Bursttest (explozia oxidativă a neutrofilului)

Pret 246,00 lei
Adauga in Cos
 Durata 10 zile*
* estimare valabilă doar pentru centrele din București

 sânge venos

Informaţii generale şi recomandări pentru efectuarea testului

Neutrofilele deţin un rol important în răspunsul imun nespecific, în special în rezistenţa
antibacteriană, ca celule efectoare, inductoare şi reglatoare. Printre caracteristicile lor
esenţiale se numără:

• marginaţia şi aderarea la celulele endoteliului vascular;

• traversarea peretelui vascular (diapedeza) şi migrarea către focarele de inflamaţie;
• recunoasterea şi fagocitarea moleculelor opsonizate;
• degradarea şi distrugerea acestor molecule prin generarea de radicali toxici de oxigen.

Aceste caracteristici sunt facilitate de prezenţa de receptori aflaţi la suprafaţa şi în

interiorul celulelor, cum ar fi receptorii pentru citokine, neuromediatori, autacoizi şi
hormoni.

Chemotactismul neutrofilelor se produce ca răspuns la factorii chemotactici

(chemotaxine) generaţi la nivelul focarului lezional. Mai mult, chemotaxinele intensifică
metabolismul neutrofilelor, agregarea acestora şi acţiunile bactericide.

Fagocitoza este mediată de opsonine circulante, specifice (imunoglobuline IgG) sau

nespecifice (componente ale complementului), neutrofilele având receptori pentru
fragmentul Fc al imunoglobulinelor IgG1, IgG2 şi pentru fragmentul complementului
iC3b (C3b inactivat). Microorganismele absorbite şi opsonizate sunt distruse atât prin
mecanisme oxigen-dependente cât şi oxigen-independente. Radicalii liberi de oxigen
degradează bacteriile absorbite în fagozomi şi sunt parţial eliberaţi în mediul
înconjurător unde intensifică distrugerea microorganismelor şi determină simultan
lezarea ţesuturilor. Procesul este caracteristic inflamaţiei acute, fiind mult mai rar întâlnit
în afecţiunile inflamatorii cronice. Distrugerea microorganismelor se mai poate produce
şi prin intermediul proteinelor prezente în granulaţiile azurofiele cum ar fi: catepsina G,
lizozimul, interferonii etc.

Mediatorii inflamaţiei, citokinele (de exemplu, TNFα) şi selectinele cresc abilitatea

granulocitelor de a se localiza la nivelul focarului de inflamaţie. Capacitatea de
fagocitoză este crescută prin intensificarea producţiei de radicali de oxigen şi prin
eliberarea enzimelor lizozomale. TNFα este un factor important care potenţează
activitatea fagocitară şi citotoxică a neutrofilelor. La rândul lor, granulocitele activate
secretă citokine; IL-1 care stimulează producţia de IL-8 de către monocite, celule
endoteliale şi fibroblaşti, creşte expresia moleculelor de adeziune CD11b/CD18 şi
generarea de radicali de oxigen. Interferonul gamma este o citokină puternică care
intensifică expresia receptorului Fc, stimulează modificările oxigenului precum şi
eliberarea granulelor din neutrofile1.

Datorită caracteristicilor menţionate granulocitele sunt implicate în răspunsul inflamator

precoce, iar anomaliile funcţionale ale acestora, survenite în oricare din etape,
determină deficienţe semnificative ale  imunităţii celulare5.

O activitate redusă sau absenţa de generare a exploziei oxidative în neutrofile sau

monocite este întâlnită în unele defecte moştenite cum ar fi boala granulomatoasă
cronică (CGD). CGD reprezintă un grup heterogen de afecţiuni cu transmitere X-linkată
sau autozomal recesivă având la bază mutaţii genetice multiple. Ca urmare a acestor
anomalii este afectată una din cele patru subunităţi ale enzimei NADPH oxidază ce
catalizează formarea peroxidului de hidrogen. Procesul de fagocitoză se desfaşoară
normal însă este perturbat metabolismul oxidativ – oxigenul molecular nu mai este
redus la anionul superoxid şi la alţi radicali liberi (radical hidroxil şi peroxid de hidrogen)
ce reprezintă componente importante ale mecanismului intracelular de distrugere a
bacteriilor.

Pacienţii cu CGD prezintă infecţii recurente cu microorganisme producătoare de

catalază, cum ar fi Staphylococcus aureus, care sunt capabili să distrugă peroxidul de
oxigen generat de neutrofile. Aceste microorganisme supravieţuiesc ingestiei
intracelulare, se multiplică şi determină o reacţie granulomatoasă din partea ţesuturilor,
care atunci când devine excesivă poate obstrucţiona tracturile gastrointestinal şi
genitourinar. Alte organe ce pot fi afectate de granuloame sunt plămânul, ganglionii
limfatici, ficatul, osul. Infecţiile cronice cu Serratia spp., Klebsiella spp., Burkholderia
cepacia şi Aspergillus spp., sunt în special problematice. De menţionat că pacienţii cu
CGD nu suferă infecţii cu microorganisme catalazo-negative. Debutul bolii are loc de
obicei în primii doi ani de viaţă2;3;4.

Explozia oxidativă a neutrofilelor poate fi afectată şi la pacienţii cu transplant precum şi

la cei cu SIDA.

Anumite imunomodulatoare (citokine: GM-CSF, G-CSF, TNFα) pot avea un oarecare

efect şi asupra metabolismului oxidativ celular4.

Caracteristica principală a neutrofilelor în CGD este aceea că după stimulare nu sunt

capabile să producă o explozie oxidativă semnificativă. Metoda clasică pentru
screening-ul acestei afecţiuni utilizează un colorant – albastru-nitrat de tetrazol
(nitroblue tetrazolium – NTB test) ce este incubat împreună cu neutrofilele stimulate ale
pacientului; neutrofilele funcţionale fagocitează, reduc şi precipită colorantul NTB
galben rezultând depozite intracelulare de formazan negru-albastrui; aceste depozite
reprezintă un indicator al formării intracelulare de peroxid de hidrogen; în urma
examinării microscopice se efectuează un scor al neutrofilelor ce conţin depozite
intracelulare de formazan3.

În laboratorul nostru testul NBT a fost înlocuit de Bursttest care foloseşte citometria în
flux pentru a evalua metabolismul oxidativ alterat al neutrofilelor din CGD sau alte
afecţiuni şi pentru a studia efectul unor medicamente imunomodulatoare4.

Pregătire pacient – se va evita recoltarea probei în cursul unei infecţii acute4.

Specimen recoltat – sânge venos4. 

Recipient de recoltare – vacutainer cu heparinat de litiu4.

Volum probă – minim 10 mL sange heparinat4.

Stabilitate probă – sângele trebuie să ajungă în maxim 24 ore la laboratorul la care se

efectuează testul şi în această perioadă se păstrează la temperatura camerei. Este
contraindicată refrigerarea probei4.

Cauze de respingere a probei – specimene care au depăşit intervalul de stabilitate,

probe refrigerate sau congelate4.

Metodă – citometrie în flux.

Bursttest permite evaluarea cantitativă a exploziei oxidative din neutrofile şi monocite.

Se utilizează bacterii (E. coli) opsonizate nemarcate ca particule stimulante, ligandul de
proteinkinaza C (PMA – forbol12-miristat 13-acetat) ca stimul puternic, independent de
receptori şi peptidul chemotactic N-formil-MetLeuPhe (fMLP) ca stimul fiziologic slab.
Sângele heparinat al pacientului este incubat cu stimulii menţionaţi la 37°C; se
utilizează şi o probă cu rol de control negativ care nu este incubată cu stimuli; după
stimulare, neutrofilele şi monocitele produc specii reactive de oxigen care distrug
bacteriile din interiorul fagozomului; formarea acestor compuşi este monitorizată prin
adăugarea unui substrat fluorogenic – dihidrorodamina (DHR) – care odată oxidat va
genera produşi intracelulari fluorescenţi detectaţi ulterior prin citometrie în flux; reacţia
este stopată prin adăugarea soluţiei de liză ce îndepărtează eritrocitele şi determină o
fixare parţială a leucocitelor; soluţia de colorare a ADN-ului, adăugată înaintea analizei
prin citometrie în flux, exclude artefactele generate de agregatele bacteriene care au
proprietăţi de dispersare a luminii asemănătoare leucocitelor; se utilizează un laser cu
argon (488 nm, lumina albastră); pentru fiecare probă se colectează prin
“gating” 10000-15000 leucocite; sunt analizate atât procentul de celule (neutrofile si
monocite) care au produs specii reactive de oxigen (recrutare), cât şi intensitatea medie
a fluorescenţei acestora (activitatea, cantitatea de substrat clivat); în acest scop se va
efectua un “gating” pe grupul leucocitar relevant şi se va analiza histograma
fluorescenţei verzi a acestuia (FL1); prin utilizarea controlului negativ se va seta un
marker pentru fluorescenţa-1 (FL1) astfel încât sub 1% din evenimente să fie pozitive;
procentul de celule care produc specii reactive de oxigen va putea fi apoi determinat
prin numărarea evenimentelor localizate deasupra marker-ului; intensitatea medie a
fluorescenţei se corelează cu numărul de produşi generaţi de către un singur leucocit4.

Valori de referinţă şi comunicarea rezultatelor

Sunt raportaţi următorii parametri:

 procentul de neutrofile care produce specii reactive de oxigen: >84%

 activitate oxidativă de neutrofile: >550 mfi; mfi = intenistatea medie a
fluorescenţei4
Limite şi interferenţe
Probele cu un număr de leucocite aflat în afara intervalului de referinţă necesită o
corecţie a cantităţii de bacterii adăugate4.

Bibliografie

1. Anatol Panasiuk, Jolanta Wysoka, Elzbieta Maciorkowska, Bozena Panasiuk, Danuta Prokopowicz,
Janusz Zak, Karol Radomski. Phagocytic and oxidative burst activity of neutrophils in the end stage of
liver cirrhosis. In World Journal of Gastroenterology 2005; 11(48):7661-7665.
2. Francesco Dati & Erwin Metzmann. Immunodeficiencies: Characteristics and laboratory findings. In
Proteins Laboratory Testing and Clinical Use, Media Print Taunusdruck GmbH, Frankfurt am Main;
2005,187.
3. Kimberley W. Sanford, Susan D. Roseff. Immunodeficiency Disorders. In Henry’s Clinical Diagnosis
and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 911.
4. Laborator Synevo. Referinţele specifice tehnologiei de lucru utilizate 2011. Ref Type: Catalog.
5. Roger S. Riley, Jonathan Ben-Ezra. Laboratory Evaluation of the Cellular Immune System. In Henry’s
Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Saunders-Elsevier, 21st Edition, 826-830.

sursa de inspiratie
https://www.synevo.ro/shop/bursttest-explozia-oxidativa-a-neutrofilului/