentelor sale
3. Diagnosticul serologic

1. IZOLAREA VIRALĂ
Inocularea produsului patologic se face pe suport viu - virusurile se pot multiplica numai în
celule vii, fiind incapabile să-şi asigure necesarul multiplicării pe medii artificiale: nu au
ribozomi (implicati in sinteza proteica), nu au mitocondrii (produc energia necesara
metabolismului celular).

Prin izolarea virală se obţine replicare virala in vitro, asociata cu multiplicarea

numărului de virioni si cu modificari caracteristice ale celulelor infectate viral.

Există 3 sisteme de izolare folosite în virusologie

• Culturi de celule: cel mai frecvent folosite la ora actuală
• Ou de găină embrionat (OGE) - foarte puţin folosit (acum numai pentru izolare sau
obţinere de vaccin gripal)
• Animalul de laborator - model experimental al bolii umane, dar scump
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

Tabel 1.2. Avantajele si dezavantaje sistemelor de izolare virala

AVANTAJE DEZAVANTAJE

ANIMAL DE Infectie naturala, indicatii Cost crescut / considerente

LABORATOR asupra evolutiei bolii etice
O.G.E. Cost scazut Susceptibilitate limitata

CULTURI DE Sensibilitate buna / Susceptibilitate variabila

CELULE disponibilitate larga

Izolarea virala se poate realiza în incubaţie, faza prodromală sau iniţial în faza de stare

2. DEMONSTRAREA PREZENŢEI VIRUSULUI SAU COMPONENTELOR

VIRALE
a) Virion.
Virusurile au dimensiuni sub limita de rezoluţie a microscopului optic (PARTICULELE
VIRALE NU SE POT OBSERVA LA MICROSCOPUL OPTIC!). Detectia particulelor
virale se face la microscopul electronic (ME) sau prim imunelectronomicroscopie (IME) mai
laborioasă (2-3 zile), dar cu specificitate mai mare.
b) Antigenele virale se evidenţiază prin reacţii antigen-anticorp (cu anticorpi aparţinând
serurilor imune de referinţă (se obţin prin inocularea tulpinilor de referinţă la animal) ce pot fi
marcaţi enzimatic (teste imunoenzimatice - ELISA) sau fluorescent (reacţia de
imunofluorescenţă), etc.
c) Detecţia genomului viral – cu teste moleculare sau teste de detectie a acizilor nucleici
(NAT – nucleic acids test): PCR, Rt-PCR, Real Time PCR, etc.

Detecţia particulei virale si a antigenelor se realizează optim în perioada de stare (are

loc multiplicarea virusului în organul ţintă)

3. DIAGNOSTICUL SEROLOGIC este un diagnostic indirect, ce are la bază tot

reactii antigen-anticorp (se folosesc cel mai frecvent teste imunoenzimatice – ELISA)
Se pot realiza 2 tipuri de investigaţii :
Disciplina de Virusologie, UMF Carol Davila

• pe probă unică de ser în care are loc detecţia anticorpi antivirali de tip IgM (apar în
răspunsul imun primar) se utilizează testul ELISA de captură (cu anticorpi anti Ig M)
• pe probe pereche de ser - proba I se recoltează la debut, iar proba II - la 2-3
săptămâni (se utilizează tot ELISA tehnica indirectă sau de competiţie )
- se observă fie seroconversia (proba I - nu există anticorpi/ proba II - apar anticorpi
specifici virusului de detectat), fie creşterea semnificativă a titrului de anticorpi între cele 2
probe (de minim 4 ori)

CORELAŢII INTRE STADIUL BOLII SI OPŢIUNEA DE DIAGNOSTIC

Stadiul bolii Metode directe (izolare virus Diagnostic serologic

sau detecţie virală)
Incubaţie rară -
Fază debut frecvent IgM
Fază de stare rară Ig M şi Ig G
Convalescenţă/ cronicizare - IgG

BIOPROTECŢIA IN LABORATORUL DE VIRUSOLOGIE

Pe plan mondial există statuate 4 nivele de bioprotectie (BSL –

biosafety level), corespunzătoare a 4 grupe de risc progresiv al
microorganismelor patogene.

- BSL 1 - Risc individual = 0, Risc colectiv = 0 ;

- BSL 2 - Risc individual = moderat, Risc colectiv =scăzut (nu diseminează uşor şi
există măsuri profilaxie şi tratament eficiente)

- BSL 3 - Risc individual= moderat, Risc colectiv =moderat (există măsuri de

prevenire, tratament)

- BSL 4 - Risc individual = crescut, Risc colectiv =crescut (se transmit uşor, nu
există măsuri de tratament /prevenire.