UNIVERSITATEA DE TIINE AGRONOMICE I MEDICIN VETERINAR

Transferul genelor prin intermediul vectorilor biologici

Toma Rodica Elena

Bucureti, 2013

Transferul genelor prin intermediul vectorilor biologici se realizeaza prin:

sistemul Agrobacterium;

infiltrarea sub vacuum;

virusurile.

Transformarea mediat de

Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens

Evenimentele n care sunt implicate bacteriile

Perceperea semnalelor moleculare emise de celulele rnite Inducerea expresiei genelor de virulen Procesarea catenei T de la nivelul plasmidei Ti Exportul catenei T i al proteinelor de virulen (VIR) n celulele vegetale

 Ataarea bacteriilor Transferul catenei T i al proteinelor VIR Transportul i direcionarea complexului T, prin citoplasm, spre nucleu Integrarea ADN T n nucleu

Metoda
Imersia materialului vegetal ntr-o suspensie bacterian Cocultura pe medii artificiale in vitro
Transferul pe medii cu antibiotice pentru eliminarea bacteriilor i selecia celulelor transformate

Transformarea mediat de Agrobacterium asistat de sonicare (SAAT)

Durata sonicrii este controlat de un timer (cronometru) digital electronic Poate fi folosit orice timer atta timp ct poate fi programat la 0.1 secunde.

Factorii care favorizeaz transformarea

Virulena tulpinilor bacteriene Virulena poate fi stimulat prin utilizarea acetosiringonei, a unor compui nrudii sau prin rnirea prealabil a esuturilor vegetale ce trebuie inoculate (ultrasunete, infiltrare, sonicare) Sensibilitatea esutului vegetal la inoculare Genotipul plantei La monocotiledonate au fost folosite plasmide supervirulente cu mai multe copii ale genelor VIR

Transformare in planta
La Arabidopsis, pentru transformarea
eficient cu Agrobacterium a fost folosit infiltrarea vacuum i imersia floral Factorii cei mai importani au fost sntatea plantelor i stadiul de dezvoltare al florilor

Florile plantelor de Arabidopsis sntoase au fost introduse ntr-o suspensie de bacterii coninut ntr-o pung de plastic. Prin presarea uoar a prilor laterale ale pungii cu o mn, bacteria a fost distribuit pe toat planta, inclusiv pe lstarii florali foarte tineri Plantele au fost scoase din pung dup zece secunde i pstrate n condiii de iluminare redus i umiditate mare.

Plantele de Arabidopsis folosite pentru transformare prin imersia florilor

Seminele recoltate la maturitate au fost semnate, iar plantele transgenice au fost selecionate prin stropire cu erbicidul BASTA 0.1% Plantele au fost stropite la o sptmn dup rsrire i, apoi, la interval de dou zile, de nc patru ori Plantele transgenice au continuat creterea dup aplicarea erbicidului n timp ce plantele netransformate au murit dup dou sptmni

Plantele care supravieuiesc dup dou sptmni de selecie cu BASTA

Organogeneza PMG de cpun in Bioreactoare cu Imersie Temporar. A: Vasul TIB (RITA, Cirad, France) are dou compartimente . n partea inferioar se afl mediul, iar n partea superioar, pe un suport de polysulfone foam, este amplasat materialul vegetal B: Bioreactoarele n camera de cultur conectate la sistemul automat de introducere a aerului sub presiune Aerul sub presiune mpinge mediul imersionnd materialul vegetal. Presiunea se scade printr-un alt filtru din capacul containerului, simultan aerisindu-se i containerul.

Transformarea mediat de virusuri

Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, n ciuda numeroaselor eforturi experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Dei, n 1984 a fost posibil transferul unei gene de rezistena la antibiotic cu ajutorul unui virus ADN (Brisson i colab., 1984), cercetrile ulterioare au demonstrat c genomul viral nu poate accepta i transfera fragmente mai lungi de ADN strin.

 Descoperirea faptului c virusurile ARN pot genera ADNc prin transcripie invers a generat sperena c, mult mai numeroasele virusuri ARN ar putea fi utilizate ca vectori de gene pentru celula vegetal. Din pcate, ns, s-au ntmpinat alte dificulti. ADNc viral nu se integreaz n genomul vegetal iar meristemele, principala surs de celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai rar utilizai n experimentele de transformare genetic a plantelor.

Va multumesc!