Diagnostic avansat

Identificare imunologică
Reacții Ag-Ac
• Pot fi folosite pentru detectarea
• antigen necunoscut, cu ajutorul unor anticorpi cunoscuți
(metode directe, pentru detectarea patogenilor din
produse/culturi):
Ag? + Ac > complex imun

• anticorpi necunoscuți, cu ajutorul unor antigene

cunoscute (metode indirecte, serologie, detactarea Ac
din ser):
Ag + Ac? > complex imun
Complexe imune Ag-Ac
• Specificitate
• Un anticorp se leagă specific
(principiu cheie-lacăt) de
antigenul corespunzător
• Este principiu de lucru
pentru toate reacțiile
• teste rapide
• ELISA
• Fluorescență
• Chemiluminiscență
• Electrochemiluminescență
• Western blot
Teste Ag-Ac
• Avantaje
• Detectează componente microbiene (virusuri, bacterii, fungi,
paraziți)
• Funcționează chiar dacă microbii sunt morți sau necultivabili
• Unele sunt rapide, cantitative, extrem de sensibile și specifice
(în special metodele automatizate – ELISA, metode de
fluorescență)
• Dezavantaje
• Metodele automatizate pot fi costisitoare
• Există șanse de reactivitate încrucișată – rezultate fals pozitive
• Rezultate fals negative – fereastră imunologică, titru scăzut
Reacții de detecție Ag
• Detectează componentele microbiene direct din
proba pacientului sau din culturi
• bacterii (capsulă, perete celular, flageli)
• virusuri (proteine capsidale)
• structuri fungice
• structuri parazitare
• oferă un DIAGNOSTIC DIRECT
Reacții de detecție Ac
• Detectează anticorpii din serul pacientului
• IgM – infecții acute
• IgG – infecții cronice, după vindecare, sau după vaccinare
• IgA - în mucoasele tractului respirator și ale sistemului
digestiv, salivă, lapte matern

• Pentru fiecare patogen pot fi mai mult de 1 tip de anticorp!

• ex- anti nucleocapsidă, anti HA, anti spike...

• produc DIAGNOSTIC INDRECT (SEROLOGIC)

• diagnosticul trebuie gândit – interpretarea markerilor în dinamică
• unii Ac cresc, alții nu sunt detectabili încă, alții au fost prezenți, dar au
dispărut în timp, etc…
Teste Ag-Ac
• Teste rapide
• imuno-cromatografice – doar calitative
• HIV, hepatită, gripă, Adenovirus, Rotavirus
• toxine Clostridium, Shigella, Campylobacter, Helicobacter, S.
pneumoniae din urină
• Giardia
• teste de aglutinare din ser (Ac) sau culturi (Ag)
• RPR sifilis
• serotiparea Streptococcus, Salmonella, E. coli, confirmarea
speciilor bacteriene
 Teste Ag-Ac
• Teste rapide
• avantaje
• rapide (5-15 min)
• ieftine (5-20 €)
• sensibilitate foarte bună (>99,5%)
– screening
• pot detecta Ag sau Ac
• pot fi efectuate de orice personal
medical
• dezavantaje
• specificitate variabilă – reacții
încrucișate
• reacții fals pozitive
• teste de Ac – pozitivitatea
depinde de capacitatea
pacientului de a produce Ac
Teste Ag-Ac
• Aglutinare direct din
probă
• avantaje
• rapiditate

• dezavantaje
• doar calitative (sau
semicantitative prin
diluții seriate) • Panel meningită
• limitată la unele boli • RPR, VDRL – sifilis
infecțioase și detectare a • ASLO
markerilor inflamatori • PCR
• Factor reumatoid
 Teste Ag-Ac

Latex aglutinare pentru S. aureus

Aglutinare pe lamă
Teste Ag-Ac
• ELISA
• avantaje
• pot detecta Ac sau Ag
• teste cantitative – pot aprecia
numărul de Ag sau Ac/volum de
probă.
• relativ ieftine (10-15 €)
• fiabile, specificitate foarte bună
(>99,5%) – teste de confirmare
• dezavantaje
• nu foarte rapide (3-6 ore)
• necesită personal antrenat
• sunt cost-eficiente dacă se
prelucrează în număr maxim pe o
placă
• teste de Ac – pozitivitatea
depinde de capacitatea
pacientului de a produce Ac
Imunofluorescența
• Preparatul de examinat se montează
pe lamă.
• Se adaugă
• Ac primari specifici (metoda indirectă)
• Ac specifici marcați (metoda directă).
• În cazul în care în probă se găsesc Ag
corespunzătoare anticorpilor, se
formează complexele imune.
• La metoda indirectă, Ac conjugați cu
fluorocrom se vor lega de Ac primari
• Preparatul se examinează la
microscopul cu fluorescență.
• Puncte fluorescente pe fond întunecat:
în preparatul examinat au fost
prezente antigenele căutate (rezultat
pozitiv).
• Absența punctelor fluorescente: în
preparat nu au fost prezente
antigenele căutate (rezultat negativ).
Identificarea acizilor
nucleici
Extracția acizilor nucleici
Extracția organică
• Cea mai veche metodă
• Omogenizarea probelor în fenol-cloroform (cele două faze nu sunt miscibile)
• Faza inferioară (organică) conține proteine denaturate
• faza superioară mai puțin densă (apoasă) conține acizi nucleici.
• Separarea ADN de ARN
• pH > 7 - atât ARN și ADN se dizolvă în faza apoasă
• pH < 7 – ADN precipită în faza organică, ARN-ul rămâne în faza apoasă - îndepărtată prin
pipetare

• Avantaje
• Gold-standard de extracție
• Metodă simplă, necostisitoare
• Proteinele sunt denaturate rapid, iar ARN-ul este stabilizat rapid.
• Dezavantaje
• Necesită manualitate
• Prelucrarea manuală a probelor poate fi laborioasă.
• Utilizarea deșeurilor chimice periculoase și a deșeurilor organice clorurate trebuie
gestionată cu atenție
Extracția și purificarea prin
coloane
• Metodă de extracție în fază solidă – AN se leagă în coloanele de purificare (filtru de silica).
• Probele sunt lizate într-o soluție tampon care conține inhibitori de RNaze și o concentrație ridicată de
sare chaotropică (rupe legături de hidrogen, creează hidrofobicitate și denaturează proteinele).
• Lizatul este trecut prin membrana de silica prin centrifugare, AN se leagă de membrană la pH-ul
corespunzător
• Membrana care conține proteine reziduale și sare este apoi spălată pentru a elimina impuritățile
• ARN-ul este eluat ulterior cu apă fără RNase.

• Avantaje:
• Procedură simplă, simplă de efectuat.
• Kituri gata de utilizare
• Prelucrare la scară largă și cu debit ridicat, inclusiv metode automate.
• Se poate utiliza prin centrifugare, sau cu sisteme de aspirare prin vid
• Sunt comercializate kituri pentru purificare plasmidică, ADN, ARN
• Executată corect, produce ADN/ARN de calitate excepțională
• Dezavantaje
• Liza sau omogenizarea incompletă a probei poate bloca membrana și/sau duce la contaminarea cu
proteine.
• Liza celulară incompletă poate duce la randamente scăzute.
• Sistemele de automatizare pentru centrifugare sau vid pot fi costisitoare și greu de configurat
Extracția și purificarea prin
coloane
Extracția cu particule magnetice
• Particule paramagnetice învelite cu material silica
• După liza microorganismelor, AN sunt legați se membrana silica
• Particulele magnetice cu AN atașați sunt adunate în proximitatea unui magnet
• După spălări, AN sunt eluați de pe particule

• Avantaje
• automatizare a metodei
• calitate bună și consistență în metoda de extracție
• nu există risc de înfundare
• risc de contaminare încrucișată minim
• reactivii sunt predistribuiți în cartușe închise

• Dezavantaje
• probele vâscoase pot interfera cu migrarea particulelor
• risc de contaminare a AN cu particule magnetice (inhibitori ai PCR)
Liza alcalină – extracție plasmide
• Bacteriile sunt lizate cu o
soluție alcalină pe bază
de NaOH și detergenți
(SDS)
• Resturile bacteriene sunt
neutralizate cu o soluție
acidă si depuse prin
centrifugare
• ADN plasmidic rămâne în
supernatant
• Pentru calitate bună –
purificare pe coloane de
silica
Puritatea și concentrația
ADN/ARN
• Evaluate prin spectrometrie UV-VIS
• Nanodrop – nu distinge între ADN și ARN
• Fluorometru
• moleculele de AN sunt marcate specific cu fluorocromi
• fluorescența (cu intensitate în funcție de concentrația AN) este detectată și raportată la un
standard
• ADN și ARN au absorbanță maximă la 260 nm
• Proteinele au absorbanță maximă la 280 nm
• Alți contaminanți (fenol) absorbanță maximă la 230 nm

• Se verifică rapoartele de puritate, valori ideale fiind

• A260/A230 = 2-2,2
• A260/A280 = 1,8 pentru ADN pur, 2 pentru ARN pur
• valori < 1,8 – contaminare cu protein

• Concentrațiile de AN extras sunt de ordinul ng-μg/μL (eventual sutelor de μg/ μL

în caz de maxiprep)
Identificarea acizilor
nucleici
Identificarea acizilor nucleici
• Include una sau mai multe metode
• extracția și purificarea AN microbieni – etapă
obligatorie, inițială pentru oricare dintre metodele care
urmează

• detectarea unor părți de interes din AN, după

amplificarea lor prealabilă (PCR)
• analiza structurală a AN
• tipizare
• secvențiere
• detectarea unor părți de interes din AN, prin
recunoașterea lor cu sonde specifice (hibridizare)
Aplicații PCR
• Diagnosticul unor infecții microbiene
• Diagnostic genotipic (gene de rezistență, de
virulență)
• Identificare genotipică 16s
• Testarea unor mutații
• Testare prenatală (si screening preimplantare)
• Teste de histocompatibilitate
• Identificare de persoane
PCR
• Polymerase chain reaction (PCR)
• utilizată pentru a produce milioane de copii ale unei ținte
specifice de ADN (o parte specifică a acidului nucleic
microbian)
• cele mai importante variante
• PCR – endpoint PCR
• în cea mai mare parte - scopuri de cercetare
• detectarea genelor de virulență, antibiorezistență
• qPCR – PCR în timp real
• pentru detectarea ADN microbian (bacterii, virusuri ADN, fungi,
paraziți)
• qRT-PCR – în timp real, cu reverstranscripție
• pentru detectarea virusurilor ARN
• pentru cercetare –expresie genică
• multiplex PCR – oricare dintre variantele de mai sus, doar că se
amplifică mai multe ținte deodată
Tipuri de PCR
• Calitativ (endpoint)
• Electoforeza in gel a produșilor de amplificare
• Compararea mărimii moleculare a produșilor cu scara
moleculară
• Confirmarea rezultatului

• Cantitativ (qPCR, real-time PCR)

• Bazat pe metodă de citire a fluorescenței
• Gradul de fluorescență (RFU) este direct proporțional cu
cantitatea de ADN din probă
• Calculul cantității de ADN din probă se face prin extrapolarea
RFU cu o curbă de calibrare standard
Tipuri de PCR
• După numărul de gene identificate
• PCR simplu – o singură genă
• Multiplex PCR – mai multe gene odată
• PCR clasic - Mărimea moleculară a produșilor de amplificare
trebuie să fie diferită
• Real-time PCR – fluorocromi diferiți pentru fiecare tip de
produs amplificat
Tipuri PCR
• În sistem închis
• avantaje
• toți reactivii și consumabilele sunt gata de folosit, dedicate pentru un anumit tip de aparat
• este redusă șansa de contaminare
• interpretare automată a rezultatelor
• dezavantaje
• nu se pot efectua optimizări de metodă
• laboratorul nu are alternativă spre alți reactivi
• interpretare automată a rezultatelor – matematica vs biologie! – rezultatul nu întotdeauna
este în concordanță cu realitatea
• În sistem deschis
• avantaje
• se pot efectua optimizări de metodă
• se pot folosi reactivi universali, de la diferiți producători
• dezavantaje
• necesită personal antrenat
• există risc de contaminare a reactivilor, de alegere a unor kituri improprii
Sistem PCR cu paneluri de
detecție
• Ex.
• Biofire FilmArray
• Genexpert
• Paneluri care conțin toți reactivii
necesari (liofilizați)
• se hidratează reactivii
• se adaugă proba cu soluția de liză
• se execută analiza
• Avantaje
• Rapide
• precise (!contaminare)
• ușor de utilizat de personal neantrenat
în biologie moleculară
• Dezavantaje
• costuri ridicate (1 panel ~100-200 Euro)
teste tip PCR
• avantaje
• detectează cantități foarte mici de acizi nucleici microbieni – 5
GCP/probă
• fiabile, cea mai bună sensibilitate și specificitate (~100% pentru
teste IVD) –confirmarea testelor de diagnostic
• nu depinde de capacitatea pacientului de a produce Ac
• nu este influențată de tratamente adiacente

• dezavantaje
• nu foarte rapide (3-7 ore, inclusiv extracția acizilor nucleici)
• mai scumpe (30-100 €)
• are nevoie de personal instruit și laboratoare dedicate - șanse mari
de rezultate fals pozitive/negative în cazul în care practicile GLP nu
sunt respectate cu strictețe
• detectează forme microbiene neviabile (Reziduuri de ADN/ARN în
proba pacientului)
Principiu PCR

• Cantitatea de ADN se dublează la fiecare ciclu PCR

• În decurs de 1-2 ore se obțin milioane de copii de ADN
Ciclu PCR
Pasul 1: Denaturarea ADN
La 95C, ADN este denaturat (cele 2 catene se separă)

Pasul 2: Alinierea primerilor

La 40- 65C, primerii se leagă în mod complementar de
N=20-40x 2N copii ADN
catena ADN sursă

Pasul 3: ADN polimeraza extinde lanțul de ADN (40 cicluri > 1,09E+12 copii ADN)
La 72C, extensia catenei se face prin adăugarea de
nucleotide spre capătul 3’.
Principiu PCR
Reacția PCR
1980

2000

2015
Mediul de reacție PCR
• Master mix
• Mix nucleotide, polimerază, Mg2+, buffer
• Primer FW
• Primer REV
• H2O Dau specificitatea reacției

• ADN

• Mastermix – compoziție unică – se poate distribui în

mai multe tuburi/godeuri PCR
• Peste mastermix se adaugă individual proba de ADN
• vârfuri cu filtru!
Amplificarea PCR - exemplu
• Denaturare inițială3 min 95°C
• Denaturare 30 sec 95°C
• Aliniere primeri 30 sec 60° 35x
• Elongare 30 sec 72°C
• Elongare finală 10 min 72°C

• timpii și temperaturile trebuie

optimizate pentru fiecare protocol, în
funcție de
• componența primerilor
• produșilor de amplificare
• tipul de polimerază
Alegerea primerilor
• Extrem de importantă
• Singleplex PCR
• mai ușor de utilizat
• Multiplex PCR – precauții suplimentare
• toți primerii – aproximativ aceeași temperatură de topire (Tm)
• pentru endpoint PCR – să producă ampliconi de dimensiuni
diferite, pentru a putea fi diferențiați prin electroforeză
• la qPCR nu este important – aici sondele marcate sunt cele care fac
detecția

Nume Secventa primeri Tm PCR

primer (insert) size
GES-FW GTTTTGCAATGTGCTCAACG 45 371
GES-RV TGCCATAGCAATAGGCGTAG 47
OXA-FW GCGTGGTTAAGGATGAACAC 47 438
OXA-RV CATCAAGTTCAACCCAACCG 47
KPC-FW ATGTCACTGTATCGCCGTCT 49 893
KPC-RV TTTTCAGAGCCTTACTGCCC 48
Primeri

• Mini-secvențe de ADN, complementare și specifice cu

gena/secvența din ADN țintă
• Mărimea primerului – direct proporțională cu specificitatea lui
4 tipuri de baze: A,C,G,T
Probabilitatea ca o bază să se lege complementar de ADN țintă: 0.25 (1/4)

Nr. și ordine nucleotide Probabilitate

A 0.25 = 0.25
A,T 0.25 x 0.25 = 0.0625
A,T,A 0.25 x0.25 x 0.25 = 0.015625
A,T,A,G,G (0.25)5 = 0.0009765
A,T,A,G,G,T,T,T,A,A,C (0.25)11 = 0.000002384
A,T,A,G,G,T,T,T,A,A,C,C,T,G,G,T (0.25)16 = 0.0000000002384

• Șansa unui primer format din min. 16 nucleotide de a se lega

nespecific este foarte mică
Primeri
• Folosirea unui primer specific pentru o anumită genă
microbiană, va da un rezultat PCR pozitiv DOAR dacă acea
genă este prezentă în produsul de testat
• Rezultate fals-pozitive:
• Specii microbiene înrudite
• Contaminare externă
• Primeri cu design greșit
• Specificitate scăzută – greu de diferențiat de rezultatele real pozitive (ex.
temperatura de aliniere prea setată prea mică ca scade specificitatea)
• Dimeri de primeri – ușor de diferențiat de rezultatele real pozitive
• Rezultate fals-negative
• Primeri cu design greșit
• ADN sursă de calitate slabă
• Deficiențe în metoda PCR
Tipuri de primeri
• Pentru
• ADN genomic, plasmidic
• ARN (ADN complementar)
• ARN ribozomal 16s/18s (ADN care codifica ARN
ribozomal)
Design primeri
http://www.ncbi.nlm.nih.gov National Center for Biotechnology Information
Design primeri

Căutare genă
 Design primeri

mecA
>gi|49240382:44919-46925 Staphylococcus aureus subsp. aureus strain MRSA252, complete genome

TTATTCATCTATATCGTATTTTTTATTACCGTTCTCATATAGCTCATCATACACTTTACCTGAGATTTTGGCATTGTAGCTAGCCATTCCTTTATCTTGTACATCTTTAACATTAATAGCCATCATCATGTTTGGATTATCT
TTATCATATGATATAAACCACCCAATTTGTCTGCCAGTTTCTCCTTGTTTCATTTTGAGTTCTGCAGTACCGGATTTGCCAATTAAGTTTGCATAAGATCTATAAATATCTTCTTTATGTGTTTTATTTACGACTTGTTGC
ATACCATCAGTTAATAGATTGATATTTTCTTTGGAAATAATATTTTTCTTCCAAACTTTGTTTTTCGTGTCTTTTAATAAGTGAGGTGCGTTAATATTGCCATTATTTTCTAATGCGCTATAGATTGAAAGGATCTGTAC
TGGGTTAATCAGTATTTCACCTTGTCCGTAACCTGAATCTAATTCGAGTGCTACTCTAGCAAAGAAAATGTTATCTGATGATTCTATTGCTTGTTTTAAGTCGATATTACCATTTACCACTTCATATCTTGTAACGTTGT
AACCACCCCAAGATTTATCTTTTTGCCAACCTTTACCATCGATTTTATAACTTGTTTTAAGCTAATAATATTTCATTATCTAAATTTTTGTTTGAAATTTGAGCATTATAAAATGGATAATCACTTGGTATATCTTCACCA
ACACCTAGTTTTTTCATGCCTTTTTCAAATTTCTTACTGCCTCGTCTAATGTTTTGTTATTTAACCCAATCATTGCTGTTAATATTTTTTGAGTTGAACCTGGTGAAGTTGTAATCTGGAACTTGTTGAGCAGAGGTTCTT
TTTTATCTTCGGTTAATTTATTATATTCTTCGTTACTCATGCCATACATAAATGGATAGACGTCATATGAAGGTGTGCTTACAAGTGCTAATAATTCACCTGTTTGAGGGTGGATAGCAGTACCTGAGCCATAATCATT
TTTCATGTTGTTATAAATACTCTTTTGAACTTTAGCATCAATAGTTAGTTGAATATCTTTGCCATCTTTTTTCTTTTTCTCTATTAATGTATGTGCGATTGTATTGCTATTATCGTCAACGATTGTGACACGATAGCCATC
TTCATGTTGGAGCTTTTTATCGTAAAGTTTTTCGAGTCCCTTTTTACCAATAACTGCATCATCTTTATAGCCTTTATATTCTTTTTGTTTTAATTCTTCAGAGTTAATGGGACCAACATAACCTAATAGATGTGAAGTCGC
TTTTCCTAGAGGATAGTTACGACTTTCTGTTTCATTAGTTGTAAGATGAAATTTTTTTGCGAAATCACTTAAATATTCATCCATTTTTTTAACGGTTTTAAGTGGAACGAAGGTATCATCTTGTACCCAATTTTGATCCA
TTTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGAAATACTTAGTTCTTTAGCGATTGCTTTATAATCTTTTTTAGATACATTCTTTGGAACGATGCCTATCTCATATGCTGTTCCTGTATTGGCCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAAAA
TTTTACCACGTTCTGATTTTAAATTTTCAATATGTATGCTTTGGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGCTATGATCCCAATCTAACTTCCACATACCATCTTCTTTAACAAAATTAAATTGAACGTTGCGATCAATGT
TACCGTAGTTTGTTTTAATTTTATATTGAGCATCTACTCGTTTTTTATTTTTAGATACTTTTTTTATTTTACGATCCTGAATGTTTATATCTTTAACGCCTAAACTATTATATATTTTTATCGGACGTTCAGTCATTTCTACT
TCACCATTATCGCTTTTAGAAATATAACTGCTATCTTTATAAACTTGTTTGAAATTTTTATCTTCAATTGCATCAATAGTATTATTAATTTCTTTATCTTTTGAAGCATAAAAATATATACCAAACCCGACAACTACAACT
ATTAAAATAAGTGGAACAATTTTTATCTTTTTCAT
Design primeri
• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Verificare primeri - calitativ
1C pentru fiecare A/T
2 C pentru fiecare C/G

EF în gel
Verificare primeri – eficiența
• Evaluare prin qPCR, folosind standarde diluate zecimal
• La eficiență de 100%, cantitatea de ampliconi se dublează la fiecare ciclu PCR
• ΔCt (slope) = -3.322
Well Fluor Target Content Sample Ct
A01 SYBR mecA Std-01 1/10 14,12
A02 SYBR mecA Std-02 1/100 18,01
A03 SYBR mecA Std-03 1/1000 21,54
A04 SYBR mecA Std-04 1/10000 24,88
PCR – vizualizarea rezultatelor
• PCR clasic
• Electroforeza produșilor de amplificare
• Detectează prezența ADN amplificat dintr-o probă
• Pemite analiza
• Mărimii moleculare aproximative a produșilor amplificați
• Mărimea exactă: secvențiere
• Purității și calității ADN
• Principiu
• Gruparea fosfat a ADN îi conferă încărcătură negativă
• ADN migrează în gel de agaroză spre anod dacă este supus acțiunii
curentului continuu (100V, 200A)
• Moleculele mari migrează mai greu
• Multiplex PCR
• Mai mulți produși de amplificare (! Mărimea moleculară)
PCR – vizualizarea rezultatelor
Multiplex PCR
 PCR – vizualizarea rezultatelor
• PCR clasic
• Vizualizarea ADN în gel –
colorare
• Bromură de etidiu
• Se intercalează între
catenele ADN
• RISC MUTAGENIC
• Compus fluorescent
• Absorbție maximă:
210-280nm
(radiație UV)
• După excitație:
emisie 605nm
(portocaliu)
• Variante mai puțin toxice
• SYBR green
• GelRed
PCR – vizualizarea rezultatelor
• qPCR
• Citirea fluorescenței în timp
real
• SYBR green
• Intercalat în dublul helix
• Emite fluorescență când este
intercalat
• Fluorescență slabă în stare
liberă
• Taqman probes
• Reporter-Quencher – legate
la capetele 5’ respective 3’
ale unei probe (secvență de
oligonucleotide similare unui
primer)
• Reporter
• Emite fluorescență în
stare liberă
• Quencher
• Inhibă fluorescența
„reporter”-ului
PCR – vizualizarea rezultatelor

• Probe taqman
• Reporter
• FAM
• Design – in funcție de aparatul PCR
• TET • ! Nr. de canale de excitație
• VIC LASER
• Rox • Să nu se suprapună spectrele
• Cy5 de emisie la multiplex-PCR
• Texas Red
• Quencher
• TAMRA
• VIC
• Non-fluorescent (BHQ, QSY)
PCR – vizualizarea rezultatelor
• qPCR
• Curbe de amplificare
• Cu cât cantitatea inițială de ADN
este mai mare, amplificarea și
detectarea se face mai rapid
(după un număr mai mic de cicluri
PCR)
• Evaluarea
• Metoda ΔCT – diferența CT între o
probă de control și proba testată
• Metoda ΔΔ CT – diferența CT între
o probă de control și proba
testată, raportată la un standard
(genă de referință, copy
number/cell)
• Metoda cantitativă – extrapolarea
CT la o curbă standard
Alte aplicații PCR
 Identificarea ARN ribozomal ID bacterii

• Prokariote: 23S, 5S,16S ID fungi

• Eukariote: 28S, 5.8S, 5S, 18S

!! regiuni "conservate", specifice ordinului,

familiei, genului, speciilor

regiunea 16S-23S Intergenic Spacer (ITS) = marker genetic la prokariote

ARN ribozomal
• Secvențierea rARN
• Trasarea gradului de înrudire a microorganismelor
• Arbore genealogic
ARN ribozomal
• 16S/23S rRNA intergenic spacer region (ITS)
• Ex: primeri universali pentru bacterii (degeneraterd primers)

• S926f (5′-CTYAAAKGAATTGACGG-3′)
• L189r (5′-TACTGAGATGYTTMARTTC-3′)

• Sau

• 27F (5’–AGAGTTGATCMTGGCTCAG–3’)
• 1492R (5’–GGTTACCTTGTTACGACTT–3’)
• R = A sau G
• Y = C sau T
• M = A sau C
• K = G sau T
Identificarea ARN mesager
• ARN mesager
• poartă informația genetică către ribozomi
• gradul de expresie genică se răsfrânge în cantitatea de
mARN pentru fiecare genă în parte
• implicit, gradul de expresie genică dictează nivelul de proteine
produse în ribozomi pe matrița mARN
Identificarea ARN mesager
Metode de tipizare
moleculară
Tipizare
• Metodele sunt folosite pentru
• diferențierea diferitelor tulpini bacteriene din cadrul
aceleiași specii
• stabilirea clonalității tulpinilor izolate în context de
epidemie
• identificarea sursei de infecție (anchetă epidemiologică)
• Metodele au putere discriminatorie mare
Profilarea plasmidică
Excizie din gel > analiză

• Etape
• Extracția ADN plasmidic
• Electroforeza în gel de
agaroză
• necesită separare
• gel dens (2-3%)
• timp îndelungat (3-12h)
• voltaj mic (50-60V)
ERIC PCR
IS fingerprinting
• Elemente de inserție
• Similare cu transpozonii, specifice pentru prokariote, DAR:
• Sunt mult mai mici (700-1000 bp), flancate de ITR (inverted terminal
repeats)
• Poartă doar gene necesare pentru transpoziție (nu și gene de
virulență/rezistență)
• Aplicație: IS fingerprinting
• Numărul și compoziția IS este unic pentru fiecare tip de bacterie
• Multiplicarea prin PCR a IS si electroforeza permite diferențierea clonală a
tipurilor bacteriene (gradul de înrudire, similaritate)
PFGE
• Extracția ADN-ului și înglobarea în gel de agaroză
(discuri)
• Digestia ADN-ului cu enzima de restricție
• Electroforeza fragmentelor de macrorestricție în gel
de agaroză, în câmp electric pulsatil
• Colorare cu bromură de etidiu
• Vizualizarea fragmentelor în lumină ultravioletă
MLST- multilocus sequence typing
• permite tipizarea la
nivelul mai multor
locusuri genetice odată.
• are putere
discriminatorie foarte
mare
• permite evidențierea
variațiilor genetice la
nivel de specie
• baze de date cu evidența
geografica a diferitelor
tulpini
http://www.mlst.net/
Metode de hibridizare
Principiu
• fragmente monocatenare
de oligonucleotide marcate
(sonde), având secvență
cunoscută (caracteristică
unui patogen), sunt
marcate cu
• fluorocromi
• elemente chemiluminiscente
• izotopi radioactivi
• sondele se vor atașa pe
baza complementarității de
secvențe complementare
situate pe acizii nucleici ale
microorganismului de
identificat.
Southern blot
• extragerea ADN-ului
• denaturarea chimică a ADN-ului – se obțin
lanțuri monocatenare
• fragmentarea lanțurilor cu enzime de restricție
• acționează în locusuri determinate, rezultând
fragmente de lungime diferită, caracteristice
• separarea electroforetică a fragmentelor în gel
de agaroză
• transferarea pe membrană de nitroceluloză
• adăugarea sondelor marcate cu substanțe
radioactive – atașarea de secvențele
omoloage
• îndepărtarea sondelor în exces, nelegate
• vizualizare prin autoradiografie
FISH - Fluorescence in situ
hybridization
• utilizată pentru vizualizarea microorganismelor direct în
produsul patologic, prin marcarea unor componente
microbiene cu fluorocromi (anticorpi conjugați)
• virusuri și neoplazii induse de virusuri (CMV, HSV, HPV, etc)
• bacterii, fungi, paraziți
• detectare rARN
• mai sensibilă (multe copii în citoplasmă)
• doar la microorganismele vii
• detectare ADN
• doar în nucleu
• este detectat și la microorganismele moarte

• Aplicații clinice:
• identificarea microorganismelor din hemocultură, cost-timp eficient
• identificarea microorganismelor din secreții respiratorii
FISH - Fluorescence in situ
hybridization
DNA microarray
• Poate detecta
expresia a mii de gene
simultan
• Sondele sunt marcate
cu fluorocromi diferiți
• Aplicabilitate:
• determinarea
nivelelor de expresie a
genelor
• determinarea
secvențelor de acizi Bibliotecă de gene (custom)
nucleici
Secvențierea moleculară
Secvențierea moleculară
• determină secvența de nucleotidide a unor
fragmente de ADN
• stabilirea structurii și comparare cu baze de date (BLAST)
– identificare gene
• identificarea unor nucleotide eronate = posibile mutații
• identificarea rARN – identificare microbiană

• cea mai comună – secvențierea Sanger

Secvențierea Sanger
Secvențierea de nouă generație (Next
Generation Sequencing, NGS)
• generează milioane de fragmente scurte de ADN
care acoperă de regulă genomurile aproape în
întregine
• aceste fragmente trebuie puse cap la cap
(asamblate) folosind algoritmi informatici +
biostatistician.
Secvențierea nanopore
• Fragmentul de ADN din PCR trece
printr-un nanopor
• fiecare nucleotidă de ADN blochează
nanoporul într-un unghi diferit
• Cantitatea de curent care trece
printr-un nanopor la un moment dat
depinde de nucleotida (A, C, T sau G)
care obstrucționează deschiderea la
acel moment
• Modificările de curent sunt
înregistrate și traduse
Clonarea moleculară – vectori
virali
• Aplicații
• Cercetare ADN original Fragment de inserat

• Terapie genică Endonuclează

• Vaccinuri Tăierea ADN Ligază

ADN recombinant
SHORT STORY Transfecție în celule > replicare

Virus nou