STRESUL OXIDATIV.

ACTUALITĂŢI ŞI
IMPLICAŢII FIZIO-
PATOLOGICE
• STRESUL OXIDATIV este situaţia rezultată din generarea
intensă de radicali liberi ai oxigenului raportată la
capacitatea sistemelor antioxidante existente la un moment
dat.
• “STATUS OXIDATIV”
(Helmut Sies,1981, 1985 ,1993)
• apare datorită toxicităţii oxigenului
• apare datorită radicalilor liberi în general şi a speciilor
reactive de oxigen în special
 Pierderea homeostaziei cu o producere, în
exces, a speciilor reactive cu oxigen şi/sau
o diminuare a capacităţii antioxidante a
organismului atât prin procese de oxidare,
cât şi prin procese de reducere
Stresul oxidativ reprezintă agresiunea produsă la nivel
molecular prin dezechilibrul balanţei prooxidant/antioxidant în
favoarea primului, dezechilibru manifestat prin consecinţe la nivelul
tuturor organelor şi ţesuturilor. Speciile reactive de oxigen sunt
produse în organismele aerobe în condiţii fiziologice. Aceşti produşi
metabolici intermediari induc modificări patologice doar când nu
mai pot fi contracaraţi de antioxidanţii endogeni.
 Procese
prooxidante =
formatoare de
specii reactive de
oxigen sau/şi alţi
radicali liberi
Procese de apărare
antioxidantă
endogenă (cu care
organismul este
înzestrat)

Helmut Sies (1985)

 DUALITATEA MOLECULEI DE OXIGEN
Viaţa fără oxigen nu există

O2 rol fundamental pentru

metabolismul
energetic şi respiraţie
Toxic

• Organismele superioare tolerează oxigenul datorită sistemelor de

apărare cu care sunt înzestrate, şi îl utilizează pentru producerea
energiei celulare (mitocondria).

VIAŢA , INSASI, ESTE UN PROCES DE

OXIDO-REDUCERE
 OXIDARE ŞI REDUCERE
Oxidarea Reducerea
Este Este
Cedare de electroni Acceptare de electroni

Acceptor de electroni
e-
Xm+ Xm2+
redus e- oxidat
Donor de electroni

Metale redox active (tranziţionale)

(proteine care conţin cupru/ fier)
• Pământul a fost la origine anoxic
• Metabolismul a fost anaerob
• O2 a început să apară în urmă cu ~ 2,5x109 ani

• Metabolismul anaerob – GLICOLIZA

Glucoză + 2ADP + 2Pi Lactat + 2ATP +2H2O

• Metabolismul aerob – O2 acceptorul final de electroni

Glucoză + 6O2 + 36ADP + 36Pi 6CO2 + 36 ATP + 6H2O

OXIGENUL
• În stare fundamentală are 2 electroni nepereche (este un diradical)

• Cei 2 electroni nepereche au spini paraleli

• Molecula de oxigen (O2) are reactivitate minimă (chiar nereactiv)

faţă de majoritatea moleculelor organice care au electroni cu spini
opuşi (apar restricţiile de spin)
• Stare fundamentală de triplet
Este un gaz paramagnetic ; reacţionează
cu moleculele organice numai sub formă
“activată”
 Absorbţia unei energii suficiente pentru a
ACTIVAREA O2 inversa spinul unuia din electronii nepereche
Reducerea monoelectronică (univalentă)

Reducerea univalentă a oxigenului generează metaboliţi

oxigen-reactivi cu o mare toxicitate (cum ar fi, de exemplu .OH)
O2 1O singlet
2
e-

superoxid O2 . - HO2.
H
+
e-

peroxi O22- HO2-- H2O2 peroxid

H+ H+
H+ e-

e-
H2O2 OH . + H2O
H+ hidroxil

Schema reducerii univalente a O 2 si formarea radicalilor

liberi ai oxigenului
Organizarea electronilor pentru fiecare etapă de
activare a oxigenului şi energia de reacţie
 RADICALII LIBERI [
.
X ]
= molecule sau fragmente moleculare care conţin un
electron nepereche În biochimie se preferă termenul
de specii reactive ale
Proprietăţi: oxigenului,

• Conţin unul sau mai mulţi electroni celibatari

• Din punct de vedere electrostatic pot fi neutri sau
încărcaţi +/-
• Posedă o foarte mare reactivitate chimică
(dependentă de concentraţie şi temperatură, pH,
potenţial redox)
• Cei cu structură simplă au o durată de viaţă foarte
scurtă, cei cu structură complexă au o stabilitate mai
mare
 Prooxidanţii

Radicali liberi

orice specie chimică liberă care conţine unul sau mai

mulţi e- nepereche
o moleculă cu un e- nepereche

într-un orbital extern

Specii neradicalice

specii care au un potenţial puternic oxidant

specii care favorizează formarea unor oxidanţi puternici

(ex. metale tranziţionale)

Tipuri de specii oxigen-reactive
Tipuri de specii
azot-reactive
“Longevitatea” speciilor reactive

Specia Timp de înjumătăţire

• Peroxid de hidrogen
• Hidroperoxizi organici ~ minute
• Acid hipocloros
• Radicali peroxil ~ secunde
• Oxid nitric
• Peroxinitrit ~ milisecunde
• Anion superoxid
• Oxigen singlet ~ milisecundă
• Radicali alcoxil
• Radical hidroxil ~ nanosecunde
• Dintre toate speciile oxigen reactive, anionul superoxid (O2•-)
este cel mai bine cunoscut. Acesta are o structură paramagnetică, cu un
singur electron pe orbitalii π* de antilegătură.
• El constituie prima etapă a activării O2 cu donori de un electron
sau cu specii paramagnetice. Este o specie destul de puţin agresivă,
putând servi drept canal de evacuare pentru radicalii intracelulari.
• Anionul superoxid poate determina însă formarea multor
specii reactive, incluzând radicalul hidroxil (HO.), peroxidul
_
de hidrogen
(H2O2), oxigenul singlet (1O2) si peroxinitritul (ONOO ).
 • Sinteză
catalizată de un metal
Radicalul tranziţional
• Alţi reducători
hidroxil pot genera Fe2+(ex.
GSH, ascorbat,
(.OH) hidrochinone)
• Fe2+ este un
oxidant extrem de
reactiv
• Citotoxicitatea
specilor reactive de
oxigen este intens
mediată de ionii de
fier
Specii reactive generatoare de peroxizi
Căi celulare de reducere a oxigenului
 Surse de radicali liberi în
ENDOGENE organism EXOGENE
Lanţul respirator mitocondrial Radiaţii diferite (ultrasunete,
Ozonul microunde...)
Activitatea enzimelor
din reticulul endoplasmic Substanţe poluante din apă, aer, sol
(metabolismul xenobioticelor)
Căldura exagerată

Activitatea enzimelor din fagocite Fumul de ţigară (NO2)

Hiperoxie
Activitatea enzimelor lizozomale
Metabolism Hipoxie
Activitatea enzimelor din peroxizomi O2
Creşterea presiunii O2
Activitatea oxihemoglobinei
Efortul fizic intens
Biosinteza eicosanoizilor
în membrane celulare Pesticide
Infecţii microbiene şi virale
Autooxidarea catecolaminelor
Inflamaţia
Activitatea oxidoreductazelor Ischemia-Reperfuzia
Medicamente
Îmbătrânire Specii reactive de oxigen Droguri

O2 .- . OH H 2 O2

Lezare celulară
Surse endogene de specii reactive de
oxigen
Mieloperoxidaza
Oxidari microzomiale (fagocite)
Flavoproteine, CYP

Xantin oxidaza Reticul endoplasmic

izoformele NOS Lizozomi Metale
Citoplasma tranzitionale
Fe
Cu

Oxidaze
Flavoproteine Peroxizomi Mitocondrie Transport de electroni
(respiratia celulara)

Membrana plasmatica
Lipooxigenaze
Ciclooxigenaza
Prostaglandin sintaza
NADPH oxidaza
 Surse mitocondriale de ROS
LANŢUL RESPIRATOR MITOCONDRIAL: O2 actionează în procesul
central al metabolismului vieții aerobe, ca acceptor final de electroni, fiind redus la
apă. Transferul de electroni la oxigen generează intermediari reactivi.

.-
4H+ + O2 H2O ( ~ 1,5 - 4% din O2 O 2 H2O2)
LANŢUL RESPIRATOR MITOCONDRIAL:
 LANŢUL RESPIRATOR
MITOCONDRIAL:

Viteza de formare a ROS depinde de viteza de

utilizare a oxigenului şi este direct proporţională cu
numărul de mitocondrii din celulă.
 Surse microzomiale de ROS
Citocrom
Biosinteza tirozinei, Substrat
adrenalinei, serotoninei,
melatoninei, acizilor
biliari, hormonilor
steroizi.
Fe-S
proteine
Activarea vitaminelor D,
activarea prolinei, lizinei,
pentru biosinteza
colagenului.
Metabolizarea
xenobioticelor în
vederea eliminării.
Substrat
hidroxilat
Metabolizarea
compuşilor toxici R-OH H2O
endogeni.
 Macrofagul – sursă endogenă de ROS

FAGOCITOZA
• cel mai cunoscut proces
metabolic furnizor de specii
oxigen reactive (SOR) în
organism
• rolul acestora este esenţial în
fagocitoză: ei ucid sau labilizează
structural agentul patogen
Surse membranare de ROS: activitatea enzimelor din
cascada eicosanoizilor

Leucotriene
Surse citoplasmatice de specii oxigen-reactive
 Surse enzimatice de specii oxigen-reactive

Xantin oxidaza
Hipoxantină + 2O2 Xantină + O2.- + H2O2
NADPH oxidaza
NADPH + O2 NADP+ + O2.-
Amin- oxidaze
R-CH2-NH2 + H2O + O2 R-CHO + NH3 + H2O2
Mieloperoxidaza din fagocite
formarea acizilor hipohalohenaţi
H2O2 + X- + H+ HOX + H2O
Reacţia catalizată de NADH oxidaza
Hb(Mb)-Fe3+ + ROOH Compus I + ROH
Compus I + NADPH NAD· + Compus II
Compus II + NADH NAD· + E-Fe3+
NAD· + O2 NAD+ + O2.-
Aldehid oxidaza
2R-CHO + 2O2 2R-COOH + O2.-
Surse non-enzimatice de specii oxigen-reactive

Fe2+ + O2 Fe3++ O2.-

Hb(Mb)-Fe2+ + O2 Hb(Mb)-Fe3++ O2.-

Catecholamine + O2 Melanin + O2.-

flavine reduse

Leucoflavina + O2 Flavin semichinone + O2.-

Coenzime

Q-hidrochinona + O2 Coenzima Q (ubiquinona) + O2 .-

Tetrahidropterina + 2 O2 Dihidropterina + 2 O2.-

Compuşii xenobiotici- surse de specii oxigen-reactive
Speciile reactive de oxigen se formează
în mod continuu, “lent” şi “în cantităţi
mici”

Generarea lor are loc în cadrul

proceselor fundamentale fiziologice la
care participă celula (care înseamnă
viaţa celulei) (subproduşi metabolici).

Formarea speciilor reactive are loc în

majoritatea compartimentelor
subcelulare.
Schema generală a peroxidării lipidice
 Mecanismul inducerii de către alcool a
peroxidării lipidice
Lewis şi Paton au sugerat implicarea xantin-oxidazei citoplasmatice.
Acetaldehida, primul metabolit al alcoolului, este metabolizată nu numai de
acetaldehid-dehidrogenază, ci şi de xantin-oxidază.

+
De ce există radicali liberi în
organism? Ce fac “bine”?

Sunt metaboliti secundari ai proceselor biochimice

fundamentale si Intervin în lupta anti-bacteriană a
organismului (distrug organismele fagocitate).
Care sunt efectele nocive pe care ROS le produc asupra
organismului?
MECANISMELE LEZĂRILOR CELULARE INDUSE DE SPECIILE REACTIVE DE OXIGEN

LIPIDE
Lipid Oxidation of thiols PROTEINEBaze Schiff
DNA damage DNA GLUCIDE
peroxidation Carbonyl formation

Damage to Ca2+ and Poly ADP Altered gene

other ion transport ribosylation expression
systems
Produşi
Amadori
Membrane Instability to maintain Depletion of ATP
damage normal ion gradients and NAD(P)(H)

Activation/Deactivation of AGEs
various enzyme systems (Produşi finali de glicare
avansată)

Leziune
celulară
Consecinţele peroxidării
lipidice

• Schimbări în structura membranelor

- alterări în fluiditate şi canale ionice
- alterări ale proteinelor de semnal
- creşterea permeabilităţii ionice
• Formarea compuşilor cu legături încrucişate (ex: proteine-ADN)
• Toxicitatea directă a produşilor de peroxidare (ex: 4-hidroxinonenal)
• Distrugerea proceselor de semnalizare dependente de membrană
• Lezarea ADN => aducţi ADN / fragmentări ADN => mutageneză =>
CANCER
 Lezarea membranei celulare

Autooxidarea lipidelor poate conduce la formarea de noi legături C-C, iar

cum lipidele sunt constiutenţi ai membranelor, se observă că acest proces de
“legare încrucişată” poate distruge membrana celulară. Malondialdehida (MDA)
este un produs de peroxidare care facilitează această “legare încrucişată”.
Produşii metastabili formaţi în urma peroxidării lipidice pot atinge şi alte
celule. Astfel peroxidarea lipidică poate produce lezări şi la celulele învecinate ori
alte celule sau ţesuturi care nu sunt direct expuse peroxidării.
PROTEINELE - ţinte ale
acţiunii specilor oxigen-
reactive

• Oxidarea grupărilor tiol (-SH) din proteină=>

• Oxidarea centrilor catalitic activi ale enzimelor => pierderea funcţiei
catalitice (sau funcţie anormală!)
uneori acest fapt determină o activare a enzimei
• Formarea punţilor disulfurice:
- legătură proteină-proteină (RS-SR)
- legătură proteină - GSH (RS-SG)
- alterări ale structurii secundare şi terţiare
- creşterea susceptibilităţii la proteoliză
Produşii de oxidare ai ADN

O NH2 NH2

N N N
HN N N
OH OH
H2N N N N N HO N N
R R H R

8 hidroxi guanina 8 hidroxiadenina 2 hidroxi adenina

O O NH2
CH2OH CH3 H
HN HN OH N OH
OH OH
O N O N
H H O N
H H H
5 hidroximetil uracil 5,6 dihidroxi timidina 5,6 dihidroxi citozina
Oxidarea
dezoxiribozei
(scheletul
ADN)
 O2 .-
1/2 O 2 + H+ Fe2+ R-NO2
SOD
R-NO2.- O2
H2O Fe3+
e + 2H+
ADN mutaţii
H2O
proteine
nitroso R-N = O tioli cancer

e + H+

. • NO are o mare reactivitate şi

radical hidroxilamina R-N = OH participă în lanţul de reacţii
e + H+ alăturat
prin reacţie cu oxigenul •NO
poate să regenereze compusul
R-NH = OH iniţial sau să formeze compuşi
2e + 2H + nitroso (R-N=O), hidroxilamine
şi amine aromatice.
H2O • NO poate fi antrenat în reacţii
amina R-NH2
cu proteine sau cu coenzime
piridinice reduse (NADPH)
Principalele ţinte ale speciilor oxigen reactive

Căi respiratorii
intestin

•OH HOCl
O2•-
H2O2

Inimă şi
Creier vase de
şi nervi sange
Stări patologice caracterizate
printr-o componentă prooxidantă

Hipo-, hiper-
oxigenare;
Reperfuzie
după
Reacţii ischemie Cataractogeneză
imune
Cancerogeneză
Iradiere chimică
demenţa RADICALI Cancer
senilă
LIBERI Diabet
Ateroscleroza
Parkinson
medicamente
reacţii
inflamaţii induse prin
poluare

intracelular Intracelular şi extracelular

extracelular
 AFECŢIUNI CORELATE CU IMPLICAREA
SPECIILOR OXIGEN REACTIVE

AP. RESPIRATOR Displazie bronhopulmonară

Fibroză pulmonară idiopatică
Emfizem
Bronşită cronică
AP. DIGESTIV Astm bronşic

AP. CARDIOVASCULAR

Colite ulcerative Hipertensiune

Maladia Crohn Ateroscleroză
Ulcer gastro-intestinal Vasculite
 AFECŢIUNI CORELATE CU IMPLICAREA
SPECIILOR OXIGEN REACTIVE
Parkinson
SISTEM NERVOS Alzheimer
Ischemii cerebrale
Scleroză multiplă
PIELE

Nefroză autoimună
AP. RENAL
Glomerulonefrite Dermatite
Pigmentări/depigmentări
Pancreatită acută şi cronică Porfirii
PANCREAS
Diabet zaharat

Retinopatii
OCHI Cataractă
 O2 Acceptori de electroni
(vitamina K 3)

O2. - Vitamine C si E
SOD, acceptori de O2. -
(metioninã,cisteinã)
H2O2
CATALAZA, PEROXIDAZE
. OH
Vitamine C si E, Ubichinona
Dehidroepiandrosteronul
ROO . (DHEA)
Fosfolipaze, GSH

R-OOH

Me+n
Metal chelatori (EDTA)
Men+1 DPTA

Etapele principale ale generãrii speciilor reactive ale

oxigenului si actiunea antioxidantilor la diferite nivele
 “Reţeaua” Antioxidantă endogenă depinde de:
- menţinerea statusului catalitic al apărării antioxidante
- statusul energetic celular

• Reducerea catalitică a • Reducerea catalitică a

peroxizilor radicalilor lipidici
Apararea organismului impotriva ROS
 NO
. Lipide

1O
2
.- ADN
O2
 În cursul evoluţiei celula şi-a construit mecanisme endogene de
apărare antioxidantă

• Compartimentarea proceselor metabolice în diversele organite

subcelulare ; se evită întâlnirea dintre biomoleculele care
reacţionează şi care ar determina dezordine celulara.

• Sistemele endogene de protecţie antioxidantă acţionează în trepte,

cu mecanisme biochimice foarte specifice
• Mecanismele biochimice

• 1. Protejarea generării de ROS: chelatarea

ionilor de Fe şi Cu de către proteine specifice
şi nespecifice (feritina, transferina,
albuminele) H. Sies, 1993
• 2. Întreruperea lanţului de formare a ROS:
antioxidanţi endogeni cu masă moleculară
mică: GSH, vit. E şi C, acid uric, etc.
• 3.Neutralizarea ROS: enzimele antioxidante
endogene: SOD, Catalază, G-Px, GR, etc.
• 4. Reparea leziunilor cauzate de ROS:
enzime specifice (reparaze) endonucleaze,
peroxidaze, lipaze, etc.
Antioxidanţii celulari

Antioxidant = o substanţă capabilă, la concentraţii

relativ mici, să concureze cu un alt substrat oxidabil şi
astfel, să inhibe oxidarea altor substrate.
(B. Halliwell & J.M.C. Gutteridge, 1989)

Molecule mici:
• hidrosolubili: glutation, acid uric, ascorbat , (vitamina C)
• liposolubili: -tocoferol (vitamina E),
-caroten, coenzima Q
Proteine (enzime):
• SOD, Glutation peroxidaza, Catalaza, Ceruloplasmina,
Transferina, albumina.
Antioxidanţi enzimatici: SOD, Cat, GPx
Prima linie de apărare antioxidantă

REGLARE prin
e- e- + 2H+ e- + H+ e- + H+ Proteinele senzori
O2 O2.- H2 O2 OH. H2 O celulari ai stresului
oxidativ, care au
capacitatea de a se
O2.- + O2.- + 2H+ H 2 O2 + O2 SOD oxida reversibil la
creşterea numărului
H2O2 + H2O2 2H2O + O2 Catalaza de compuşi oxidanţi

H2O2 + RH2 2H2O + R Peroxidaza SoxR şi OxyR

Reducerea univalentă a moleculei de oxigen şi sistemele de protecţie antioxidantă

 Echilibrul factorilor prooxidanţi/antioxidanţi =
HOMEOSTAZIE REDOX

Enzime:superoxiddismutază,
Glutation peroxidază, Catalază Specii Reactive ale
Antioxidanti ne-enzimatici: Oxigenului: O2•−, H2O2
vitamine (E,A,C), tioli, 1O •OH, HOCl
2
fenoli, ceruloplasmină,
transferină, acid uric,
albumină, etc.
 Astazi, există multe surse noi, artificiale, de radicali liberi, pe
care mecanismele naturale de apărare nu le mai poate stăpâni
(“civilizaţie”).

• Ideea de terapie antioxidantă, este din ce in ce mai bine

conturata, chiar şi în scop preventiv.
Stres redox = Stres oxidativ

Enzime:SOD,GPX,CAT
Antioxidanti neenzimatici:
vitamine (E,A,C), thioli,
acid uric, ceruloplasmina, Specii Reactive ale
transferina, albumina, etc. Oxigenului:
O2•−, H2O2 , 1O2,
•OH, HOCl
Cum putem interveni pentru a sprijini
echilibrarea
BALANŢEI PROOXIDANŢI /
ANTIOXIDANŢI?

• Primul pas: eliminarea pe cât posibil a surselor externe de

radicali liberi (mediu ecologic)
• Al II-lea pas: fortificarea organismului prin prevenţie primară
(dietă+stil de viaţă) şi eventual suplimente alimentare bine
gândite (doză şi combinaţii corecte)
• Al III-lea pas: terapia cu antioxidanţi
• De retinut!
Antioxidanţii pot deveni în anumite condiţii prooxidanţi.
 TERAPIA MODERNĂ CU ANTIOXIDANŢI
Terapia cu antioxidanţi implică stabilirea unor biomarkeri ai stresului oxidativ-
neevidenţiati cu certitudine până în momentul de faţă (status oxidativ)

Inhibitori ai speciilor oxigen reactive

Inhibitori ai NADPH-oxidazei: imidazol, piridină, EDTA, deferoxamină, bilirubină,

deprenil, corticosteroizi

Inhibitori ai xantin-oxidazei: alopurinol, oxipurinol, acid folic

Anticorpi antileucocitari

Sisteme enzimatice protectoare

Superoxiddismutaza (SOD)

Catalaza

Glutationperoxidaza

Lactoperoxidaza
Medicamente ce interferă cu metabolismul fierului şi cuprului
deferoxamină, feritină, transferină, lactoferină, ceruloplasmină,
albumină serică
Antioxidanţi
Vitamine şi analogi (vit. E, vit. C, carotenoide, oxicarotenoide)
Derivaţi fenolici (eugenol, guaiacol, probucol)
Compuşi flavonici (flavonoide, isoflavonoide, ceaiul verde)
Derivaţi indolici (carvedilol, melatonină)
Derivaţi xantinici (alopurinol, oxipurinol, acid uric)
21-amino-steroizi (lazaroide)
Medicamente antiinflamatoare (piroxicam, acid flufenamic, acid
mefenamic, sulindac, fenilbutazonă, indometacin, ibuprofen, acid
acetilsalicilic)
Hipolipemiante (lovastatin)
Proteine (albumină)
Alte medicamente (beta-adrenolitice, anti-H2, acid lipoic)
Inhibitori ai formării anionului superoxid

Antiastmatice (beta-adrenomimetice, corticosteroizi,

metilxantine)
Prostaglandine
Flavonoide
Antibiotice (minociclina)
Antimalarice
Inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei
(ACE)
Dipiridamol
Scavengers (compuşi de epurare sau de
captare a speciilor reactive)

Flavonoide
Vitamine (A, C, E)
Dipiridamol
Pentoxifilină
Antibiotice
Acid uric
Silimarină
Acetil cisteină
Manitol
Lazaroide
Acid lipoic
Melatonină