DETERMINAREA CONŢINUTULUI TOTAL DE ANTOCIANI

METODA PRIN VARIAŢIE DE PH

Culoarea strugurelui şi vinului este dată de o serie de compuşi care, în funcţie de natura şi
proporţia în care se găsesc, diferenţiază soiurile şi vinurile în albe, roze şi roşii. Rolul principal în
definirea culorii vinului îl au taninurile, antocianii (antocianidine glicozilate) şi flavonele. Alături de
acestea, la definirea culorii mai participă şi alte substanţe, nefenolice, cum sunt clorofilele şi
carotenoidele, precum şi melanoidinele şi melaninele.
Antocianii sunt pigmenţi care conferă diferitelor părţi ale plantelor culoarea roşie şi, în funcţie
de pH-ul mediului intracelular şi de prezenţa unor metale, albastră.
Fiind substanţe reducătoare, antocianii sunt foarte sensibili la oxidare. Procesul este favorizat
de enzime, de ionii de cupru şi de fier. Conţinutul antocianilor din struguri este dependent de soi şi de
condiţiile climatice ale anului. Acumularea antocianilor are loc în paralel cu cea a zaharurilor. În anii
foarte favorabili, la un conţinut ridicat în zahăr există şi unul mare în antociani.

Principiul metodei
În mediul acid, există un echilibru între formele colorate şi formele incolore ale antocianilor.
Acest echilibru este în funcţie de pH. Variaţia intensităţii colorante între două valori de pH este
proporţională cu conţinutul de antociani. Se alege pH = 0,6 şi pH = 3,5. Prin această variaţie, funcţia
fenolică nu este afectată şi se admite că ceilalţi compuşi fenolici (taninuri) de asemeni nu interferează
cu determinarea.

Aparatură şi materiale
- spectrofotometru care să permită citiri la 520 nm;
- cuve de sticlă de 5 şi 10 mm;
- baloane cotate de 50 şi 100 cm3;
- vase conice de 50 şi 100 mL,
- pipete gradate şi cotate de 1; 2; 5 şi 10 ml;
- hârtie de filtru.

Reactivi
- soluţie cu pH = 0,6 (soluţie de HCl 2 % (v/v) - 20 mL HCl conc. se dizolvă în 1000 mL apă
distilată);
- soluţie tampon cu pH = 3,5 (tampon citrat-fosfat) preparat astfel:
Într-un balon cotat de 1000 mL se introduc: 151 mL soluţie de fosfat disodic 0,2 M (71,7 g/L
Na2HPO4 · 12 H20 sau 53,65g/L Na2HP04 · 7H20); 349 mL soluţie de acid citric 0,1 M (19,21 g/L
C6H8O7). Se amestecă şi se completează la semn cu apă distilată.
- soluţie alcoolică de 0,1 % HCl (0,1 mL HCl concentrat se amestecă cu 100 mL alcool etilic de 96
% vol (v/v)).

Modul de lucru
În două vase conice de 100 mL se introduc:
 în vasul 1 ce constituie proba:
 1 mL vin
 1 mL soluţie alcoolică de 0,1 % HCl
 10 mL soluţie cu pH = 0,6
Se completează cu apă distilată până la semn şi se omogenizează.

-1-
  în vasul 2 ce constituie martorul:
 1 mL vin
 1 mL soluţie alcoolică de 0,1 % HCl
 10 mL soluţie tampon cu pH = 3,5
Se completează cu apă distilată până la semn şi se omogenizează.

Se măsoară absorbanţa (densitatea optică) la 520 nm atât pentru proba cât şi pentru martor cu
o cuvă de sticlă de 10 nm (l cm) traseu optic în comparaţie cu apă distilată.
Valorile vor fi centralizate într-un tabel de rezultate.

Observaţii:
1. Pentru deblocarea antocianilor din combinaţiile cu bioxidul de sulf se procedează astfel:
 se prepară o soluţie alcoolică de acetaldehidă 10 % (10 mL acetaldehidă c.p. se amestecă cu 90
mL alcool etilic de 96 % vol (v/v)) care se lasă în repaos timp de 1 oră;
 la 20 mL vin de analizat se adaugă 3 mL soluţie alcoolică de acetaldehidă 10 % şi se lasă în
repaos 20 minute;
 se prelevează pentru analiză câte 1 mL de vin tratat ca mai sus, iar valoarea absorbanţelor citite
la spectrofotometru se înmulţeşte cu raportul de diluţie 1,15.
2. Pentru vinurile foarte colorate, se va lucra cu cuve de 2 sau 5 mm, traseu optic.
3. Pentru a se evita erorile de analiză trebuie ca absorbanţele citite să aibă valori cuprinse
între 0,3 şi 0,8.

Calculul şi exprimarea rezultatelor

Exprimarea conţinutului de antociani în mg/L se face cu ajutorul metodei curbei de etalonare
trasată pe baza datelor prezentate în tabelul 2.
Datele din tabelul 1 se înscriu într-un sistem de două axe coordonate astfel (figura 2):
 în abscisă conţinutul de antociani în mg/L;
 în ordonată (coordonată) diferenţa dintre absorbanţele (A520 probă - A520 martor) corespunzătoare
fiecărei concentraţii de antociani.
Unind punctele coorespunzătoare fiecărei perechi de date se obţine curba de etalonare care
este o dreaptă care trece prin originea axelor coordonate.
Ecuaţia acestei drepte este descrisă de ecuaţia de gradul I de forma:

y = 386,15 · x - 1,3713
în care:
y - conţinutul de antociani, mg/L;
x - valoarea diferenţei de absorbantă. (A520 probă - A 520 martor).
Prin raportarea diferenţei de absorbanţă(A520 probă -A520 martor) la curba de etalonare se obţine
conţinutul de antociani, în mg/L. Exemplu:

-2-
 A520 (probă) A520 (martor) Diferenţă A520 probă – Antociani,
A520 martor mg/L
0.082 0.021 0.061 25
0.163 0.037 0.126 50
0.234 0.051 0.183 73
0.543 0.108 0.435 170
0.867 0.173 0.694 270
1.200 0.230 0.970 375
Tabelul 1 - Conţinutul de antociani în funcţie de diferenţa de absorbanţă
(A520 probă - A520 martor)

Antociani, mg/L
Figura 2 – Conţinutul de antociani în funcţie de diferenţa de absorbanţă (A520 probă – A520 martor).

-3-
 DETERMINAREA CULORII PRIN CIELab

Culoarea unui vin este una dintre cele mai importante caracteristici vizuale disponibile pentru
noi. Culoarea este o senzaţie percepută ca rezultat al acţiunii luminii de diferite lungimi de undă
asupra ochiului. Vinul absoarbe o parte din radiațiile de lumină care cade și reflectă alta, care ajunge la
ochii observatorului şi percepe o culoare. De exemplu, senzația de vinuri roșii foarte întunecate este
aproape datorată în mare măsură faptului că radiația incidentă este absorbită de către vin.

Scopul acestei metode spectrofotometrice este definirea procesului de măsurare și calcularea

caracteristicilor cromatice ale vinurilor și altor băuturi derivate din componente tricromatice: X, Y și
Z, în conformitate cu Comisia Internatională de determinare a culorii (Commission Internationale de
l'Eclairage - CIE, 1976), prin încercarea pentru a imita observatori adevărați cu privire la senzațiile lor
de culoare.

Principiu și definiții
Culoarea unui vin poate fi descrisă folosind 3 atribute ale senzației vizuale: tonalitate,
luminozitate și cromatică.
Tonalitatea - culoarea însăși - este cea mai caracteristică: roșu, galben, verde sau albastru.
Luminozitatea este atributul senzației vizuale conform căreia a vinul pare să fie mai mult sau
mai puțin luminos. Cu toate acestea, cromatica, sau nivelul de colorare, este legată de o intensitate mai
mare sau mai mică de culoare. Combinarea acestor trei concepte ne permite să definim multiplele
nuanțele de culoare pe care le prezintă vinurile.
Caracteristicile cromatice ale unui vin sunt definite prin metoda colorimetrică sau coordonatele
cromatice: claritate (L *), componentă de culoare roșu / verde (A*) și componentă de culoare albastră /
galbenă (b *); și prin derivarea sa în magnitudine: croma (C *), ton (H *) și cromacitatea [(a *, b *)
sau (C *, H *)].
Cu alte cuvinte, acest sistem color sau spațial CIELab se bazează pe secvențială sau continuă
reprezentare carteziană a 3 axe ortogonale: L *, A*și b * (Figurile 2 și 3). Coordonatul L * reprezintă
claritatea (L * = 0 negru și L* = 100 incolori), *componentă de culoare verde / roșie (a *> 0 roșu, a *
<0 verde) și b *componentă de culoare albastră / galbenă (b *> 0 galben, b *<0 albastru).

Între lumină şi culoare există o strânsă legătură, în sensul că oricărei radiaţii luminoase îi
corespunde şi o senzaţie de culoare. Numai radiaţiile din spectrul vizibil produc senzaţia de culoare.
Pe scara undelor electromagnetice spectru vizibil este delimitat de valorile 380 - 780 nm, la stânga
acestei zone situându-se radiaţiile ultraviolete, iar la dreapta cele infraroşii.
Lumina albă (spectrul vizibil) poate fi descompusă în grupe de radiaţii care apar ochiului
colorate. Fiecare radiaţie din spectru vizibil, având o anumită lungime de undă, corespunde unei culori
spectrale, de exemplu:
violet 400 - 430 nm
albastru 430 - 485 nm
verde 485 - 575 nm
galben 575 - 585 nm
portocaliu 585 - 610 nm
roşu 610 - 750 nm
O radiaţie care corespunde unei lungimi de undă determinate se numeşte monocromatică.
Factorii care contribuie la formarea culorii sunt:
- distribuţia energiei în iluminarea sub care culoarea este percepută;
- modul în care obiectul colorat modifică această distribuţie;
- mecanismul de transformare a acestei iluminări, transpuse în culoare de către ochiul normal.
-4-
 Iluminantul D, notat cu D65, este un iluminant standard des folosit şi reprezintă o bună
aproximare a luminii diurne luând în consideraţie variaţia luminii de dimineaţă în zori până seara
târziu, variaţia luminii de la un cer albastru până la unul complet acoperit precum şi variaţia de
latitudine.

Claritatea
Simbolul său este L * și este definită în conformitate cu următoarea funcţie matematică:
L*= 116 (Y / Yn)1/3-16 (I)
Direct legate de senzația vizuală de luminozitate.

Componentă de culoare roșie / verde

Simbolul său este un * și este definită în conformitate cu următoarea funcţie matematică:
A*= 500 [(X / Xn) - (Y / Yn)] (I)

Componenta de culoare galben / albastră

Simbolul său este b * și este definită în conformitate cu următoarea funcţie matematică:
b*= 200 - [(Y / Yn)1/3- (Z / Zn)1/3 (I)

Chroma

-5-
Simbolul cromatic este C * și este definită după următoarea funcţie matematică:

Ton
Simbolul de ton este H* și este definită de următoarea funcție matematică:

Diferența de ton între două vinuri

Simbolul este ΔH * și este definit după următoarea funcţie matematică:

Diferența colorimetrică totală între două vinuri

Simbolul este ΔE * și este definit după cum urmează în funcțiile matematice:

MATERIALE NECESARE:
- probă de lucru
- apă distilată
- spectrofotometru care să permită citirea absorbanţei între 300-800 nm cu bec de iluminare D65.
- cuve de sticlă
- pipete

Spectrofotometrul trebuie să fie conectat la un program de calculator în vederea facilitării

calcularea coordonatelor colorimetrice (L * , A* și b * ) și magnitudinilor lor derivate (C * si H* ),
utilizând algoritmi matematici.

MOD DE LUCRU:
1. Se face o diluţie de 1%/2%
2. Citim absorbanţa la spectrofotometru (în cuvă de sticlă)
3. Facem 3 citiri - se notează valoarea cea mai mare (View-Table)
4. Salvăm absorbanţa cu valoarea cea mai mare (Save As..)
5. Selectăm fişierul salvat şi îl transformăm în CSV (EXPORT CSV)
6. Deschidem absorbanţa cu proba analizată (Open - ...), absorbanţa AER-AER şi absorbanţa
APĂ-APĂ.

Proba 1.

DATA HANDLING – CALCULATE 2 – SUB. – Aer-aer – SAME – OK

DATA HANDLING – CALCULATE2 – SUB. – Apa-apa – SAME – OK

DATA HANDLING – CALC 1 – MULTIPL. COEF. – 100(1%)/50 (2%) – SAME – OK

-6-
DATA HANDLING – CALCULATE 1 – SMOOTH

FILE-SAVE AS…

EXPORT CSV – OK

DESCHIDEM CIELAB 76 – selectare spectru – calc. – notăm valorile rezultate

EXEMPLU

-7-
-8-