LP 1.

BIOSINTEZA L-ASPARAGINAZEI

1. Caracterizarea generala L-asparaginazei

L-asparaginaza sau L-asparagin-amidohidrolaza (E.C. 3.5.1.1) este enzima care

hidrolizeaza L-asparagina la acid L-aspartic si amoniac.

HOOC CH CH2 CONH2 L-Asparaginaza HOOC CH CH 2 COOH

+ H 2O + NH 3
NH 2 NH 2
L-asparagina acid L-aspartic

L-asparaginaza este o enzima care, din punct de vedere farmacologic, este activa ca
agent chimioterapic antineoplazic, fiind folosita in special in pediatrie, in tratamentul leucemiilor
limfoblastice acute. Importanta terapeutica a L-asparaginazei se datoreaza actiunii sale
antitumorale si antileucemice. Aceasta se bazeaza pe proprietatea enzimei de a descompune
prin hidroliza L-asparagina in acid L-aspartic si amoniac, oprind dezvoltarea celulelor leucemice
prin carenta in L-asparagina, respectiv prin inhibarea sintezei proteice in celulele tumorale, care
necesita aport de L-asparagina exogena, intrucat sunt lipsite de posibilitatea de a-si sintetiza
acest aminoacid.
Dintre numeroasele microorganisme testate in ceea ce priveste capacitatea de a
produce L-asparaginaza intra- sau extracelular se detaseaza bacteriile E. coli, Erwinia sp.,
Pseudomonas sp., Bacillus subtilis.
La scara industriala L-asparaginaza se obtine prin procedee biotehnologice, utilizand ca
microorganisme producatoare tulpini de E. coli sau Erwinia sp.
Escherichia coli produce doua forme ale acestei enzime, denumite L-asparaginaza 1
(EC1) si L-asparaginaza 2 (EC2), dintre care, doar EC2 poate fi utilizata in mod eficient in
terapia cancerului.
EC2 difera de cealalta forma prin cateva caracteristici biochimice si fizico-chimice, dintre
care cele mai importante sunt prezentate in tabelul urmator:

Caracteristici EC1 EC2

Localizarea Citoplasmatica Spatiul periplasmatic
Afinitate fata de substrat Mica Mult mai mare
Activitate farmacologica Forma inactiva Forma activa
Variatia activitatii
Inactiva la pH < 4 Activa si la pH < 4
enzimatice in functie de pH

Biosinteza L-asparaginazei de catre tulpini de E.coli se poate realiza printr-un proces de

fermentatie asemanator celui aplicat pentru biosinteza penicilin-G-acilazei, cu deosebirea ca,
pentru biosinteza L-asparaginazei se foloseste un mediu de cultura cu o concentratie mai mare
de extract de porumb si imbogatit in aminoacizi.

2. Fermentatia la baloane agitate

Mediile de cultivare lichide preparate la nivel de laborator se pot utiliza pentru obtinerea
culturilor de microorganisme ce sunt folosite ca material de insamantare (inocul de laborator) in
bioreactoarele industriale. In cazul in care anumite tulpini de E. coli sunt folosite pentru obtinerea
unor enzime de interes farmaceutic, cum ar fi penicilin-G-acilaza, aspartaza sau asparaginaza,
se recomanda ca in compozitia mediilor de cultura folosite in diferitele trepte de fermentatie sa
se introduca anumite substante (inductori), care favorizeaza biosinteza acestor enzime.

1
Materii prime:
- extract de porumb (50% s.u.)
- sulfat de amoniu (calitate p.a.)
- inductor: L-asparagina
- NaOH 40%
- HCl 2N

Sticlarie si aparatura:
- baloane Erlenmayer (100 – 750 ml)
- fiole de cantarire
- mensura (1 000 ml)
- cilindrii (20 – 1000 ml)
- pipete (1 – 10 ml)
- balanta analitica
- pH-metru sau hartie indicatoare de pH
- autoclav de laborator

Mod de lucru:
In functie de capacitatea baloanelor Erlenmayer in care se va efectua bioprocesul la nivel
de laborator, se prepara un volum de mediu corespunzator unui procent de 20% din volumul
total al balonului.
Compozitia mediului de cultura este urmatoarea:
- extract de porumb - 3,0% (g/v)
- sulfat de amoniu - 0,1% (g/v)
- L-asparagina - 0,05% (g/v)
Se prepara o solutie stoc de extract de porumb (50% g/v S.U.), de concentratie 10%. In
acest scop extractul de porumb se cantareste intr-o fiola de cantarire adecvata, dupa care se
reia cantitativ cu apa comuna intr-o mensura, se omogenizeaza si se aduce la semn, pentru
realizarea concentratiei sus-mentionata. Din aceasta solutie se repartizeaza per balon volumul
corespunzator concentratiei de extract de porumb prevazuta in reteta de mediu. Apoi se prepara
in mod similar solutia stoc de sulfat de amoniu 10% g/v, L-asparagina 1% g/v. De mentionat ca
pentru prepararea solutiilor de inductori este necesara ajustarea pH-ului in domeniul 6,5-7,
pentru dizolvarea completa a substantelor respective.
Din solutiile stoc de sulfat de amoniu si inductori se repartizeaza per balon un volum
corespunzator concentratiei prevazute in formula de mediu pentru ingredientele respective.
Dupa reunirea ingredientelor se corecteaza pH-ul mediului in fiecare balon la valoarea
optima ceruta de microorganism (de regula cu solutie NaOH 40% sau HCl 2N, dupa caz).
In final, dupa corectia pH-ului, solutia se aduce la volumul final corespunzator necesitatilor
respiratorii ale microorganismului (in cazul bacteriei E. coli, facultativ aeroba, se lucreaza cu un
volum de mediu reprezentand 20% din volumul total al balonului).
Baloanele cu mediul de cultura astfel preparat, se inchid cu dopuri bacteriologice, se
acopera cu hartie si se leaga cu sfoara, dupa care se sterilizeaza in autoclav, la 120 0C, timp de
30 min.

2
 LP 2. TRASAREA CURBEI ETALON PENTRU DETERMINAREA AZOTULUI CU
REACTIV NESSLER

Principiul metodei
Reactivul Nessler (iodura mercurica de potasiu in mediu alcalin) este utilizat pentru
determinarea colorimetrica a azotului anorganic in concentratii variind in domeniul 5-100 μg N.
Ca solutie standard pentru trasarea curbei etalon se folosese o solutie de (NH 4)2SO4. Reactivul
Nessler reactioneaza cu sarea de amoniu formand o solutie de culoare galbena care se
determina spectrofotometric la λ = 450 nm.

Reactivi si aparatura
- Reactivul Nessler: 4,55 g HgI2 (2,72 g HgCl2) + 3,49 g KI se
dizolva in 5 ml apa distilata. Se cantaresc 11,2 g KOH si se dizolva in 14 ml apa
distilata. Ultima solutie (cea de KOH) se adauga peste solutia de HgI 2 si KI
obtinandu-se o solutie care se aduce intr-un balon cotat la 100 ml cu apa distilata si
se lasa la rece pentru sedimentarea precipitatului format.
- Solutie standard de sulfat de amoniu (0,01M): 10 μmoli
(NH4)2SO4/ml = 20 μmoli NH3/ml (solutie A)

Mod de lucru
Din solutia standard de sulfat de amoniu (solutia A) se prepara o dilutie 1:5 (solutie B)
prin dilutia solutiei A, dupa cum urmeaza: 5 ml solutie standard se aduc la 25 ml intr-un balon
cotat cu apa distilata (solutia B). Din solutia B se prepara dilutii, conform tabelului de mai jos.
In fiecare proba se adauga cate 0,4 ml reactiv Nessler. Dupa agitare, probele se lasa 10
minute, la temperatura camerei pentru “dezvoltarea culorii”, dupa care se citeste densitatea
optica la λ = 450 mn a probelor 1-10 fata de apa distilata. In final, se traseaza curba etalon, in
coordonatele x = nr. μmoli NH3/ml proba si y = extintia la λ = 450 mn.

Nr. Solutie B Apa distilata R. Nessler

μmoli NH3 E415 nm
eprubeta (ml) (ml) (ml)
1 0,1 9,5 0,4 0,4
2 0,2 9,4 0,4 0,8
3 0,3 9,3 0,4 1,2
4 0,4 9,2 0,4 1,6
5 0,5 9,1 0,4 2,0
6 0,6 9,0 0,4 2,4
7 0,7 8,9 0,4 2,8
8 0,8 8,8 0,4 3,2
9 0,9 8,7 0,4 3,6
10 1,0 8,6 0,4 4,0

3
 LP 3. DETERMINAREA ACTIVITATII ENZIMATICE A L-ASPARAGINAZEI

Principiul metodei
Metoda utilizata pentru determinarea activitatii enzimatice a L-asparaginazei din mediul
de fermentatie se bazeaza pe principiul determinarii unuia dintre produsii de reactie rezultati din
actiunea enzimei asupra substratului specific.
Determinarea activitatii L-asparaginazei se efectueaza printr-o metoda
spectrofotometrica, bazata pe determinarea amoniacului rezultat in urma actiunii enzimei asupra
L-asparaginei, printr-o reactie de culoare caracteristica acestuia. Amoniacul reactioneaza cu
reactivul Nessler si formeaza un compus colorat a carei absorbtie se determina
spectrofotometric la =450 mn.
Activitatea enzimatica a L-asparaginazei se mai poate determina si prin evidentierea
formarii acidului L-aspartic prin cromatografie pe hartie, urmata de reactia de culoare cu
ninhidrina, stabilizarea coloratiei cu clorura de cadmiu, extractia culorii cu solutie
hidrometanolica si determinarea intensitatii absorbtiei produsului rezultat la λ=550 nm.
O unitate internationala de activitate L-asparaginazica este definita ca fiind cantitatea de
enzima care catalizeaza formarea unui µmol de amoniac/minut in conditii standard de analiza
(L-asparagina 1%, temperatura 370C, pH=5,0, timp de reactie 30 minute).
Reactivi:
- suspensie mediu fermentat de E. coli
- tampon acetat pH=5, 0,1M
- acid tricloracetic 15%
- solutie L-asparagina 1% (in tampon acetat pH=5, 0,1M)
Aparatura si sticlarie:
- baie termostat
- centrifuga
- spectrofotometru UV VIS
- eprubete
- pipete 1, 2, 5, 10 ml
- cuve pentru centrifuga
Mod de lucru:
Protocolul de lucru pentru determinarea activitatii L-asparaginazei este prezentat in
tabelul de mai jos:
Proba Martor
- suspensie enzima 0,25 ml - suspensie enzima 0,25 ml
- tampon acetat 0,1M, pH=5 0,25 ml - tampon acetat 0,1M, pH=5 0,25 ml
- solutie L-asparagina 1% 1,5 ml - TCA 15% 0,5 ml
- solutie L-asparagina 1% 1,5 ml
Incubare la 370C, 30 min
- TCA 15% 0,5 ml
Centifugare 4000 rpm, 20 min
- solutie supernatant 0,1 ml - solutie supernatant 0,1 ml
- apa distilata 9,5 ml - apa distilata 9,5 ml
- reactiv Nessler 0,4 ml - reactiv Nessler 0,4 ml
Citire 450 nm

Calculul activitatii L-asparaginazei in mediul de fermentatie:

A [μmoli NH3/min./ml] = EP x P x 1,66
unde: EP = extinctia probei
P = panta curbei de etalonare
1,66 = factor de multiplicare care ia in considerare dilutia probei si timpul de incubare
4
 LP 4. OBTINEREA LIPAZELOR PRIN BIOSINTEZA CU YARROWIA LIPOLYTICA

1. Prezentare generala a lipazelor: definitie, origine, clasificare

Lipazele (E.C. 3.1.1.3) sunt enzime care fac parte din clasa hidrolazelor, subclasa
esterazelor (3.1). Esterazele sunt hidrolaze care acţionează asupra legăturilor esterice dintre
acizii organici, acidul fosforic şi acidul sulfuric si diferiţi alcooli sau fenoli.
In functie de provenienta lor, lipazele pot fi clasificate in:
 lipaze de origine animala
 lipaze de origine vegetala
 lipaze de origine microbiana
Lipazele sunt carboxil-ester hidrolaze care se deosebesc de celelalte esteraze prin faptul
ca au proprietatea unica si specifica de actiona la interfata ulei-apa dintr-un mediu eterogen
(emulsii), catalizand reactia de hidroliza a esterilor glicerolului sau a altor alcooli cu acizi grasi cu
catena lunga, cu formare de acizi grasi liberi si glicerina sau alcoolul corespunzator.
Mecanismul hidrolizei trigliceridelor de către lipaze poate fi prezentat prin reacţia:

CH2O OCR1 CH2OH

CHO OCR2 + 3 H2O CH2OH + R1COOH + R2COOH + R3COOH
CH2O OCR3 CH2OH

In functie de natura alcoolilor implicati in legaturile esterice pe care le hidrolizează

enzimele lipolitice pot fi divizate în:
- carboxil-ester hidrolaze simple (hidrolizeaza esteri ai alcoolilor – altii decat
glicerina – sau fenolilor);
- lipaze propriuzise (hidrolizeaza esteri ai glicerinei);
- fosfolipazele 1 şi 2, lizofosfolipazele, galactolipazele (hidrolizeaza derivati ai
gliceridelor)
- colesterol esteraza (hidrolizeaza esteri ai sterolilor).
Rolul biologic al lipazelor pentru organismele vii este semnificativ: ele asigura
functionarea membranelor, participă la metabolismul lipidic, la procesul de depozitare a
grăsimilor de rezervă, etc. Din aceste motive, lipazele au o importanţă deosebită în medicină, ca
mijloc terapeutic şi de diagnosticare.
Lipazele isi gasesc aplicatii in diferite domenii ca:
- industria chimica, la sinteza esterilor, în producerea şi prelucrarea grăsimilor
şi uleiurilor vegetale
- industria alimentara, ca aditivi alimentari
- industria farmaceutică, pentru obtinerea unor medicamente indicate in
dispensii sau de tip antiinflamator non-steroidal
- industria textila, pentru indepartarea grasimilor de pe fibrele de bumbac
- pielărit, pentru degresarea pieilor şi a blănurilor
- industria detergenţilor, pentru obtinerea detergentilor tip liposistem
- remedierea mediului, pentru epurarea apelor reziduale
- agricultură şi zootehnie, la prepararea nutreţurilor uşor asimilabile
Detectarea însuşirii lipazelor de a cataliza nu numai hidroliza, dar şi sinteza lipidelor, prin
reactii de esterificare şi transesterificare, a creat posibilitatea aplicarii acestora în sinteza
organică fină, în industria petrolieră sau pentru obţinerea substanţelor tensioactive.

5
 2. Biosinteza lipazelor cu Yarrowia lipolytica

Conform datelor din literatura de specialitate, microorganisme din diferite grupe

taxonomice: bacterii, fungi, drojdii au capacitatea de a sintetiza enzime lipolitice. Această
activitate se întâlneşte frecvent la reprezentanţii genurilor: Rhizopus, Penicillium, Aspergillus,
Geotrichum, Mucor, Pseudomonas, Streptomyces, Candida.
Microorganismele produc atât lipaze intracelulare (bacteriile), cat şi lipaze extracelulare
(drojdiile).
Lipazele microbiene, obţinute din diferite surse, se deosebesc între ele prin proprietăţile
fizico-chimice şi mecanismul de acţiune.
Cele mai bune producătoare de lipaze sunt considerate drojdiile, îndeosebi cele din
genul Candida.
Compoziţia mediului nutritiv joacă un rol important atât pentru creşterea şi dezvoltarea
microorganismelor cat şi pentru biosinteza enzimatică.
Activitatea lipolitică a drojdiilor diferită, în functie de condiţiile de cultivare, natura
substratului, prezenţa în mediul nutritiv a inductorilor şi inhibitorilor.
Majoritatea lipazelor au un caracter inductibil. Biosinteza enzimelor de catre tulpinile
cultivate într-un mediu ce contine inductori creste considerabil faţă de cultivarea tulpinii pe un
mediu fără inductori.
Ca inductori ai lipazelor pot servi grăsimile de origine animală şi vegetală (măsline, soia),
tween-urile, acizii graşi, tributirina, diverse săruri, cationi, anioni.
Sarurile minerale pot acţiona, prin cationii lor, asupra biosintezei enzimatice atât ca
inductori, cat şi ca inhibitori. Astfel, sărurile de Cu 2+, Fe2+, Zn2+ sunt evidentiate şi ca inductori,
dar şi ca inhibitori, in functie de tulpina de lucru.
Dintre drojdiile bune producatoare de lipaze, Yarrowia lipolytica se remarca in mod
deosebit.
Pentru obtinerea unui preparat lipolitic prin biosinteza cu tulpini de Yarrowia lipolytica, se
parcurg urmatoarele etape:
 obtinerea culturii de întreţinere (conserv vegetativ)
 prepararea inoculului
 fermentatia propriu-zisa la nivel de laborator (baloane agitate)

Prepararea conservului vegetativ

Mod de lucru:
Mediul de cultura folosit la obtinerea conservului vegetativ de Yarrowia lipolytica este
reprezentat de mediul YPG.
Mediu YPG - solid (% g/v):
- Glucoza 2%
- Peptona 2%
- Extract de drojdii 1%
- Agar 2%
pH = 7
Dupa preparare mediul se repartizeaza in eprubete si se sterilizeaza prin autoclavare la
1210C, 15 minute. Se raceste pentru solidificare pe o suprafata inclinata, dupa care se
insamanteaza cu o suspensie de celule de Yarrowia lipolytica provenita dintr-o fiola cu liofilizat.
Cultura se incubeaza 48 ore, la 280C. Cultura astfel obtinuta se poate pastra timp de maxim 6
luni la frigider.

Prepararea inoculului
Mod de lucru:
Din cultura de întreţinere obtinuta anterior se prepară o suspensie în apă distilată sterilă.
2 ml suspensie se însămânţează în 20 ml mediu YPG lichid, repartizat in flacoane Erlenmayer
de 100 ml, sterilizat in prealabil prin autoclavare la 121 0C, 20 minute. Cultura inocul se dezvolta
timp de 20-24 h, la 280C, în condiţii de agitare continuă la 240 rpm.
6
 Mediu YPG - lichid (% g/v):
- Glucoza 2%
- Peptona 2%
- Extract de drojdii 1%
pH = 6

Fermentatia la baloane agitate

Mod de lucru:
Pentru biosinteza lipazei se foloseste un mediu de fermentatie cu urmatoarea compozitie:
- Peptona 2%
- Extract de drojdii 1%
- FeSO4 0,1%
- MgSO4 0,004%
- KH2PO4 0,2%
- Ulei de masline 2,0%
pH = 6

Cate 100 ml din mediul astfel preparat se repartizeaza în flacoane Erlenmeyer de 500 ml
si se sterilizeaza prin autoclavare la 1210C, 20 minute. Dupa racire, mediile se insamanteaza cu
inocul, in proprotie 10% si se incubeaza la 28 0C, 48 h, sub agitare intensa la 240 rpm. Periodic
(din 6 in 6 ore) se efectueaza determinari de densitate optica, pH si activitate lipazica in mediul
de fermentatie.

7
 LP 5. DETERMINAREA ACTIVITATII LIPOLITICE

Principiul metodei
Determinarea activităţii lipazice se efectueaza titrimetric, prin dozarea acizilor grasi
eliberati in mediul de reactie in urma actiunii enzimei asupra substratului, uleiul de masline.
Cantitatea de acizi grasi formata se determina prin titrare cu o solutie diluata si standadizata de
NaOH, in prezenta de fenolftaleina (viraj incolor → rosu, pH = 8,2 - 10) ca indicator. Volumul
solutiei de NaOH necesar pentru neutralizarea acizilor grasi eliberati este proportionala cu
activitatea lipazica.

CH2O OCR1 CH2OH

CHO OCR2 + 3 H2O CH2OH + R1COOH + R2COOH + R3COOH

CH2O OCR3 CH2OH

Triglicerida Glicerol Acizi grasi

O unitate de activitate lipazică este definită ca fiind cantitatea de enzima care elibereaza
prin hidroliza trigliceridelor din uleiul de masline, 1 µmol de acid gras, in conditiile analizei
(temperatura = 370C, pH = 7, timp de reactie = 60 minute).

Reactivi:
1. substrat: ulei de masline preparat sub forma de emulsie in solutie apoasa de guma
arabica
a) se dizolva 16,5 g guma arabica in 130 ml apa distilata.
b) dupa solubilizarea completa se dilueaza pana la 165 ml cu apa distilata.
c) se adauga 20 ml ulei de masline si 15 g gheata sfaramata
d) amestecul obtinut se omogenizeaza bine pe agitator
Observatie: Substratul se prepara proaspat, innainte de utilizare
2. solutie tampon citrat 0,2 M pH = 7
3. solutie de clorura de calciu 0,6%
4. preparat enzimatic: pulbere sau lichid de fermentatie
5. reactiv pt. stoparea reactiei = amestec etanol : acetona (1 :1)
6. solutie de NaOH 0,1M cu factor determinat, preparata cf. FR X
7. solutie indicator de fenolftaleina, preparata cf. FR X

Mod de lucru:
Reactia enzimatica se efectueaza intr-un pahar Erlenmeyer de 100 ml, comparativ cu o
proba martor, conform urmatoarei scheme de lucru:

Proba Martor
10 ml emulsie substrat 10 ml emulsie substrat
2 ml sol. CaCl2 2 ml sol. CaCl2
5 ml sol. tampon citrat 5 ml sol. tampon citrat
1 -5 ml lichid de fermentatie 20 ml reactiv de stopare
- 1-5 ml lichid de fermentatie
0
Incubare 60 minute la 37 C, sub agitare la 170 rpm
20 ml reactiv de stopare -
Titrarea aciditatii cu sol. NaOH 0,1N, in prezenta fenolftaleinei
(0,2 ml fenolftaleina la 20 ml solutie de titrat)

8
 Calculul activitatii:

A (U/h) = (VP – VM) x F x 100 / g (V)

unde: VP = volumul de solutie de NaOH 0,1 N cu care s-a titrat proba (ml)
VM = volumul de solutie de NaOH 0,1 N cu care s-a titrat martorul (ml)
F = factorul solutiei de NaOH 0,1 N
100 = factor care include transformarea volumului de solutie de NaOH 0,1 N in μmoli
acizi grasi corespunzatori
g = cantitatea de enzima pulbere luata in analiza (mg)
v = volumul de lichid de fermentatie luat in analiza (ml).

9
 LP 6. PRELUCRAREA POST-BIOSINTEZĂ A MEDIILOR DE FERMENTAŢE

Indiferent de localizarea produselor de biosinteză intra- sau extracelular, prima etapă de

prelucrare post-biosinteză a mediilor de fermentaţie constă în separarea biomasei.
Pentru a reduce pierderile de substanţă activă prin denaturare termică, mediile de cultură
se răcesc la 5-100C se filtreaza sau se centrifugheaza urmand sa se retina in continuare
biomasa sau filtratul, în funcţie de localizarea substanţei active.
Cel mai des folosite metode pentru izolarea si purificarea lipazelor de origine microbiana
sunt: fractionarea cu sulfat de amoniu si precipitarea cu solventi organici (acetona sau alcool
etilic).

Purificarea lipazelor prin fractionare cu sulfat de amoniu

Precipitarea fractionata cu sulfat de amoniu este mentionata in datele de literatura ca

prima treapta de prelucrare post-biosinteza a mediilor de fermentatie continand lipaze de origine
microbiana.
Utilizarea acestei metode ca etapa de purificare primara a lipazelor microbiene din
lichidele de fermentatie se bazeaza pe modificarea diferentiata a solubilitatii proteinelor
enzimatice fata de cea a altor proteine de balast, in functie de concentratia de sulfat de amoniu
din mediu.
In cazul unei proteine date, solubilitatea ei creste cu concentratia unei sari neutre
(salting-in), atinge o valoare maxima, dupa care scade treptat, pana cand precipita din solutie
(salting-out). Fiecare proteina, in functie de structura ei, precipita la o anumita concentratie dintr-
o sare, deci teoretic ceea ce face posibila separarea treptata a proteinelor dintr-un amestec.
Precipitarea proteinelor la concentratiior mari de sare se datoreaza faptului ca ionii sarii
indeparteaza moleculele de apa care in mod obisnuit hidrateaza suprafata proteinelor, fenomen
care conduce in final la precipitarea acestora din solutie. Fenomenul de precipitare este
reversibil, astfel ca prin reluarea precipitatului intr-un volum limitat de apa, aceasta se redizolva,
semn ca nu a fost alterata structura tertiara a macromoleculei proteice.
Pentru ca o sare neutra sa fie utilizata ca agent de precipitare fractionata a unui amestec
de mai multe proteine, aceasta trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii:
- sa prezinte o mare solubilitate in apa, pentru a permite obtinerea unei game largi de
concentratii la care sa precipite diferentiat proteinele din amestec;
- dizolvarea sarii in mediul apos sa nu provoace variatii de pH si sa nu aiba loc cu
degajare de caldura, care ar denatura proteinele;
- sarea nu trebuie sa interactioneze chimic cu proteina.
Sarea care corespunde cel mai bine conditiilor sus-mentionate este sulfatul de amoniu,
care, din acest motiv, este cel mai des utilizat agent de precipitare fractionata in chimia
proteinelor si in plus, manifesta un efect protector asupra multor enzime.
Utilizarea sulfatului de amoniu prezinta si unele dezavantaje:
- interfera in dozarea proteinelor prin metoda Lowry;
- prin solubilizare, au loc mici variatii de temperatura si de pH.

Reactivi:
- lichid de fermentatie continand lipaza, obtinut prin filtrarea mediului integral de
fermentatie cu Yarrowia lipolytica
- sulfat de amoniu cristalizat

Mod de lucru:
Din 100 ml lichid de fermentatie filtrat, se preleveaza 2 ml pentru dozarea proteinelor.
Restul de 98 ml se raceste la +5...+100C si sub agitare continua si racire se incepe adaugarea
trepta a 17,15 g sulfat de amoniu (1 g/min). Dupa dizolvarea completa a sarii, precipitarea se
perfecteaza prin stationare la +40C, timp de 30 minute.

10
 Suspensia rezultata se centrifugheaza la 4.000 rpm, 15 minute, iar sedimentul obtinut
(fractia P1) se reia in 25 ml apa pentru determinarea continutului in proteina si a activitatii
enzimatice. In supernatant (volum 100 ml) se adauga 19 g sulfat de amoniu, care se dizolva prin
agitare, in conditiile sus mentionate. Dupa 30 minute, fractia P2 a proteinelor precipitate in
domeniul de saturatie 30-60% se separa prin centrifugare. Precipitatul este reluat in 25 ml, iar in
solutie este determinata concentratia proteica si activitatea enzimatica. La un volum de 100 ml
supernatant se adauga 21,5 g sulfat de amoniu, iar dupa dizolvarea sarii si perfectarea
precipitarii se procedeaza la centrifugarea suspensiei timp de 15 minute la 10.000 rpm.
Supernatantul (care reprezinta o solutie salina saturata 90% in sulfat de amoniu) se arunca, iar
precipitatul, care reprezinta fractia P3 (a proteinelor precipitate in domeniul de saturatie 60%-
90%) este reluat in aproximativ 25 ml apa distilata. De asemenea, in fractia P 3 este determinata
concentratia proteica si activitatea enzimatica.

11
 LP 7. Purificarea lipazelor prin fractionare cu solventi organici

Solventii organici ca acetona, metanolul, etanolul, cloroformul etc., precipita proteinele

aflate in solutie apoasa, datorita efectului lor de micsorare a constantei dielectrice a mediului.
Intrucat moleculele proteice sunt polielectroliti, ele sunt solubile in mediul apos. Prezenta apei,
care are o constanta dielectrica mare (aprox. 80), micsoreaza fortele de atractie dintre sarcinile
de semn opus de la suprafata moleculelor proteice. Adaugand treptat un solvent organic cu
constanta dielectrica mai mica decat cea a apei, constanta dielectrica a mediului scade, forta de
atractie dintre moleculele proteice creste in mod corespunzator, acestea se agrega prin
interactii electrostatice si precipita din solutie.
In cazul particular al unui amestec de mai multe specii moleculare proteice diferite, care
prezinta o incarcare electrica si o distributie a sarcinilor la suprafata structurilor tridimensionale
distincte, precipitarea lor se va realiza diferentiat la diferite constante dielectrice ale mediului si
deci la diferite concentratii procentuale ale solventului organic utilizat. Deci, crescand treptat
concentratia solventului organic in amestecul proteic multicomponent, proteinele vor precipita
pe rand, fiind posibila separarea lor. Daca sarcina electrica a doua proteine este similara, ele
vor precipita la aceeasi concentratie de solvent si deci nu va fi posibila separarea lor. In aceasta
situatie, prin modificarea pH-ului sau/si a tariei ionice a mediului se pot realiza diferentieri in
sarcina electrica globala a proteinelor din amestec si deci precipitari fractionate.
Actiunea precipitanta a solventilor organici este realizata nu numai prin scaderea
constantei dielectrice a mediului, ci si datorita efectul lor deshidratant asupra moleculelor
proteice.

Reactivi:
- lichid de fermentatie continand lipaza, obtinut prin filtrarea mediului integral de
fermentatie cu Yarrowia lipolytica
- acetona p.a / alcool etilic

Mod de lucru:
100 ml lichid de fermentatie se introduc intr-un pahar Erlenmeyer de 250 ml si se racesc
la +40C. Cand se atinge temperatura data, se incepe adaugarea a 300 ml acetona sau alcool
etilic, prin picurare, sub agitare. Dupa adaugarea intregii cantitati de solvent, suspensia se
mentine static, timp de 2 ore, la rece, pentru perfectarea precipitarii. Suspensiile cu enzima
precipitata sunt separate prin centrifugare la 4.000 rpm, 15 minute. Sedimentul se spala cu
solvent si se recentrifugheaza la 4.000 rpm, 15 minute, dupa care se reia intr-un volum minim de
solutie de CaCl2 0,6% si se analizeaza din punctul de vedere al concentratiei proteice si al
activitatii enzimatice.

12