Microscopia de fluorescenta

Anumite substante poseda proprietatea de a emite radiatie vizibila in urma

expunerii la UV, proprietatea purtand numele de fluorescenta. Aceste substante
sunt caracterizate de o lungime de unda de excitatie (in UV) si de o lungime de
unda de emisie, (in vizibil), ceea ce face ca tehnica de punere in evidenta a
fenomenului de fluorescenta sa permita si identificarea substantelor studiate,
nu doar semnalarea prezentei acestora.

Cu acest scop se utilizeaza filtre optice si UV pentru selectia radiaţiei de excitaţie

şi de emisie a substanţei care urmează a fi observată. Printre substantele care
poseda aceste proprietati se numara si cele de interes medical, precum acizii
nucleici, proteinele etc.

Pentru a observa o serie de substanţe care nu prezintă fluorescenţă în mod

direct, se utilizează ”markeri de fluorescenţă”. Markerii sunt substanţe care au
următoarele proprietăţi: - fluorescenţă intrinsecă - aditivitate foarte mare -
deteriorează minim structura (substanţa) de care se fixează.

In domeniile biologiei moleculare si biologiei celulare se utilizeaza tehnici de

microscopie de fluorescenta pentru studiul fluorescenţei compuşilor organici şi
anorganici simultan cu absorbţia şi reflexia. Evidentierea si studiul proprietăţii
de fluorescenta are loc în prezenţa unei molecule numite fluorofor: proteina
verde fluorescenta, fluoresceină (proteine fluorescente).

Proba se supune unei lumini de o anumită lungime de undă, radiaţia luminoasă

fiind absorbită de către fluorofor. In urma absorbtiei, acesta emite o radiaţie
luminoasă de lungime de undă diferita de cea absorbita. In componenta unui
astfel de microscop intra pe langa sursa de lumina, oglinda dicroica si filtre (in
diferite combinatii, de excitatie - banda dubla de excitatie, banda tripla de
excitatie, si de emisie).

Principii fizice Fotochimie Fluorescența apare atunci când un electron orbital al

unei molecule, atom sau nanostructură se relaxează la starea de bază prin
emiterea unui foton dintr-o stare de excitare singlet: •Excitație:S0 + hνex → S1
•Fluorescență (emisie): S1 → S0 + hνem + căldura.

O moleculă în S1 se poate relaxa prin diverse căi concurente: -o relaxare non-

radiativă în care energia de excitație este disipată sub formă de căldură (vibrații)
a solventului. -prin conversie într-o stare triplă, care se poate relaxa ulterior prin
fosforescență sau printr-o etapă de relaxare secundară non-radiativă. -
Relaxarea din S1 poate apărea și prin interacțiunea cu o a doua moleculă prin
stingerea fluorescenței. -Oxigenul molecular (O2) stopează extrem de eficient
fluorescența doar datorită stării sale de triplet neobișnuit.

În majoritatea cazurilor, lumina emisă are o lungime de undă mai mare și, prin
urmare, o energie mai mică decât radiația absorbită; acest fenomen este
cunoscut sub numele de deplasarea Stokes.

Cu toate acestea, atunci când radiația electromagnetică absorbită este intensă,

este posibil ca un electron să absoarbă doi fotoni; această absorbție cu două
fotoni poate duce la emisia de radiații având o lungime de undă mai mică decât
radiația absorbită.

Radiația emisă poate fi, de asemenea, de aceeași lungime de undă ca

radiațiaabsorbită,numită „fluorescență de rezonanță”. Moleculele care sunt
excitate prin absorbția luminii sau printr-un proces diferit (de exemplu, ca
produs al unei reacții) pot transfera energia către o a doua moleculă
„sensibilizată”, care este transformată în starea excitată și poatesă
devinăfluorescentă.

Microscopul electronic de transmisie

tunul electronic este sursa electronilor de inalta energie, lentile

electromagnetice, camera in care se introduce preparatul lentila proiector
ecranul pe care se formeaza imaginea.
Principiul MET

Electronii care străbat preparatul sunt deviaţi în funcţie de grosimea şi

densitatea preparatului structurile mai dense vor produce un grad mai mare de
dispersie a electronilor – zone electronodense, mai întunecate structurile mai
subţiri vor permite o treceremai uşoară a electronilor – zone electronoclare

In microscopia electronică de transmisie (TEM), un fascicul de electroni puternic

concentrat este direcționat către un eșantion subțire (<200 nm). Electronii
incarcati cu energie energetica interactioneaza cu atomii din proba care produc
radiatii caracteristice si particule care furnizeaza informatii pentru
caracterizarea materialelor.

Rezoluțiaînaltă, comparativ cu SEM. Informația este obținută atât din electronii

transmiși, cât și din cei deflectați, din electronii secundari și din fotonii
secundari emisi.

Avantajele și dezavantajele TEM

Avantaje: Rezoluție înaltă, pană la 0,2 nm. Imagine directă a rețelei cristaline.
Evidențiază defectele din interiorul eșantionului. Nu este nevoie de un strat de
acoperire metalic, care să fie convenabil pentru imagistica structurată a
materialelor organice. Metoda de difracție electronică: identificarea fazelor,
determinarea structurii și a simetriei, măsurarea parametrilor rețelei,
identificarea defectelor Dezavantaje: Pentru a prepara o mostră transparentă
electronică din masa este dificil (datorită densității, de conductivitatii și a
grosimii probei).

Microscopia Confocala

Microscopia confocală permite generarea de imagini cu rezoluție înaltă și

reconstrucție 3-D a unui specimen.
În microscopia confocală, un fascicul de lumină laser este focalizat pe o epruvetă
fluorescentă. Amestecul de lumină reflectată și emis este capturat de același
obiectiv și este trimis la oglinda. Lumina reflectată este deviat de oglindă în timp
ce lumina fluorescentăemisă trece prin a aperatură confocală (orificiu) pentru a
reduce luminozitatea "fără focalizare". Lumina focalizată apoi trece prin filtrul
de emisie și trece la fotomultiplicator.

Mai multe posibilitati de colorare

Deoarece imaginile sunt detectate de un computer mai degrabă decât de ochi,

este posibil să se detecteze mai multe diferențe de culori.