Cursul 2

Imunologia transplantului in
transplantul renal

Prof. Ileana Constantinescu

 Teste de virusologie

• Atat primitorul cat si donatorul vor fi testati

pentru: VHB, VHD, VHC, HIV 1/2, CMV, EBV, HSV 1 si
2, VZV, HTLV 1/2 , virusul rubella, toxoplasma gondii
si chlamydia

Metode
• Teste de diagnostic indirect (serologic)
• Teste de diagnostic direct, teste de biologie
moleculara (PCR, RT-PCR).
 Potrivirea grupului sangvin

• Atat primitorul cat si donatorul trebuie sa aiba

grup ABO potrivit.
 Imunogenetica
• Scopul tiparii tisulare este de a identifica expresia MHC la suprafata
celulelor. Pentru a obține o imagine completă poate fi necesară mai mult
de o metodă.

• Testarea HLA prin metode de biologie moleculară – PCR

– SSOP- utilizeaza secvente specifice de sonde de hibridizare oligonucleotidice
(rezoluție medie)
– SSP – utilizeaza primeri cu secvență specifică (de înaltă rezoluție)
– SBT – tipizare prin secventiere (allele SEQR -cea mai mare rezoluție
disponibilă)

• Detectarea și identificarea anticorpilor anti-HLA

– AHG CDC
– ELISA
– LUMINEX

• Cross-matching
– CDC
– ELISA
– LUMINEX
Sample of cells or tissue

Combine DNA with sequence-

specific primer fix for each
allele

Amplify by
PCR
 Protocol de testare
• ID proba: 455FM59

Nume Pacient: F.M. – Donator de rinichi (mama) pentru

primitorul F.I.
Data prezentarii: 1/22/2002

Account: admin LiPA HLA-A/v.1.4/001102

Rezultate

Tipizare : A*02 A*24

 Protocol de testare

ID proba: 456FI38
Nume pacient: F.I. – Primitor renal
Data prezentarii : 1/22/2002

Account: admin LiPA HLA-A/v.1.4/001102

Rezultate
Tipizare:

A*02 A*24
 Protocol de testare

ID proba: 455FM59

Nume pacient: F.M.

Data prezentarii : 1/24/2002

Account: admin LiPA HLA-B/v.1.4/001102

Rezultat
Tipizare

B*18 B*35
 Protocol de testare

ID proba: 456FI38

Nume pacient: F.I.

Data prezentarii: 1/24/2002

Account: admin LiPA HLA-B/v.1.4/001102

Rezultat
Tipizare

B*18 B*39
 Protocol de testare

• ID proba: 455FM59

Patient Name: F.M.

Data prezentarii: 1/21/2002

Account: admin LiPA HLA-DRB/v.5.4/001102

Rezultat
Tipizare

DRB1* DRB1*
07 11
 Protocol de testare

ID pacient:456FI38
Nume pacient: FI
Data prezentarii: 1/21/2002

Account: admin LiPA HLA-DRB/v.5.4/001102

Rezultat
Tipizare

DRB1* DRB1*
11 13
 Protocol de testare

ID proba: 455FM59

Nume pacient: F.M.

Data prezentarii: 1/21/2002

Account: admin LiPA HLA-DQB/v.2.6/001102

Rezultat
Tipizare

DQB1* DQB1*
03 03
 Protocol de testare
ID proba: 456FI38

Nume pacient: F.I.

Data prezentarii: 1/21/2002

Account: admin LiPA HLA-DQB/v.2.6/001102

Rezultat
Tipizare

DQB1* DQB1*
03 06
DNA
80 ng for Class I
40 ng for Class II
 Importance of DNA Quality

100 ng Genomic DNA 1% Agarose Gel

Assign-SBT Resolves Ambiguities
Sequences are arranged in “layers”
…Master sequence
Patient result
 HLA SBT
• Rezolva ambiguitățile secvențelor heterozigote
– Alele separate prin SSP-PCR
– Secventierea produsilor PCR hemizigoti
– Rezolvarea ambiguitatilor
– Randament crescut
– Protocoale uniforme
– Reactivi pre-formati
– Toate platformele de secventiere
• Adauga rezoluție tipizarilor obținute prin metode de rezolutie
mai mica (de exemplu SSP, SSOP)
• Folosind rezultatele tipizarii de rezoluție joasă pot fi selectati
reactivii adecvați pentru secventiere
 Detectia anticorpilor anti-HLA
• Screening-ul anticorpilor anti-HLA este important în laboratoarele clinice
de imunogenetica.
• Rezultatul este folosit pentru a determina gradul de alloimunizare
umorala, exprimat ca procent din Panel Reactive Antibody (% PRA).
• Specificitatea anticorpilor poate prezice cu exactitate incompatibilitatea
primitor-donator și riscul de dezvoltare a rejetului cronic al alogrefei.

• Metode:
– AHG – CDC
– ELISA
screening clasa I și clasa a II-a
identificare clasa I și clasa a II
– Luminex
screening clasa I și clasa a II-a
identificare clasa I și clasa a II
 Analiza anticorpilor anti-HLA de clasa I
GTI QuikScreen
• Screening Ab anti-HLA de clasă I
• Pool trombocitar (de la minim
300 donatori)
• Specificitate inalta ( fara
interferență cu clasa a II-a)
• Format flexibil, ușor de utilizat
• Screening de pana la 40 de
probe în 2,5 ore
• software de interpretare
WinScreen
GTI Quik-ID de Clasa I
• Determina specificitatea
anticorpilor anti-HLA de clasă I
• Determina procentul PRA (Panel
Reactive Antibody - % PRA)
• Utilizeaza un panel de antigene
de la 40 de donatori
• Antigene de clasa I solubilizate
de pe trombocite
• Test de captare sensibil
• Software-ul de analiza include si
analiza CREG
 Analiza anticorpilor anti-HLA de clasa II
GTI B-Screen
• Screening Ab anti-HLA de clasă II
• Antigene HLA solubile obtinute
din celule transformate cu EBV
• Format flexibil
• Specificitate inalta (nici o
interferență cu clasa I)
• Screening de pana la 40 de probe
în 2,5 ore
• software de interpretare
WinScreen
GTI Quik-ID clasa II
• Determina specificitatea
anticorpilor anti-HLA de clasă II
• Determina procentul PRA (Panel
Reactive Antibody - % PRA)
• Panel de antigene obtinut din 30
de linii celulare
• Antigene HLA de clasa a II-a
purificate, obtinute din linii
celulare transformate cu EBV
• Test de captare sensibil
• Software-ul de analiza inclus
 IgG IgM B-Screen NAW

Proba pacient 1
Proba pacient 2
Proba pacient 3
Proba pacient 4
Proba pacient 5
Control negativ
Control pozitiv
Godeu blank
 Algoritm de screening ai anticorpilor
• La pacientii noi - screening complet:
Specificitate și PRA prin Luminex
Specificitate și PRA prin ELISA

• Pacientii curenti – pot fi negativi sau pozitivi

 Pacientii negativi sunt retestati lunar sau trimestrial
– Orice pozitivare va fi urmata de identificare a specificitatii
anticorpilor
 Pacientii pozitivi sunt verificati lunar prin ELISA
– Va fi urmarita specificitatea și PRA-ul
– Rezultatele ambigue la ELISA vor fi retestate prin Luminex
 Sistemul de monitorizare al anticorpilor specifici fata
de antigenele donatorului
(Antibody Monitoring System)

• Este un test ELISA conceput pentru detectia anticorpilor de tip

IgG din serul primitorului, reactivi fata de antigene HLA specifice
donatorului.

• Utilizat pentru monitorizarea imunologică, la pacienții cu

transplant, a aloanticorpilor HLA-specifici fata de antigenele HLA
ale donatorilor, anticorpi care pot precipita pierderea precoce a
grefei sau rejetul cronic.
 Monitorizarea imunologica
• Crossmatch retrospectiv
• Crossmatch prospectiv
• Monitorizare imunologica post-transplant

• Detecteaza numai anticorpii anti-HLA donor-specifici

• Este specific pentru anticorpii de tip IgG  nu va detecta
anticorpii IgM (autolimfocitotoxicitate)
• Detectează anticorpii nefixatori de complement
• Detecteaza anticorpii specifici fata de HLA de clasa II chiar în
prezența anticorpilor de clasa I.
 Pasul 1: pregătirea lizatului

durează aproximativ 15 minute după izolarea

celulelor
PREPARAREA LIZATULUI
 Pasul 2: ELISA

Durata: 3 sau 4 ore in functie de numarul de

donatori
 Clasa I Clasa II

Control
negativ

Lysat
Control
Tubusoare
Control cu probe
pozitiv
 Sistemul de monitorizare al anticorpilor
Care sunt beneficiile?
• Utilizeaza 3 seturi de controale:
- Control pozitiv
- Control negativ
- Control pentru lizatul de limfocite
• Lizatul poate fi inghetat la -80 grade pentru o utilizare ulterioara.
• Nici o interferenta cu terapia imunosupresoare
• Distinge intre anticorpii HLA specifici si cei nespecifici fata de antigenele donatorului
• Fara interferente cu protocoalele Iv IG/plasmafereza
• ELISA pe baza de placă de microtitrare
– Pe o placa pot fi analizate până la 44 seruri ale pacienților cu un donator sau 6
donatori cu cate 4 primitori fiecare
– Flexibilitate
– Comoditate - screening-ul pe o singură placuta pentru o varietate de anticorpi
– Formatul placii ELISA se potrivește cititoarelor de microplăci disponibile în comerț
Luminex of antibody identification
 Transplantul de rinichi-pancreas
• Transplant numai de pancreas (Pancreas transplantation alone - PTA)
• Transplantul simultan de pancreas si rinichi (Simultaneous pancreas-
kidney transplantation - SPK)
• Transplantul de pancreas după transplantul de rinichi (Pancreas after
kidney transplantation - PAK)

• Algoritm imunologic:
 Tipizarea HLA: A, B, DRB 1
 anticorpi citotoxici
 crossmatch
 Transplantul insulelor pancreatice

• Celulele Langerhans sunt vizate

• Evaluarea virusologica atât la donator cat și la primitor

• Tipizarea HLA: A, B, DRB 1
• anticorpi citotoxici
• crossmatch
 Transplantul de rinichi la copii
• In mod obisnuit, donatorul este unul dintre parinti

• Grup ABO potrivit

• Tipizare HLA: A, B, DRB 1
• anticorpi citotoxici
• crossmatch
5.5

2010