DETERMINAREA CONINUTULUI TOTAL DE ANTOCIANI METODA PRIN VARIAIE DE PH Principiul metodei n mediul acid, exist un echilibru ntre formele

colorate i formele incolore ale antocianilor. Acest echilibru este n funcie de pH. Variaia intensitii colorante ntre dou valori de pH este proporional cu coninutul de antociani. Se alege pH = 0,6 i pH = 3,5. Prin aceast variaie, funcia fenolic nu este afectat i se admite c ceilali compui fenolici (taninuri) de asemeni nu intrefereaz cu determinarea. Aparatur i materiale - spectrofotometru care s permit citiri la 520 nm; - cuve de sticl de 5 i 10 mm; - baloane cotate de 50 i 100 cm3; - vase conice de 50 i 100 mL, - pipete gradate i cotate de 1; 2; 5 i 10 ml; - hrtie de filtru. Reactivi - soluie cu pH = 0,6 (soluie de HCl 2 % (v/v) - 20 mL HCl conc. se dizolv n 1000 mL ap distilat); - soluie tampon cu pH = 3,5 (tampon citrat-fosfat) preparat astfel: ntr-un balon cotat de 1000 mL se introduc: 151 mL soluie de fosfat disodic 0,2 M (71,7 g/L Na2HPO4 12 H20 sau 53,65g/L Na2HP04 7H20); 349 mL soluie de acid citric 0,1 M (19,21 g/L C6H8O7). Se amestec i se completeaz la semn cu ap distilat. - soluie alcoolic de 0,1 % HCl (0,1 mL HCl concentrat se amestec cu 100 mL alcool etilic de 96 % vol (v/v)). Modul de lucru n dou vase conice de 100 mL se introduc: - -n vasul 1 ce constituie proba: 1 mL vin, 1 mL soluie alcoolic de 0,1 % HCl, 1.0 mL soluie cu pH = 0,6 (soluie de HCl 2 % (v/v)).

-1-

- -n vasul 2 ce constituie martorul: 1 mL vin, 1 mL soluie alcoolic de 0,1 % HCl, 10 mL soluie tampon cu pH = 3,5. Se msoar absorbana (densitatea optic) la 520 nm att pentru proba ct i pentru martor cu o cuv de sticl de 10 nm (l cm) traseu optic n comparaie cu ap distilat. Observaii: 1. Pentru deblocarea antocianilor din combinaiile cu bioxidul de sulf se procedeaz astfel: - se prepar o soluie alcoolic de acetaldehid 10 % (10 mL acetaldehid c.p. se amestec cu 90 mL alcool etilic de 96 % vol (v/v)) care se las n repaos timp de 1 or; - la 20 mL vin de analizat se adaug 3 mL soluie alcoolic de acetaldehid 10 % i se las n repaos 20 minute; - se preleveaz pentru analiz cte 1 mL de vin tratat ca mai sus, iar valoarea absorbanelor citite la spectrofotometru se nmulete cu raportul de diluie 1,15. 2. Pentru vinurile foarte colorate, se va lucra cu cuve de 2 sau 5 mm, traseu optic. 3. Pentru a se evita erorile de analiz trebuie ca absorbanele citite s aib valori cuprinse ntre 0,3 i 0,8. Calculul i exprimarea rezultatelor Exprimarea coninutului de antociani n mg/L se face cu ajutorul metodei curbei de etalonare trasat pe baza datelor prezentate n tabelul 2. Datele din tabelul 1 se nscriu ntr-un sistem de dou axe coordonate astfel (figura 2): - n abscis coninutul de antociani n mg/L; - n ordonat (coordonat) diferena dintre absorbanele (A520 prob - A520 martor) corespunztoare fiecrei concentraii de antociani. Unind punctele coorespunztoare fiecrei perechi de date se obine curba de etalonare care este o dreapt care trece prin originea axelor coordonate.

-2-

Ecuaia acestei drepte este descris de ecuaia de gradul I de forma: y = 386,15 x - 1,3713 n care: y - coninutul de antociani, mg/L; x - valoarea diferenei de absorbant. (A520 prob - A 520 martor). Prin raportarea diferenei de absorban(A520 prob -A520 martor) la curba de etalonare se obine coninutul de antociani, n mg/L. Exemplu:
A520 (prob) 0.082 0.163 0.234 0.543 0.867 1.200 A520 (martor) 0.021 0.037 0.051 0.108 0.173 0.230 Diferen A520 prob A520 martor 0.061 0.126 0.183 0.435 0.694 0.970 Antociani, mg/L 25 50 73 170 270 375

Tabelul 1 - Coninutul de antociani n funcie de diferena de absorban (A520 prob - A520 martor)

Antociani, mg/L

Figura 2 Coninutul de antociani n funcie de diferena de absorban(A520 prob A520 martor)