UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE GR. T.

POPA IAȘI

PROGRAMUL DE MASTERAT: BIOTEHNOLOGII MEDICALE ȘI BIOMATERIALE

AVANSATE

ACIDUL HIALURONIC
 CUPRINS :

1. Structura, obtinerea si proprietăţile acidului hialuronic

2. Obținere
3. Proprietățile soluției de HA
4. Importanță și aplicații
5. Biodegradarea HA
6. Degradarea enzimatică
7. Metoda de degradare și modificare a HA
8. Degradarea cu ultrasunete
9. Degradare termică în funcțiede pH

10.Reacții de modificare a HA

11.Depolimerizarea hialuronatului de sodium în fază eterogenă

12.Concluzii

13.Bibliografie
 1.Structura, obtinerea si proprietăţile acidului hialuronic

Structura Acidul hialuronic este o polizaharidă descoperita de Karl Meyer şi J.W. Palmer
în 1934. Aceasta polizaharidă este compusă prin repetarea unor unităţi dizaharidice, acidul
D-glucuronic β(1,3) şi N-acetil-D-glucozamin legate prin legături glicozidiceβ(1,4) (figura 1),
care pot fi între 200 – 20 000 unităţi glicozidice.

Masa sa moleculară poate să ajungă până la 10 7 g·mol -1 .În soluţie, moleculele de HA

formează o “reţea” continuă, foarte hidratată, posedând proprietăţi reologice, de rezistenţă, de
presiune osmotică si de excluziune. Aşadar, HA este o polizaharidă cu masă moleculară mare,
făcând parte din marea familie de polimeri numită glicozoaminoglicani (GAG).

GAG sunt molecule polizaharidice neramificate formate din unităţi dizaharidice repetitive
care au pe suprafata lor numeroase sarcini negative date de radicalii sulfat şi carboxil. O unitate
repetitivă este formata dintr-un glucid aminat (N-acetil-galactozamina sau N-acetil-
glucozamina) si un acid uronic.

Sarcinile negative au urmatoarele roluri:

• Atrag ionii de Na + care vor atrage la rândul lor apa şi se va realiza structura de gel
puternic hidratat.

• Sarcinile negative se resping între ele si prin urmare, moleculele de GAG ocupă un volum
mare în raport cu greutatea lor moleculara. În spaţii se va găsi faza lichida a gelului, fapt care
permite mobilitatea celulelor, proliferarea şi nutriţia lor. Marea majoritate a GAG, cu exceptia
acidului hialuronic, se leagă covalent de miezuri proteice, formând proteoglicani.
 Clasificarea GAG se face in 5 clase, în funcţie de tipul unităţii repetitive, numărul de grupări
sulfat şi localizarea lor.

1. Acidul hialuronic (hialuronan), format din acid glucuronic si N-acetil-glucozamina. Este

singurul nesulfatat, deci sarcinile sale negative vor proveni doar de la gruparile carboxil.

2. Dermatan sulfatul, format din acid iduronic si N-acetil-galactozamina

3. Heparina (heparan sulfatul), format din acid iduronic si N-acetil-glucozamina

4. Condroitin sulfatul, format din acid glucuronic si N-acetil-galactozamina

5. Keratan sulfatul este o exceptie, el fiind format din galactoza si N-acetil-glucozamina.

Conformaţia zaharidelor individuale din HA este un factor de asemenea important

contribuind la forma generală a macromoleculei. Acidul glucuronic siN-acetilglucozamina din
macromolecula de HA apar predominant în forma scaun. Aceasta limiteaza flexibilitatea lanţului
zaharidic care 2 este o trăsătură comună a familiei de polimeri GAG. În funcţie de aceste
constrângeri , HA poate avea în soluţie pe lângă segmentele de catenă rigide şi segmente foarte
flexibile. HA este un polimer natural compus din unităţi dizaharidice ale acidului glucuronic si N-
acetilglucozamina. Masa moleculară a HA nativ este de obicei de ordinul milioanelor. Fiecare
unitate dizaharidică a HA conţine trei poziţii posibile pentru modificare: o grupa hidroxilică, una
carboxilică şi alta acetamidică.

Hialuronanul se găseşte în matricele extracelulare ale ţesuturilor vertebratelor, în

general, în asociaţie cu proteinele, dar cu precădere în lichidul sinovial, umoarea vitroasă a
ochilor şi in cordonul ombilical. Rolul său a fost considerat înainte doar acela de a umple spaţiile
intracelulare, datorită capacităţii sale de a reţine apa, însă în prezent este stabilit faptul că HA
intervine în numeroase procese biologice fundamentale cum ar fi: reproducerea, adeziunea,
diferenţierea celulară şi inflamaţiile. El este în aceeaşi măsură cunoscut atât pentru
proprietăţile fizico-chimice cât şi a celor biologice, proprietăţi ce depind puternic de lungimea
lanţului polimeric. Astfel că, în funcţie de lungimea lanţului de HA, proprietăţile acestuia pot fi
chiar antagoniste.
 2.Obţinerea

Acidul hialuronicpoatefi obţinut, prin extracţie din diverse ţesuturi animale, cum ar fi
creasta de cocoş, cordonul ombilical, umoarea vitroasă a ochiului, fermentaţii bacteriene având
ca sursă familia Streptococcus. În ambele cazuri el trebuie purificat.

HA obţinut prin aceste procedee posedă o masă moleculară foarte mare care îi conferă o
vâscozitate ridicată. Studiile recente pe oligozaharide HA în complex cu HA degradat enzimatic
au arătat că şi lanţurile scurte de HA pot fi stabilizate într-o varietate de conformaţii pentru a se
lega de proteine. Aceste observaţii conduc la ipoteze cum că proteinele pot acţiona pentru
organizarea HA, fixând şi favorizând anumiţi conformeri ai polimerului, ducând la formarea
unor structuri bine ordonate cu funcţionalităţi specifice. Acest lucru este ilustrat în figura 2
unde trei populaţii distincte de HA sunt vizibile pe o singură celula a muşchiului neted. Acestea
includ fâşii de HA pe suprafaţa celulară, care sunt asociate cu receptori de HA tip CD44, dar şi
fire lungi de HA. Pe suprafaţa celulei se mai găsesc şi baghete de HA care sunt imunoreactive.
Interesant este faptul că leucocitele mononucleare aderă la firele de HA (prin receptorii de tip
CD44 de pe suprafaţa celulei) dar nu se asociază cu fâşiile sau fibrele de HA, astfel indicându-se
existenţa unor populaţii de HA diferite din punct de vedere structural şi funcţional.
 3.Proprietăţile soluţiei de HA

Proprietăţile HA sunt greu de determinat cu ajutorul metodelor clasice în care au fost

dezvoltate analize simple pentru proteine şi care cer proprietăţi apropiate de soluţiile ideale
Newtoniene. Comportamentul acidului hialuronic nu se apropie nici pe de parte de “idealul”
Newtonian. Sandy Ogston, Torvard Laurent, Endre Balazs şi mai târziu Bob Cleland au elaborat
teorii şi structuri experimentale care stau la baza cercetării proprietăţilor biofizice ale HA. În
soluţie apoasă HA este descris ca un ghem statistic cu o rigiditate intrinsecă considerabilă.
Această rezistenţă a fost atribuită legăturilor de hidrogen intramoleculare de-a lungul a două
legături glicozidice. S-a arătat ca solventul şi lungimea lanţului joacă un rol important în
formarea legăturilor de hidrogen.

Metoda FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) este o metodă puternică de

determinare a proprietăţilor soluţiilor concentrate de polimeri, cum ar fi HA, de asemenea este
şi o metodă de echilibru care se aplica soluţiilor fără gradient de concentraţie, în absenţa
curgerii şi fortelor de forfecare.
Există cativa factori care pot contribui la proprietătile solutiei de HA, cum ar fi:

1. interacţiunileelectrostatice dintre grupele carboxilice;

2. legăturile de hidrogen dintrezaharideleadiacente;

3. domeniul de suprapunereşi încalcirea polimerului;

4. asocierea lanţ-lanţ prin mecanisme ce au la baza interacţiuni hidrofobe.

S-a arătat ca metoda FRAP permite calculul concentraţiilor soluţiilor de HA peste

concentraţia critică la care are loc suprapunerea lanţurilor macromoleculare. Deci, această
metodă este potrivită studiilor de încalcire şi asociere lanţ-lanţ. Deoarece proprietăţile
reologice şi 4 hidrodinamice ale soluţiei depind de efectele electrostatice şi ionice ale reţelei
de HA, s-a studiat sensibilitatea acestora in funcţie de tipul şi valenţa contraionului.
Influenţa legăturilor de hidrogen a fost studiată prin compararea proprietăţilor soluţiilor în
apa deionizată, 0,5 M NaCl si 0,5 M NaOH. S-a arătat ca electrolitul a ecranat interacţiunile
electrostatice iar ioni HO - au influenţat rigiditatea lanţurilor de HA.

Prezenţa asocierilor lanţ-lanţ, care poate implica interacţiuni hidrofobe, a fost studiată
în condiţii fiziologice, în solvenţi cu polaritate diferită.Asocierile intermoleculare lanţ-lanţ au
fost deasemenea studiate prin folosirea de oligozaharide HA ca şi compusi competitori (cu
masa moleculară mică).
4.Importanţă şi aplicaţii
Există o familie de enzime numite Hialuronidaze (HA-ze), care sunt capabile să
hidrolizeze HA după diverse mecanisme. O importanţă deosebită a cuplului HA/HA-ze a
fost demonstrată în unele boli, ca artrita reumatică, dar mai alesîn cancer. În decursul
timpului, HA a făcut posibile diverse aplicaţii în domeniul medical, farmaceutic şi
cosmetic.
Datorită proprietăţilor fizico-chimice unice, el este folosit pentru aplicaţii ca
lubrefianţi (pentru articulaţii şi oftalmologie), pentru construirea de biomateriale pentru
ingineria ţesuturilor, pentru elaborarea de dispozitive cu eliberare controlată a
principiilor active si pentru fabricarea de produse cosmetice de înfrumuseţare cu
proprietăţi de hidratare a pielii.

Aplicaţii posibile ale HA nemodificat

 Oftalmologie:Picăturile apoase de pus în ochi au dezavantajul că mai mult de
75% din soluţia aplicată se pierde prin drenaj în primele 2 minute. De aceea se adaugă
polimeri soluţiei cu rolul de a mări vâscozitatea si de a creste astfel timpul de stationare
al medicamentului.
Gurny si colaboratorii au aratat ca solutiile de HA au capacitatea unica de a
prelungi timpul de stationare al pilocarpinei in apropierea precorneei. Acestia au
sugerat ca HA interactioneaza direct cu membrana celulara a tesutului corneal.

Eliberarea controlată de medicamente :În unele experimente s-a observat ca

HA marcat izotopic s-a deplasat din fluidul sinovial în nodulii limfatici. După injectarea
intravenoasă în şoarece a unei cantităţi mari de HA marcat s-a observat ca după un timp
HA se găseşte în nodulii limfatici. Această observaţie a arătat potenţialul HA de a fi
folosit ca purtător de medicamente prin sistemul limfatic către locul ţintă pentru
tratarea diferitelor tumori maligne.

Dermatologie:Datorita permeabilităţii slabe si naturii lipofilice a pielii umane,

foarte puţine medicamente pot fi livrate transdermal pentru atingerea nivelelor
terapeutice în piele. În ultimii ani s-au obţinut rezultate promiţătoare în tratamentul
artritei şi cancerului de piele cu ajutorul unor medicamente pe bază de
HA.Rezultatefoarte bune obţinându-seîn cazul diclofenacului.

Chirurgie: Prevenţia formării postoperatorii a adeziunilor este o problemă mereu

actuală. S-a arătat că soluţiile de HA reduc adeziunile după chirurgia abdominală şi
ortopedică. Mitchell şi colaboratorii au arătat că adeziunile pericardice postoperatorii
sunt mult diminuate dacă se administrează animalului o solutie de 0,4% HA in timpul
pericardiotomiei. Mecanismul real prin care soluţiile de HA previn formarea adeziunii
este încă necunoscut.

Implanturi:Bioincompatibilitatea unor implanturi mamare, cum ar fi gelurile

siliconice, a dus la căutarea de noi alternative. Lin şi colaboratorii au studiat posibilitatea
folosirii HA ca material de umplere. S-a arătat că implanturile pe bază de HA au aceeaşi
consistenţă ca gelurile siliconice, dar permit o mai bună vizualizare a structurii sânului în
jurul implantului. După primul an de la implantare în animal nu s-a observat nici o
reacţie adversă.

Viscosuplimentarea reprezintă o tehnică relativ recentă şi constă în injectarea

unui lichid conţinând acid hialuronic în articulaţia genunchiului. Acidul hialuronic
reprezintă o substanţă naturală, componentă a lichidului sinovial (lichidul care se
găseşte în articulaţie) şi care are efect de lubrefiere, pentru a permite extremităţilor
oaselor să alunece una pe cealalată, absoarbind şocurile transmise în articulaţie prin
încărcare.

5.Biodegradarea acidului hialuronic

Biodegradarea acidului hialuronic este un process treptat. În spaţiul extracelular

a majorităţii ţesuturilor se găseşte HA cu masă moleculară mare.Împreună cu alte
structuri macomoleculare HA contribuie la proprietăţile mecanice ale reţelei. Prin
urmare, pentru a fi eliberat din această reţea solidă, polimerul trebuie să fie cel puţin
parţial degradat prin mecanisme mediate de receptori sau prin endocitoză. În
compartimentul lizozomal, acidul hialuronic este hidrolizat la oligozaharide de către
hialuronidazele intracelulare, fragementele fiind în cele din urmă degradate la
monozaharide de către exo-glucozidazele aflate în lizozomi. În ţesuturile tari, cum ar fi
osul sau cartilajul, cu sau fără drenaj limfatic, HA este degradat "in situ", împreună cu
alte molecule ECM (colagen şi proteoglacani). În pielii şi articulaţii, doar o fracţiune
minoră (aproximativ 20-30%) de HA este stocat şi degradat în ţesuturi Aproximativ 50%
din HA din organism se găseşte în ţesuturile pielii.
 6.Degradarea enzimatică
Cea mai importantă degradare a HA în mediul biologic este catalizată de
enzimele numite „hialuronidaze” sau „liaze”. Conform mecanismului de degradare,
hialuronidazele sunt împărţite în trei categorii:
(1) hialuronat-4-glicanohidrolaze, care hidrolizează legăturile -N-acetil-
glucozaminice;
(2) hialuronat-3-glicanohidrolaze;
(3) hialuronat-liaze. Asemănător hidrolizei acide, HA este hidrolizat enzimatic de
către hialuronidaze printr-un mecanism statistic dedegradare.
 Degradarea enzimatică a hialuronanului are loc de obicei în soluţie tampon de
acetat de sodiu la care se adaugă acid acetic pentru a se obţine un pH ≈ 4,8-6,0, unde
majoritatea acestor enzime sunt active. Temperatura de degradare este de obicei 37 oC.
Degradarea prin metode non-enzimatice În ciuda faptului că HA este un compus stabil în
condiţii normale, scindarea lanţurilor de polimer se pot face şi prin intermediul unor
metode non-enzimatice fie prin reacţii cimice dar şi prin metode fizice în condiţii critice
precum: uscarea prin congelare; forfecare ; amestecare, agitare
Celulele formează specii reactive de oxigen (ROS) ca o consecinţă a respiraţiei
anaerobe normale. Răspunzători de scindarea lanţului polimeric al acidului hialuronic
sunt doar cateva dintre aceste specii precum:
•anioni superoxid -radical liber de oxigen care are un electron in plus, fiind
foarte reactiv si toxic;
•radicalul hidroxil - acest radical are un electron nepereche în orbita sa
electronică cea mai îndepărtată, care se uneşte cu alţi electroni, formând legături
chimice;
•ion hipoclorit est ClO - ;
•specii derivate din peroxinitriţi.
Aceste specii reactive de oxigen sunt implicate în câteva procese
biodegenerative şi inflamatorii precum artrita. Depolimerizarea acidului hialuronic în
fluidul sinovial în timpul debutului precoce al artritei este considerat a fi cauzată de ROS
şi nu de hialuronidază. Fluidul sinovial normal estevâscoelastic datorită prezinţei deHA
de masa moleculară mare.Sinoviocitele secretă continuu macromolecule în fluidul
sinovial, inclusiv HA. Fluidul este împins în afara cavităţii articulaţei în microcapilare
integrate în sinoviu, pe măsură ce presiunea creşte. Pe această cale moleculele de HA
ies prin pori interstiţiali de drenaj în căptuşeala sinovială (garnitura articulară de 30 – 90
nm), scăzând motilitatea asemenea moleculelor de HA mai mici (Fig. 5).
 7.Metode de degradare şi modificare a HA

HA poate fi degradat la fragmente mai mici prin: metode chimice (condiţii acide sau
alcaline), fizice (agitare cu viteză mare, forfecare), sonicare, clivaj radicalic ,
enzimatice.
Clivajul radicalic al HA are o mare importanţă în artrită şi îmbătrânire. S-a arătat că
radicalii hidroxil sunt factorul esenţial în iniţierea degradării HA prin scindarea legăturii
glicozidice. Cu cât concentraţia în radicali liberi este mai mare cu atât scăderea masei
moleculare a HA este mai mare.

8.Degradarea cu ultrasunete
Soluţiile de HA sunt degradate de ultrasunete. Mecanismul şi cinetica degradării nu
sunt încă pe deplin cunoscute. S-a observat o relaţie liniară între inversul pătratului Mw
şi timpul de reacţie. Sonicarea degradează HA într-un mod nestatistic, care duce la o
distribuţie bimodală a masei moleculare medii gravimetrice. S-a sugerat că lanţurile mari
de HA sunt degradate mai lent decât cele mici. S-a ajuns la concluzia că oricare ar fi
energia ultrasunetelor, lanţurile de HA nu pot fi degradate la monomeri. În urma
procesului de degradare cu ultrasunete se obţin lanţuri cu masă moleculară mai mare de
10 kDa.
 9.Degradarea termică şi în funcţie de pH
Prin metoda difuziei luminii s-a arătat că soluţiile de HA se degradează statistic atât
în mediu acid cât şi în mediu bazic. La pH alcalin legăturile de hidrogen care stau la baza
organizării structurale a lanţurilor de HA sunt distruse, ceea ce duce la pierderea
rigidităţii intrinseci şi formarea unui ghem mai compact şi mai flexibil. S-a arătat că
vâscozitatea hialuronatului de sodiu, chiar şi în apă distilată, scade în funcţie de timp si
exponenţial în funcţie de temperatură. În procesul de uscare prin îngheţare a HA s-a
observat depolimerizarea radicalică a probei. La temperaturi înalte în prezenţa tiolilor
sau metalelor tranziţionale, HA se degradează datorită radicalilor reactivi hidroxil.
Degradarea HA în prezenţa ionului Fe 2+ se bazează pe procesul de oxidare în prezenţa
oxigenului şi a Fe 2+ , proces în care se generează anionul-radical superoxid, O2●− .

Ca agent reducator, O2●− regenerează Fe 2+ , iar agentul oxidant H2O2 este

produs în reacţia cu un hidroperoxid (HO2● )

10.Reacţii chimice de modificare a HA

Hilanii

Derivaţii reticulati ai HA sunt denumiţi hilani. Laurent şi colaboratorii au folosit

1,2,3,4- diepoxibutan pentru reticularea lanţurilor de HA. O metodă generală de
reticulare a HA se bazează pe reacţia dintre formaldehida (sau alţi agenti, cum ar fi
dimetilureea, etilenoxid, poliaziridina sau poliizocianat) şi HA la pH neutru, care
implică grupele hidroxil ale polizaharidei şi grupele aminice ale proteinei. Legăturile
dintre proteină şi HA sunt demonstrate de comportamentul de jeleu al soluţiei. În
condiţii favorabile, două până la opt lanţuri de HA sunt conectate. Masa moleculară
a hilanilor obţinuţi prin această metodă variază între 8 x 10 6 si 24 x 10 6 kDa, iar
conţinutul de proteină este de 0,4-0,8%.

Alţi derivaţi de HA

De asemenea au fost studiaţi şi derivaţi nereticulaţi ai HA.Pentru sinteza esterilor

carboxilici ai HA s-a propus reacţia dintre sărurile cuaternare de amoniu a HA şi
agenţi de alchilare în solvenţi aprotici.Gradul de esterificare variază între 0 si 100%.
Esterii HA sunt insolubili în apă, iar proprietăţile fizico-chimice diferă de ale HA
srcinal. HA poate fi modificat cu polimeri sintetici, cum ar fi poliuretanii,
polielefinele, poli(alcoolul vinilic), polimeri acrilici, poliamide, poliesteri si
polisiloxani.
 11.Depolimerizarea hialuronatului de sodiu în fază eterogenă
În ultimii ani creşte fără încetare cererea pentru lanţuri de HA de mărimi foarte
variate, în funcţie de aplicaţia urmărită dar care sunt inferioare HA-ului obţinut prin
fermentaţie bacteriană. Pentru a obţine lanţuri de HA de mărimi dorite, se va folosi o
reducere controlată a mărimii HA bacterian. Pentru aceasta se pot folosi numeroase
procedee: metode enzimatice, metode chimice şi metode fizice. Datorită specificităţii
ridicate ale enzimelor, metodele enzimatice prezintă avantajul de a nu provoca alterarea
structurii chimice a polimerului.Enzimele utilizate sunt de srcine animală.Studiului
constă în exploatarea posibilităţilor folosirii metodelor chimice şi/sau fizice pentru
obţinerea HA de mărimi dorite (Mw < 50 kDa), cu o slabă polimolecularitate şi mai ales,
cu o structură chimică nealterată.
Datorită proprietăţilor vâsco-elastice, HA-ul de mărime mare este utilizat în special
în aplicaţiile vâscozometrice. Două criterii importante în acest domeniu sunt
biodegradabilitatea slabă a HA-ului şi o vâscozitate a produsului compatibilă cu modul
de utilizare al acestuia, spre exemplu, injectarea produsului cu o
seringă.Biodegradabilitatea HA-ului este în general diminuată în funcţie de modificarea
chimică a acestuia. Totuşi, utilizarea acestui tip de produs duce la introducerea în
organism a unui compus care nu este în totalitate natural iar vâscozitatea HA-ului
modificat chimic nu este cu mult mai mică decât a celui nemodificat.

12.Concluzii
Metabolizarea HA-ului este dinamică.
Unele celule, precum condrocitele sintetizează şi catbolizează HA astfel încât să menţină o
concentraţie constantă în organism. Alte celule, de exemplu, celulele cutanate, sintetizează HA
mai mult decât catabolizează.
Hialuronidaza şi ROS pot depolimeriza HA+ul suficient de mult pentru a putea fi eliberat din
matricea extracelulară. Apoi, acesta este fie imediat absorbit în celule şi degradat de lizozomi fie
este transferat în sistemul limfatic şi condus spre ficat, glande limfatice sau rinichi spre a fi
catabolizate. Produşi finali de degradare, acidul glucuronic şi N –acetilglucozamina pot
fireutilizaţi pentru biosinteza de HA. În această manieră, acidul hialuronic din organismul uman
este îndepartat metabolic şi înlocuit zilnic.

13.Bibliografie
1. Chemistry and Biology of Hyaluronan, H.G. Garg and C.A. Hales;
2. http://en.wikipedia.org/wiki/Hyaluronan
3. Inhibition of hyaluronidase at high substrate concentration, Trias ASTERIOU, Jean- Claude
VINCENT and Brigitte DESCHREVEL.
4. Studiul depolimerizării hialuronatului de sodiu în fază eterogenă realizat în laboratorul
”Polimeri, Biopolimeri, Suprafeţe” (FRE 3101 CNRS – Universitatea Rouen) de către: Fériel AMAR
– doctorandă în anul doi la Universitatea Rouen, Sanda BUCĂTARIU (ROTAR) – student
Socrates/Erasmus, sub coordonarea ştiinţifică a doamnei profesoare BrigitteDESCHREVEL