Rdicali liberi și antioxidanți în

sisteme vii

Seminar, UnAȘM, 13 noiembrie 2014

Molecula de oxigen

Molecula de oxigen (numită şi

dioxigen) conţine în învelișul
exterior doi electroni impari cu
spinii paraleli, care se află pe
diferite orbitale. Astfel, dioxigenul
prin esenţa sa este un biradical şi,
ca orice alt radical, este foarte
reactiv, dar datorită faptului că
spinii electronilor impari au
orientare opusă, viteza de
interacţiune a O2 cu moleculele
organice este foarte mică.
 Radicalii liberi

Radicalul este o particulă (atom ori moleculă), care conţine în stratul

electronic extern electroni impari.
Fiind chimic foarte activi, radicalii tind să acapareze electronul lipsă de
la moleculele din jur, sau să se debaraseze de electronul impar, cedându-l
altor molecule.
 Denumirea unor radicali şi molecule reactive
în conformitate cu recomandările Comisiei pentru
Nomenclatură în Chimia Anorganică (1990)

Formula chimică Formula de Denumirea

structură radicalului/moleculei reactive
O·- ·O- Оxil (1-),
О2 ·ОО· Dioxigen
О2·- ·ОО- Dioxil (1-), superoxid
O
O3 /\ Trioxigen, ozon
O--O
O3·- ·OOO- Тrioxil (1-), ozonid
HO· HO· sau ·OH Hidroxil
HO2· HOO· Hidrodioxil
Н202 HOOH Peroxid de hidrogen
RO· RO· Alcoxil
C2H5O· CH3CH2O· Etoxil
R02· ROO· Alchildioxil
RO2H ROOH Alchilhidroperoxid
 Apariţia diferitor forme reactive de oxigen în
rezultatul obţinerii energiei sau în rezultatul reducerii
incomplete a moleculei O2 până la apă

hν H+
1O
2 HO2 •

Oxigen singlet Hidroperoxil Peroxid de hidrogen Hidroxil

 FORMAREA RADICALILOR LIBERI
Formarea radicalului dintr-o moleculă stabilă este determinată de apariţia pe
orbitala de valenţă a unui nou electron, sau din contra, ruperea unui electron din
perechea de pe orbitala de valenţă. Aceste procese de obicei au loc în cadrul reacţiilor
de oxidare sau reducere monoelectronică. De regulă, în această reacţie, de rând cu
molecula din care se formează radicalul, participă un ion al unui metal cu valenţă
variabilă (de ex. Cu, Fe, Mn, Co), care serveşte în calitate de donor sau acceptor pentru
un electron.

Reacția Haber-Weiss Reacția Fenton

Мe(n-1)+ + H2О2 → Men+ + HO- + НО•
О2•- + H2О2 → О2 + HO- + НО• О2•- + Меn+ → Мe(n-1)+ + О2
 Radicalul superoxid
Posedă o înaltă abilitate de a penetra
membranele biologice

Este generat în reacții de interacțiune a

oxigenului molecular cu flavinele,
chinonele, tiolii, proteinele Fe-S-
componente; reacțiilor catalizate de
enzimele flavoproteice; în procesul de
fotosinteză, reacțiile căreia sunt prioritar
de transfer monoelectronic.

Atacă preferențial proteinele, în special cele, ce conțin clustere fier-sulf, cum sunt
aconitaza, succinatdehidrogenaza, NADH-ubichinon oxidoreductaza.
Toxicitatea radicalului superoxid crește considerabil în condiții de aciditate crescută,
când se creează condiții pentru protonarea lui și formarea radicalului hidroxil.

În condiții de normalitate fiziologică superoxid radicalul asigură imunității nespecifică și

protecția antimicrobiană.
 Radicalul semichinonic

Chinonă Radicalul anion al

Hidrochinonă Radicalul cation al chinonei
hidrochinonei

Radicalul neutru semichinonic Radicalul neutru semichinonic

În cadrul ciclului acizilor tricarbonici are loc producerea formelor reduse ale piridin
nucleotidelor NADH şi NADPH. Electronii de la aceste molecule sunt transmişi prin
intermediul lanţului respirator moleculei de oxigen. Unul din transportorii de electroni
al acestui lanţ este ubichinona (coenzima Q). În procesul de oxidare monoelectronică
(sau reducere monoelectronică) a formelor apare semiubichinona (•QH).
În mod normal radicalul semiubichinonic este doar un transportor de electroni, iar în
condiţii de deteriorare a lanţului acesta poate deveni sursă de formare a unor radicali
mai puţin inofensivi, aşa ca radicalul superoxid şi hidroxil.
 Radicalul oxidului nitric •NO este un radical
de dimensiuni mici,
generat de sintaza
specfică a oxidului
nitric (NOS), care
metabolizează
arginina în citrulină
cu formarea
radicalului oxidului
nitric .
Funcţie de transducţie de
semnal în neurotransmisie,
reglarea presiunii fluxului
sangvin, relaxarea muşchilor
netezi, reglarea imună ş.a.

Ca rezultat al interacțiunii radicalului NO cu cel superoxidic se formează anionul

peroxinitrit (ONOO-) - un agent oxidant foarte activ, care poate cauza fragmentarea ADN-ului
şi oxidarea lipidelor. NO• + O2•−→ ONOO−

Nivelul de toxicitate a raducalului oxidului nitric este dereminată în special de posibilitatea

acestuia de a reacţiona cu radicalul superoxid.
 RADICALII PRIMARI ŞI SECUNDARI

Radicalul Structura Sistema enzimatică Funcţia biologică

de formare a
radicalului
Radicali primari
Superoxil ·ОО- NADPH - oxidaza Protecţie
antimicrobiană
Nitroxil ·NО NO-sintaza Factor de relaxare a
vaselor
Semiubichinonele: HQ· Lanţul transportor Transportori de
coenzima Q, de electroni electroni
flavosemichinonele
Radicali secundari
Radicalul Structura Reacția de formare
Hidroxil ·OH Fe2+ +HOH Fe3+ + HO- +·OH
Fe2+ +ClO- Fe3+ + Cl- +·OH
Radicali lipidici LO· Fe2+ +LOOH Fe3+ + HO- +LO·
L· LO· +LH LH +L·
LOO· L· +O2 LOO·
 RADICALII SECUNDARI

Din radicalul primar О2•-, precum şi în

rezultatul altor reacţii, în care în mod obligator
participă un radical ori molecula de oxigen, are loc
formarea compuşilor moleculari activi –
moleculelor reactive: peroxidului de hidrogen,
hipoclorurilor, peroxizilor lipidelor și
peroxinitritului caracterizaţi prin reactivitate
pronunţată.
Moleculele reactive, inclusiv hipoclorurile,
formează radicali în rezultatul interacţiunii cu ionii
metalelor cu valenţă variabilă, în primul rând cu
ionii fierului bivalent. Radicalii formaţi în
rezultatul interacţiunii moleculelor reactive cu
ionii metalelor cu valenţa variabilă sunt numiţi
radicali secundari (tabelul 2). La această categorie
se referă radicalul hidroxil şi radicalii lipidici.

Spre deosebire de radicalii primari, pentru cei secundari în prezent nu sunt cunoscute
careva funcţii fiziologicice, iar formarea lor nu are loc cu participarea sistemelor
enzimatice celulare. Radicalii secundari au acţiune distructivă asupra structurilor
celulare şi sunt consideraţi „radicali dăunători”. Anume formarea radicalilor
secundari, şi nu a radicalilor în general, duce la apariţia stărilor patologice
 Radicalul hidroxil
Radicalul hidroxil este una din cele mai reactive
specii de oxigen şi cel mai implicat în generarea
stresului oxidativ. Formarea radicalului hidroxil în
celulele vii are loc în special în rezultatul reducerii
peroxidului de hidrogen în prezenţa unui metal cu
valenţa variabilă. Timpul de înjumătăţire t1/2 a
radicalului hidroxil in vivo este de aproximativ 10s,
ceea ce în ansamblu cu reactivitatea lui înaltă, îl
plasează în categoria celor mai periculoşi agenţi,
formaţi în organism.

Spre deosebire de radicalul superoxid, care este neutralizat prin activitatea

superoxiddismutazei, în celula vie nu există enzime, care ar realiza procesul de
neutralizare a •OH. Unica salvare a celulei de acţiunea nocivă a radicalului hidroxil
este concentraţia înaltă a antioxidanţilor cu masa molecular joasă, cum ar fi
glutationul. Odată format, radicalul •OH interacţionează imediat cu orice moleculă
oxidabilă care se află în apropiata vecinătate. Astfel, radicalul hidroxil este capabil să
oxideze hidraţii de carbon, acizii nucleici, lipidele şi aminoacizii.
 Radicalii lipidici
În rezultatul reacţiei în lanţ de
oxidare a lipidelor are loc
formarea hidroperoxizilor
acizilor graşi polinesaturaţi,
heterogeni din punct de vedere
chimic. Această grupă, numită în
literatura de specialitate cu
termenul „Radicali ai lipidelor”
constă din>
Radicalii alchil (L•),
Radicalii alcoxil (LO•),
Radicalii dioxil (LOO•).

Radicalul alchil se formează în rezultatul ruperii atomului de hidrogen de la molecula

acidului gras polinesaturat şi prezintă de fapt, din punct de vedere chimic, un radical al
carbonului. La interacţiunea alchilului cu oxigenul molecular are loc formarea radicalului
dioxil, care după structura sa şi parţial după proprietăţi, este asemănător cu radicalul
superoxil. Radicalii alcoxili ai lipidelor se formează în rezultatul reducerii monoelectronice a
hidroperoxizilor cu participarea ionilor metalici, de exemplu ai Fe2+. Acest tip de radical
este omolog radicalului hidroxil.
 Activitatea prooxidantă a metalelor de tranziţie

Formarea radicalilor alchil în reacţia directă cu grăsimile şi uleiurile

Fe3+ + RH Fe2+ + R  +H +

Descompunerea hidroperoxidului cu formarea radicalilor peroxil şi alcoxil

Fe3+ + ROOH Fe2+ + ROO  + H +
Fe2+ + ROOH Fe3+ + RO  + OH -

Activarea oxigenului molecular şi formarea oxigenului singlet

Fe2+ + O2 Fe3+ + O 2- 1
O2
Site-urile de formare a speciilor reactive de
oxygen în celulele plantelor
Site-urile de producere a SRO și enzimele, ce le
neutralizează (în albastru)
 ROLUL BIOLOGIC AL SPECIILOR REACTIVE ALE OXIGENULUI

Specii Reactive ale oxigenului

Efecte benefice Efecte destructive
Semnalizarea intracelulară Peroxidarea lipidelor
(mesageri secundari)
Protecţia contra invaziile microbiene Deteriorarea oxidativă a proteinelor
(reacţia de hipersensibilitate)
Implicarea în mecanismele de Inducerea mutaţiilor în structura
reglare intracelulară ADN
Implicarea în dezvoltarea Activarea factorilor ce duc la
embrionară moartea celulară
 Suntem gata de a respinge atacul prooxidanților?

O-2, 1O2, .OH, H2O2,

Antioxidant
Cu, Fe. R•, RO•, ROO •
Prooxidant Jail

R•, RO•,
ROO•,
1O ,
2 O-2,
-OH, H2O2,
Cu, Fe
 Antioxidanții
Principalele componente ale sistemului de
protecție contra radicalilor liberi sunt
antioxidanții. Inițial acest termen a fost
introdus pentru a specifica substanțele,
care sunt capabile de a inhiba reacțiile de
oxidare radicalică din contul substituirii
atomului de hidrogen al lor cu cel de
oxigen al radicalilor liberi.

Ulterior semnificația acestui termen a fost extinsă considerabil, mai ales în domeniul
biologiei. Conform concepției moderne categoria de antioxidanți include sistemele de
detoxicare, cum ar fi de exemplu sistemul de eliminare a compușilor deteriorați în
rezultatul oxidării lor spontane. Astfel, în această categorie se înscriu substanțele
capabile să preîntâmpine formarea speciilor reactive de oxigen, să neutralizeze
radicalii liberi, precum și să asigure protecția eficientă a structurilor biologice.
 Clasificarea antioxidanților în baza
activității catalitice
În prezent cel mai des antioxidanții sunt divizați în baza activității lor catalitice, formând
două categorii:
antioxidanții enzimatici și
nonenzimatici .

Antioxidanții enzimatici se caracterizează printr-o specificitate înaltă, iar acțiunea lor

este orientată contra unei anumite forme de SRO, prin specificitate de localizare în țesut,
organ, celulă și prin prezența unui metal în componența moleculei cu funcție de catalizator. În
calitate de astfel de metale de obicei apare cuprul, fierul, zincul, manganul și selenul.
Reprezentanții tipici al acestui grup sunt superoxid dismutaza (SOD), catalaza (CT),
glutation peroxidaza (GPO), glutation reductaza, toate enzimele ciclului ascorbat-glutationic,
precum și transferazele.

Sitemul nonenzimatic de protecție antioxidantă este reprezentat prin astfel de

antioxidanți ca carotenul, acidul ascorbic, glutationul redus (GSH), α- tocoferolul
flavonoidele, precum și alți compuși.
 Clasificarea antioxidanților în baza
masei lor moleculare
În mai multe lucrări de specialitate se întâlnește divizarea substanțelor
antioxidante în baza masei lor moleculare. în baza acestei clasificări se disting două
grupuri de antioxidanți:
antioxidanți cu masa moleculară mare și
antioxidanți cu masa moleculară mică.

Din prima categorie fac parte antioxidanții enzimatici și proteinele ce leagă

ionii metalici Fe2+ și Cu2+, care catalizează procesele radicalice (SOD, ceruloplazmina,
catalaza, enzimele ciclului glutationic, albumine, feritine, lactoferina, metalotioneinele
ș.a.).

Cea de-a doua categorie de antioxidanți este reprezentată prin aminoacizi,

poliamine, GSH, AA, α-tocoferol, vitaminele A, K, P și alte substanțe, caracterizate prin
masă moleculară joasă și proprietăți antioxidante.
 Clasificarea antioxidanților după
mecanismul de acțiune al lor
”Eliminatori” – care purifică celulele și spațiile
intercelulare prin eliminarea radicalilor liberi în special prin
reacții de reducere a acestora până la produse inofensive
stabile.
”Capcane” – antioxidanți care manifestă afinitate sporită
față de anumiți radicali ori molecule reactive.
”Antioxidanți ce rup lanțul oxidării radicalice”.
Moleculele acestor substanțe sunt mai active comparativ cu
radicalii lor. Un exemplu elocvent de astfel de antioxidant sunt
fenolii, care cedează ușor electronii săi, transformând radicalii
liberi în produse moleculare. În rezultatul acestei reacții
fenolii, la rândul lor se transformă în radicali inactivi,
incapabili de a se implica în reacțiile de oxidare în lanț.
 Clasificarea antioxidanților după
mecanismul de acțiune al lor
”Enzime eliminatoare de SRO” (SOD, catalaza, peroxidaza
ș.a.).
”Enzime de detoxicare lipidică” (glutation S-transferaza,
fosfolipid hidroperoxid glutation peroxidaza, ascorbat
peroxidaza)
”Antioxidanți cu masa moleculară joasă” (acidul ascorbic,
glutationul redus GSH, compușii fenolici, tocoferolii ș.a.).
”Compuși care regenerează formele active ale
antioxidanților” (monodehidroascorbat reductaza,
dehidroascorbat reductaza, glutation reductaza ș.a.).
 Clasificarea antioxidanților după
acțiunea lor directă ori indirectă

Antioxidanții cu acțiune indirectă sunt capabili de a suprima oxidarea radicalică

doar în sistemele biologice, iar acțiunea lor nu poate fi depistată in vitro. Aceste substanțe
activează prin activarea (reactivarea) enzimelor antioxidante, suprimarea reacțiilor cu
formare de specii reactive de oxigen, reorientarea procesului de oxidare radicalică spre
formarea componenților mai puțin toxici, inducerea selectivă a genelor ce codează
componentele sistemului de protecție antioxidantă și celor de înlăturare a daunelor
produse, normalizarea metabolizmului ș.a.

Antioxidanții cu acțiune directă se manifestă atât în sistemele biologice,cât și în cele

artificiale, iar activitatea lor este determinată de prezența anumitor grupuri funcționale în
structură.
 Clasificarea antioxidanților cu acțiune
directă
Donori de protoni. Din această categorie fac parte compușii, care au în componența moleculei
atomi mobili de hidrogen, care pot elimina cu ușurință radicalii liberi prezenți în sistem. Donori de
protoni sunt fenolii (tocoferolii, derivații fenolului și naftolului, flavonoizilor, catehinele ș.a),
compușii heterociclici azotați (melatonina, derivații 1,4-dihidropiridinei, derivații pirolopirimidinei),
tiolii (GSH, cisteina, homocisteina, N-aceticisteina, acidul dihidrolipoic)
Poliene. Compuși cu mai multe legături nesaturate, care fiind ușor oxidabili, concurează pentru
radicali și specii reactive cu alte molecule biologice, protejându-le pe acestea contra oxidării.
principiul acțiunii lor constă în utilizarea legăturilor duble în calitate de site-uri de legare a radicalilor.
Cei mai reprezentativi antioxidanți din acest grup sunt retinoizii (retinalul, acidul retinoic, retinolul și
esterii lui) și carotenoizii (carotenul, licopina, zeaxantina, violoxantina, astaxantina ș.a.).
Catalizatori. Compuși capabili de a cataliza reaxțiile de eliminare a SRO fără formarea unior
noi radicali liberi. Acești compuși se mai numesc și enzime mimetice. Spre deosebire de alte enzime,
acestea acșionează la concentrații extrem de mici. Reprezentați tipici ai acestui grup sunt SOD și
GPO.
Capcane de radicali. Compuși ce reacționează cu radicalii liberi formând compuși cu nivel
scăzut de reactivitate. Reprezentanți tipici sunt substanțele nitronice, care leagă eficient superoxidul
și radicalul hidroxil.
Chelatori. Compuși ce inhibă reacțiile SRO dependente de metale prin legarea metalelor cu
valența variabilă.
 Clasificarea substanţelor antioxidante
• Hidrosolubili acidul ascorbic
acidul citric citozol
aminoacizii
fenolii

• Liposolubili fosfolipidele
tocoferolul membrană
carotenoizii
AGPE
 Clasificarea sistemelor de protecție antioxidantă
First group
Prevention of ROS genera
tion (inactivation and neu
tralization of potential
prooxidants )
O2 depositing: CoQH2
oxidase, cytochrome
oxidase, and other
terminal oxidases with a
high affinity for Oxygen
Transition metal chelates:
ferritin, transferring, albu
mins, metallothioneins,
and others
Xenobiotic neutralization:
GST, GSH, etc.
Second group Third group Fourth group
Primary defense systems Secondary defense Damage removal and
( ROS neutralization and systems (synthesis and detoxification (reparation
break of free radical reparation of AO, or hydrolysis
chain ) electron donors, and of damaged molecules,
substrated for neutralization of
High molecular weight antioxidant enzymes ) secondary metabolites)
compounds: enzymes
and Fecontaining High molecular weight Damage removal: enzy-
proteins (SOD, catalase, compounds: glutamate mes of DNA reparation,
peroxdases, GST, reductase, ascorbate degradation of lipids,
peroxiredoxins, etc.) reductase, MDAR, proteins, etc. (endonucle-
thio-redoxins, thiore- ses, exonucleases, liga-
Low molecular weight doxin reductase, gluta- ses, proteases, peptida-
compounds; GSH, AA, thione reductase, γ- ses, phospholipases,and
tocopherol, lipoic acid, glutamylcysteine synt- others)
ubiquinone, phenol hetase, glucose-6phos-
derivatives, carotenoids, phate dehydrogenase, Secondary metabolite
etc etc. neutralization : GST, GSH,
Low molecular weight glucuronyltransferase,
compounds: AA, GSH, sulfo and acetyltransfe-
etc. rases, quinone reductase,
formaldehyde dehydro-
genase, glyoxylase, etc.
 Kinds of Antioxidants

Natural antioxidants:
1.Tocopherols (delta>gamma>beta>alpha)
2.Nordihydroguaretic Acid (NDGA)
3.Sesamol
4.Gossypol

Synthetic antioxidants:
1.Butylated Hydroxy Anisole (BHA)
2.Butylated Hydroxy Toluene (BHT)
3.Propyl Gallate (PG)
4.Tertiary Butyl Hydroquinone (TBHQ)
Reaction of antioxidants with radicals

R + AH RH + A

RO  + AH ROH + A

ROO  + AH ROOH + A 

R  + A RA

RO  + A ROA

ROO  + A ROOA

Antioxidant + O 2 Oxidized Antioxidant

Compararea antioxidanţilor după modul de administrare

Antioxidanţii alimente Antioxidanţii in formule

Realizarea incompletă accesibilitate Substanţă pură pentru realizare completă

Doze variate Doze uniforme
Interacţiune alimentară Interacţiune minimală cu alimentele
Influenţa pH Influenţa pH minimală

Absorbţie limitată absorbţia Absorbţia îmbunătățită

Degradare metabolică Reducerea degradării metabolice

Metabolismul normal rapid care omite metabolismul Reducerea căilor metabolice

uneori metabolizarea ingredientelor
funcţionale structurale

Eliminare rapidă eliminare Întocmirea formulelor pentru menţinerea

prelungită în organism

Răspuns insuficient răspunsul Răspuns îmbunătăţit şi eficacitate rezultată din

eliminarea lentă
 Factorii determinați în selectarea metodelor

• Actualitatea şi potenţialul de aplicare

• Utilizarea surselor de radicali biologic relevanţi
• Simplitatea
• Definirea conform mecanismului chimic
• Utilaj accesibil şi acceptabil
• Repetabilitate
• Posibilitatea de adaptare în dependenţă de natura
antioxidantului
• Adaptabilitatea pentru transformarea în analize de
rutină
• Modalitatea de stabilire a valorilor de evaluare
Clasificarea metodelor de determinare a capacităţii
antioxidante

Cu utilizarea radicalilor specifici organismelor biologice

 Antioxidant activity in linoleic acid emulsion system
 Superoxide anion (O2˙) radical scavenging activity
 Hydroxyl (OH˙) radical scavenging activity
 H2O2 scavenging activity
 NO˙ scavenging activity

Cu utilizarea radicalilor non-organici

(reacţii de transfer de hidrogen sau electron)
Reducerea radicalului DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil
Reducerea (ABTS +˙) 2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
Reacţia de reducere a reagentului fosfomolibdenic
Reducerea reagentului Folin-Ciocalteu
 Testul antioxidant ABTS
(2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),
mecanismul reacției donor de electron

 % Inhibiţie =(Abst=0 - Abst=60 min)/Abst=0 * 100,

 IC 50

 Echivalent acid ascorbic, trolox/m(g, mg, 100g) biomasei, substanței

uscate
Reducerea radicalului ABTS de către antioxidanți în diferite concentrații

α-tocoferol
Caemferol Acid ascorbic

Glutation Acid uric

Cianidină

Trolox
Suc orange

Roberta Re,, et al. ANTIOXIDANT ACTIVITY APPLYING AN

IMPROVED ABTS RADICAL CATION DECOLORIZATION ASSAY,
Free Radical Biology & Medicine, Vol. 26, Nos. 9/10,
pp. 1231-1237, 1999
 Cinetica reacției de reducere a radicalului ABTS
Roberta Re,, et al. ANTIOXIDANT ACTIVITY APPLYING AN IMPROVED ABTS RADICAL CATION DECOLORIZATION ASSAY,
Free Radical Biology & Medicine, Vol. 26, Nos. 9/10, pp. 1231-1237, 1999

(A) Quercetin ♦ luteolin ■; kaempferol A; naringenin +;

(B) delphinidin ♦; cyanidin ■; malvidin ▲;
(C) ascorbic acid ♦; a-tocopherol ■;
(D) ferulic acid ♦; p-coumaric acid ■; caffeic acid A.
 Testul antioxidant ABTS

Avantaje/Dezavantaje

Testul este simplu și rapid și este utilizat intens pe scară largă în

screeningul biomasei vegetale, precum și pentru determinarea calității
antioxidative a produselor alimentare. Are cost redus, radicalul este stabil,
solubil în solvenți organici polari și nepolari.
Timpul unificat de determinare a activității antioxidante și absorbanța stabilită
face posibilă aplicarea testului ABTS pentru compararea datelor obținute în
diferite laboratoare.

• Prepararea radicalului este de durată.

•Mulți compuși fenolici au potențialul redox mic și pot reacționa astfel cu ABTS.
Reacția TEAC poate dura o lungă perioadă de timp pentru a ajunge la un final,
folosind timpul redus de 6 min valorile testului TEAC sunt reduse
•Van den Berg et al. a concluzionat că "evaluarea cantitativă a capacității
antioxidante folosind TEAC poate fi supărătoare sau chiar imposibilă, dar poate fi
folosit pentru a furniza date despre conținutul de antioxidanți".
 Testul antioxidant ABTS
ABTS˙+ radical este generat prin oxidarea ABTS (2,2 azinobis 3-etilbenzotiazoline-6-sulfonic acid) cu persulfat de potasiu.
Se prepară soluţia stoc a reagentul ABTS de 7 mM în apă deionizată.
Persulfatul de potasiu se adăugă în concentraţia de 2,45 mM.
Pentru aceasta se prepară:
Soluţia matrice ABTS 7mM: 192 mg ABTS la 50 ml H2O;
Persulfat de potasiu K2S2O8 2,45 mM: 33 mg la 50 ml H2O.
Reagenţii se amestecă în proporţii de 1:1 pentru formarea radicalului ABTS.
Reacţia de formare a radicalului ABTS˙+ decurge la întuneric, la T camerei cel puţin timp de 12-16 ore.

Soluţia de lucru a ABTS se prepară din soluţia matrice de ABTS˙+ ,

care se dizolvă în etanol sau apă distilată până la stabilizarea absorbanţei de 0,700 ± 0,020 la 734 nm.

Amestecul reagent constă din 0,3 ml soluţie etanolică extract antioxidant şi 2,7 ml soluţie ABTS˙+,
(sau 0,1 antioxidant + 3,0 ml ABTS).
Reacţia de decolorare decurge la temperatura camerei timp de 6 minute, iar procentul de inhibiţie se calculează
conform ecuaţiei: % Inhibiţie =(Abst=0 - Abst=6 min)/Abst=0 * 100,

unde Abst=0min este valoarea extincţiei de 0,700 ± 0,020 la 734 nm a soluţiei ABTS˙+ ,
Abst=6 min este valoarea extincţiei după incubare.

Valoarea coeficientului TEAC (trolox equivalent antioxidant activity) este exprimată în mM Trolox/g(mg) substanţă
activă, utilizând curba de calibrare pentru Trolox.
Intervalul liniar pentru curba de calibrare este de 20 - 1000 μM Trolox (r2 = 0,9976).
 Corelarea dintre conținutul carotenului și activitatea antioxidantă (testul ABTS, % inhibiție) a
extractelor etanolice din biomasa celulelor verzi de Haematococcus, pe durata fazei mobile a ciclului vital

Corelarea dintre conținutul de caroten (abs) și activitatea antioxidantă (ABTS, % inhibiție) a

extractelor etanolice din biomasa Haematococcus pluvialis, faza celulelor verzi mobile
Corelarea dintre conținutul de astaxantină (abs) și activitatea antioxidantă (ABTS,
% inhibiție) a extractelor etanolice din biomasa Haematococcus pluvialis, faza de
ciști roșii, cultivată în prezența compușilor Co(II) cu bazele Schiff, 20, 30 mg/l
 Reducerea radicalului DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), mecanismul reacției donor de
hidrogen

2: Diphenylpicrylhydrazine (nonradical)
1: Diphenylpicrylhydrazyl (free radical)

DPPH* + AH ~ DPPH-H + A *
DPPH* + R * ~ DPPH-R  % Inhibiţie =(Abst=0 - Abst=60 min)/Abst=0 * 100,

 IC 50

 Echivalent acid ascorbic, trolox/m(g, mg, 100g) biomasei, substanței

uscate

W. Brand-Williams, M. E. Cuvelier and C. Berset. Use of a Free

Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity, Lebensm.-Wiss.
Technol., 28.25-30 (1995)
 Cele mai reprezentative publicații de aplicare a testului DPPH în determinarea
activității antioxidante

References
DPPH (µM)
22.5 Mimica-Dukic et al. (2004)
50.0 Karioti et al. (2004)
80.0 Eklund et al. (2005)
100.0 Chen et al. (2005, 2007), Govindarajan et al. (2003), Kano et al., Tepe et al (2005), Saito et al. (2004)
250.0 Alma et al. (2003) and Kim et al. (2004)

Reaction medium
Ethanol Kano et al. (2005), Karioti et al. (2004), and Mimura et al. (2005)
Methanol Alma et al. (2003), Eklund et al. (2005), Govindarajan et al. (2003), Mimica-Dukic et al. (2004)
Methanol buffered (pH 5.5) Chen et al. (2005)
Ethanol buffered (pH 3.0) Takebayashi, Tai, Gohda, and Yamamoto (2006)

Incubation time (min)

5 Govindarajan et al. (2003)
20 Karioti et al. (2004), Mimura, Yazaki, Sawaki, Ozawa, and Kawaguchi (2005)
30 Alma et al. (2003) and Kim et al. (2004)
60 Karioti et al. (2004) and Mimica-Dukic et al. (2004)

IC50 of ascorbic acid

9.84 (56 µM) Kano et al. (2005)
110.77 (629 µM) Ricci et al. (2005)

IC50 of BHT
5.4 (25µM) Mimica-Dukic et al. (2004)
19.8 (90 µM) Sokmen et al. (2004)
86.6 (393 µM) Ricci et al. (2005)
Om P. Sharma, Tej K. Bhat. DPPH antioxidant assay
revisited, Food chemistry, 113, 2009: 1-1205
 Variantele utilizate de preparare a radicalului DPPH

Reducerea radicalului DPPH (soluție metanol și

Absorbanța la 517 nm a radicalului DPPH, preparat în
metanol/tampon) de acidul ascorbic (1,0 µM),
etanol, metanol și metanol/tampon

Om P. Sharma, Tej K. Bhat. DPPH antioxidant assay

revisited, Food chemistry, 113, 2009: 1-1205
Valorile testului DPPH depind de:
•Tipul și concentrația solventului aplicat pentru antioxidant: acetatul de etil și
volumul mare a amestecului reactant încetinesc cinetica reacției, urme de clor
accelerează cinetica reacției;

•Valorile activității antioxidante sporesc în mediul hidric și se reduc în prezența

metalelor;

•Concentrația ionilor de hidrogen încetinește cinetica reacției

DPPH/antioxidant
 Efectul de sinergism ale amestecului de licopen, vitamina E, vitamina C și
β-caroten în reducerea radicalului DPPH

Cinetica curbei de reducere a radicalului DPPH (% inhibiție) de antioxidanții în concentrațiile 5-15 mM/L tocoferol,
0,03-1,16 mM/L acid ascorbic; 5,21-15,63 mM/L licopen; 2,17-10,8 mM/L β-caroten

Donghong Liu, et al. The scavenging capacity and synergistic effects of lycopene, vitamin E, vitamin C,
and b-carotene mixtures on the DPPH free radical, LWT 41 (2008) 1344-1349
 Testul antioxidant DPPH

Avantaje/Dezavantaje

Testul este simplu și rapid și are nevoie doar de un spectrofotometru

UV-VIS pentru a efectua, care, probabil, explică utilizarea sa pe scară largă în
de screeningul antioxidanților. Are cost redus, radicalul este stabil, solubil în
solvenți organici polari și nepolari

•Interpretarea este complicată atunci când compușii testați au spectre care se

suprapun la 515-520 nm.
•DPPH în calitate de radical este un oxidant;
•Culoarea se poate pierde din cauza culorii antioxidantului;
•Diapazonul de linearitate este redus;
•Inaccesibilitatea sterică reduce din acuratețea gradului de repetabilitate.
 Testul antioxidant DPPH
Prepararea reagentului: 2,4 mg DPPH (6µM) se dizolvă în 100 ml etanol (1 ml metanol + 99 ml etanol).
DPPH solubil hexan, acetonă
Solubilizarea este anevoioasă şi se efectuează cu utilizarea agitatorului magnetic.
Se obţine soluţia DPPH cu absorbanţa de 0,62-0,66.

Amestecul reactant constă din 0,3 ml soluţie etanolică extract antioxidant şi 2,7 ml soluţie DPPH˙
(sau 0,1 antioxidant + 3,0 ml DPPH).
Probele se amestecă bine prin agitare şi se astupă cu dop.
Incubarea se petrece la întuneric la temperatura camerei, timp de 5-60 minute.
Incubarea peste 60 minute este inutilă.
Absorbanţa se măsoară la lungimile 515- 517 nm (maximul înregistrat).
În calitate de probe blank se utilizează etanolul în care este solubilizat 0,3 ml extract antioxidant,
în concentraţia corespunzătoare, pentru a exclude componenta color a probelor propriu-zise.

Calcului valorilor antioxidante (% inhibiție, IC 50 sau echivalent)

Valorile comparative ale reacțiilor de reducere a radicalilor
liberi
 Evaluarea activității antioxidante totale prin metoda reducerii reagentului
fosfomolibdenic

(NH4)2MoO4 + Na3PO4 + H2SO4 → (NH4)3PMo12O40↓ + (NH)2SO4 + Na2SO4 + H2O

verde-albastru

echivalent acid ascorbic/tocoferol (g,mg, M, mM, nM)/

/m (g,mg) biomasă, substanța activă

Calibrarea reducerii reagentului fosfomolibdenic

Pilar Prieto, Manuel Pineda, and Miguel Aguilar. Spectrophotometric Quantitation of

Antioxidant Capacity through the Formation of a Phosphomolybdenum Complex: Specific
Application to the Determination of Vitamin E. Analytical Biochemistry 269, 337-341
(1999)
 Evaluarea activității antioxidante totale prin metoda reducerii reagentului
fosfomolibdenic

0 1 2 3

Time (h)

Formarea complexului fosfomolibdenic în prezența

tocoferolului la 25°C (O), 37°C (•), și 95°C (□).
Absorbanța la 695 nm
Formarea complexului fosfomolibdenic în prezența
α-tocopherol (•), ascorbic acid (O), glutation redus (▼), BHT
(◊) în concentrația de 5 mM. 37°C (A) ; 95°C (B)
 Evaluarea activității antioxidante totale prin metoda reducerii reagentului
fosfomolibdenic

Avantaje/Dezavantaje

Activitatea antioxidantă a probei se determină indirect, spectrofotometric, în

baza reacţiei de oxido-reducere cu reducerea Mo(VI) în Mo(V) cu formarea
complexului albastru fosfat/Mo(V) şi are la bază transferul de electroni produs în
mediul acid. Utilitatea metodei date constă în posibilitatea testării antioxidanţilor
solubilizaţi în solvenţi foarte variaţi, cu grad diferit de polaritate.

•Durata testului de 95 min;

•Temperatura ridicată;
•Mediul acid
 Evaluarea activității antioxidante totale prin metoda reducerii reagentului
fosfomolibdenic

Reagentul fosfomolibdenic se prepară reieşind din următoarea compoziţie:

0,6 M acid sulfuric, 28 mM sodiu fosfat şi 4 mM amoniu molibdat
Pentru aceasta se prepară soluţiile hidrice cu molaritatea corespunzătoare a acidului şi a sărurilor.

Pentru 500 ml reagent se prepară:

• H2SO4 0,6M: 33 ml acid 94,6% la 100 ml H2O;
• Na3PO4 28 mM: 1,148 g la 100 ml H2O;
• (NH4)6Mo7O24 · H2O 4mM: 1,236 g la 100 ml H2O

Amestecul reagent se formează prin amestecarea după cum urmează:

Sol amoniu molibdat cu sol H2SO4, la care se adaugă fosfatul de sodiu. Volumul se aduce cu apă la 500 ml. Se
obţine soluţie transtarentă lipsită de careva sediment. Termen de valabilitate nelimitat.

Mersul lucrării: La 0,3 ml soluţie etanolică extract antioxidant se adaugă 2,7 ml soluţie reagent
fosfomolibdenic, sau 0,1 la 3 ml
0
Amestecurile se incubează la 95 C timp de 90 min. După răcirea probelor până la temperatura camerei, se
măsoară extincţia lor la 695 nm
În calitate de control negativ se utilizează solventul.
Capacitatea antioxidantă se exprimă în echivalent acid ascorbic la 1 mg substanţă activă.

Curba de calibrare pentru acidul ascorbic este liniară în intervalul 1 - 6 mg/ml, n=8, r2=0,999.
Evaluarea activității antioxidante (fenolilor) prin metoda reducerii reagentului Folin-
Ciocalteu

echivalent acid galic (g,mg, M, mM, nM)/

/m (g,mg) biomasă, substanța activă
Evaluarea activității antioxidante (fenolilor) prin metoda reducerii reagentului Folin-
Ciocalteu

Măsuri și condiții obligatorii pentru a obține date fiabile și

previzibile

(1) raport adecvat volum de reactiv alcalin și reagent F-C,

(2) timpul de reacție optime pentru dezvoltarea culorii,
(3) temperatura de reacție optime pentru dezvoltarea culorii
(4) monitorizarea densitate optică la 765 nm și
(5) utilizarea acidului galic ca referință standardul-fenol
Evaluarea activității antioxidante (fenolilor) prin metoda reducerii reagentului Folin-
Ciocalteu

Avantaje/Dezavantaje

Metoda F-C este simplă și poate fi utilă în caracterizarea și standardizarea

probelor de origine vegetală cu condiția adaptării variațiilor menționate anterior.

•Se va ține cont de substanțe care interferează [în special zaharuri, amine aromatice,
dioxidul de sulf, acidul ascorbic, organici, Fe (II)] și substanțele organice adiționale
care reacționează cu reactivul F-C: adenină, adenozină, alanina, anilina, acidul
aminobenzoic, benzaldehida, cisteina, citozină, dimetilanilina, difenilamină, EDTA,
guanina, glicina, histamina, histidina, indol, metilamina, acidul nitriloacetic, acid oleic,
phenylthiourea, proteine​​, piridoxină, zaharoză,acidul sulfanilic, tiouree, timină,
timidina, trimetilamina, triptofan, uracil, acidul uric, și xantina.
Evaluarea activității antioxidante (fenolilor) prin metoda reducerii reagentului Folin-
Ciocalteu

Metoda are la bază transferul de electroni produs în mediul alcalin cu reducerea complexului
acid fosfomolibdenic/fosfovolframic cu formarea cromogenului care se determină colorimetric

Se prepară:
• Soluţia de lucru a reagentului Folin-Ciocalteu prin diluarea lui de 10 ori cu apă bidistilată;
• Sol NaHCO3: 750 mg la 100 ml H2O.

Mersul lucrării: La extractele antioxidante (0,3 ml) se adăugă 1,5 ml reagent Folin-Ciocalteu (diluat
de 10 ori cu) şi 1,2 ml carbonat de sodiu.
Amestecurile se agită şi se incubează timp de X min la Y0C.
Solventul (etanolul, apa) se adaugă în proba de control.
După răcirea probelor se măsoară extincţia la 760 nm.

Capacitatea antioxidantă se exprimă în echivalent acid galic la 1 mg substanţă activă,

sau g biomasă.
Curba de calibrare pentru acidul galic este lineară în intervalul 0,01-0,1 mg/ml (n=6, r2=0,999).

Singleton V.L., Rossi J.A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-

phosphotungstic acid reagent. In: American Journal of Enology and Viticulture,
1965, v. 16, p. 144-158.
Magalhaes M., et al. Methodological aspects about in vitro evaluation of
antioxidant properties. In: Analytica chimica acta, 2008, v. 613, p. 1–19.
Valorile comparative ale reacțiilor de oxido-reducere