Examen practic virusologie

luni, 13 ianuarie 2020 15:28

!Etapele diagnosticului de laborator:

1. Orientarea diagnosticului
2. Recoltarea si transportul produsului patologic
3. Directii de diagnostic

!Efecte citopatice:
1. Sincitial
-HIV
-Virusul respirator sinctial
-virusul rujeolos

2. Picnotic-litic
-virusuri poliomielitice
-ECHO
-v. Coxackie

3.

3. Incluzionar
Intracitoplasmatic-virusul rabic, virusul vaccinal

!Incluziunile citoplasmatice din neuronii din cornul lui Amon si neuronii piramidali
din cerebel(corpii Babes Negri)=element patognomonic pentru rabie

Intranuclear:
- acidofil papovavirusuri
-bazofil adenovirusuri-CMV
Mixt- virusuri herpetice, virusul rujeolos

○ ETAPELE DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR IN INFECTIA CU VIRUS RUJEOLOS

1. Orientarea diagnosticului
-suspiciune de rujeola(pojar)
-eritem maculo-papular confluent
-febra si triplu catar(conjunctiva, coriza, tuse)
-semnul Koplick
-complicatii
-complicatii:OTITA MEDIE, PNEUMONIE, PESS(PANENCEFALITA SUBACUTA SCLEROZANTA)

2. Recoltarea si transportul produsului patologic

-exudat nazo-faringian

3. Directii de diagnostic
• IZOLARE VIRALA
-pe cultura de celule=>efect citopatic sincitial+incluzionar mixt
• DIAGNOSTIC DIRECT
• DIAGNOSTIC INDIRECT
-anticorpi specifici IgM

○ ETAPELE DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR IN INFECTIA CU VIRUSUL

RUBEOLOS

1. Orientarea diagnosticului
-suspiciune clinica de rubeola(pojarel)
-rash, febra moderata, adenopatii
-complicatii: atrita, artralgii, purpura trombocitopenica, encefalita

2. Recoltarea si transportul produsului patologic

-exudat nazo-faringian

3. Directii de diagnostic
• IZOLARE VIRALA
-pe cultura de celule=>efect citopatic sincitial+incluzionar mixt
• DIAGNOSTIC DIRECT
• DIAGNOSTIC INDIRECT
-anticorpi specifici IgM

○ ETAPELE DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR IN INFECTIA CU VIRUSUL URLIAN

1. Orientarea diagnosticului
-suspiciune clinica
-parotidita, orhita
-febra, dureri musculare, cefalee
-complicatii:meningita, encefalita orhita, pancreatita, surditate, sterilitate
2. Recolatarea si transportul produsului patologiC
-exudat
3. Directii de diagnostic
• IZOLARE VIRALA-sudii de epidemiologie virala
• DIAGNOSTIC INDIRECT
-serologic-IgM

○ ETAPELE DIAGNOSTICULUI DE LABORATOR IN INFECTIA CU VIRUSURI

GRIPALE

1. Orientarea diagnosticului
-febra cu debut insiduos si durata intre 2 si 5 zile, mialgie, stare generala modificata,
astenie, cefalee
-tuse neproductiva, afectarea clearance-ului pulmonar prin modificaea cililor
-faringita, rinoree
-greata, varsaturi(copii)
!-gripa nu se diagnosticheaza clinic

2. Recoltarea si transportul produsului patologic

*exudat nazofaringian-cu tampoane sterile de la nivelul cornetului nazal inferior, secretii
de la nivelul peretelui posterior al nazofaringelui
-pereti lateri si posterior ai orofaringelui
-se evita atingerea tamponului de limba, obraji, buze

*aspiratul nazofaringian-se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml de

ser fiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub de plastic
*lavaj traheobronsic-se obtine prin bronhoscopie in conditi speciale de catre personal
calificat

3. Directii de diagnostic
• IZOLARE VIRALA-
-pe culturi de celule: ! Virusul gripal este noncitopatogen
-culturi primare de rinichi de maimuta
-linia epiteliala de rinichi de caine
-pe ou de gaina embrionat 9-11 zile inoculat intraamniotic, intraalantoidian

*DEMONSTRAREA PEREZENTEI VIRUSULUI IN OUL DE GAINA EMBRIONAT se face prin

REACTIA DE HEMAGLUTINARE(RHA):
-se foloseste antigen viral=>se realizeaza dilutii binare
-se foloseste ca sistem indicator suspensie de hematii
-se incubeaza la temperatura camerei 30min
-martorul reactiei contine suspensie de hematii
-reactia demonstreaza prezenta virusului hemaglutinant
-titrarea antigenului hemaglutinant

• DIAGNOSTIC DIRECT
*RT-PCR=test molecular
*RIF-test rapid, ieftin, se folosesc anticorpi marcati cu fluorocromi
(Fluoresceina si rhodamina)

! RIF are aplicatii in diagnosticul:

-INFECTIILOR HERPETICE
-GRIPA
-RABIE

• DIAGNOSTIC INDIRECT
-diagnosticul serologic necesita recoltarea de prbe de ser pereche de la acelasi pacient
-nu se practica in mod curent decat in caz de epidemii, pentru diagnostic retrospectiv
-diagnosticul necesita demonstrarea unei cresteri semnificative (De pete 4 ori) a tritului de
anticorpi specifici antivirale intre proba de faza acua, recoltata la o saptamana de la
debutul boliii si cea din convalescenta, recoltata 2-3 saptamni mai tarziu
-metoda preferentiala de evidentiere aaticorpilor antivirali specifici este REACTIA DE
HEMAGLUTINOINHIBAR(RHAI)
-se foloseste antigen viral hem aglutinant
-se folosesc seruri imune de referinta=>se realizeaza dilutii binare
-se incubeaza 60 min la 37 de grade
-se foloseste ca sistem indicator suspensia de hematii

HERPES VIRUSURI
-=virusuri ADN
• Alfa herpesvirusuri
1. HERPES SIMPLEX 1=HH1=HSV1(facial)
2. HERPES SIMPLEX 2=HH2=HSV2(genital)
3. VIRUS VARICELO-ZOSTERIAN

-sediul latenteti este in neuronii senzitivi din radacina postrioara a nervilor spinali si nucleii
senzitivi ai nevilor cranieni

• Beta herpesvirusuri
VIRUS CITOMEGALIC(CMV)
HHV6
HHV7
-sediul latentei este in limfocitul T, monocite, organe solide(rinichi, plamani)
• Gama herpesvirusuri
VIRUSUL EPSTEIN BARR (HHV4)
HHV8(=>sarcomul Kaposi)

-sediul latentei in limfocitul B si endoteliul capilar

○ DIAGNOSTICUL VIRUSOLOGIC IN INFECTIA CU AFLAHERPESVIRUSURI

1. Orientarea diagnosticului

-orientare clinica
-leziuni veziculare in buchet la nivelul comisurii bucale
-gingivostomatita hepetica
-herpes genital
-hepres neonatal

2. Recoltarea prodului patologic+transportul produsului patologic

-lichid vezicular
-tampon conjunctival
-tampoane vaginale
-lavajul cervico-vaginal
-tampon uretral
-recoltare recomandata in caz de leziuni active (50% sanse de izolare virala)

3. Directii de diagnostic

• IZOLARE VIRALA
=diagnostic de electie

Pe culturi de celule=>efect citopatic incluzioar de tip mixt

(Sincitial si incluzionar)
Sincitiu=celule balonizate, multinucleate
Incluzii acidofile=corpi Cowdry A

• DIAGNOSTIC DIRECT
*PCR
-este o metoda mai sensibila de confirmare a diagnosticului de infectie cu HSV
-utila mai ales in detectia infectiei in excretia asimpotmatica, in evaluare riscului
transmiterii HSVin cupluri discordante si in eficienta supresiei replicare virale in
terapie antivirala(encefalica herpetica)
-este considerata ca diagnostic de confirmare si insoteste testele serologice

*RIF directa=imunofluorescenta directa

=test ieftin, repoductiil, ieftin
-produsul patologic se va amprenta direct pe lama, apoi se realizeaza imersie in
acetona
-reactivii trebuie sa fie la temperatura camerei
-apoi se realizeaza incubare cu anticorp fluorescent(=anticorpi monoclonali
marcati cu izotiocianat fluoreseina sau rhodamina)
-spalare
-citire la MO in luminaUV
• DIAGNOSTIC INDIRECT
-teste serologice

○ DIAGNOSTIC IN INFECTIA CU BETAHERPESVIRUSURI CU CMV

1. Orientarea diagnosticului-
2. Recoltarea si transportul produsului patologic-
-lavaj bronhoalveolar
-LCR
-biopsii tisulare
-sange pe anticoagulant
-urina
-lichid amniotic
3. Directii de diagnostic

• IZOLARE VIRALA
-pe culturi de fibroblaste diploide umane
-dupa 2 zile se poate observa efectul citopatic incluzionar mixt (intranuclear si
intracitoplasmatic)
• DIAGNOSTIC DIRECT
*PCR-pentru detectia ADN din CMV din sange pe anticoagulant, lichid amniotic

*RIF-dupa 2 zile se pot detecta antigene timpurii prin RIF directa

-detectia antigenelor pp65 din fractia limfocitara

• DIAGNOSTIC INDIRECT
*ELISA de captura-pentru anticorpii anti CMV IgM
*ELISA cantitativa-pentru evidentierea seroconversiei in anticopri anti CMV IgG pe
probe pereche de ser

Testul de aviditate
-aviditate scazuta=>primoinfectie
-aviditate crescuta=>infectie veche

○ DIAGNOSTIC IN INFECTIA CU GAMA HERPESVIRUSURI

1. Orientarea diagnosticului
2. Recolatarea produsului patologic si transportul
-ser
-biopsie tisulara
-sange integral
3. Directii de diagnostic
• IZOLARE VIRALA

• DIAGNOSTIC DIRECT
*PCR-pentru ADN EBV
• DIAGNOSTIC INDIRECT
*ELISA-anticorpi anti capsidari IgM (anit viral capsid antigen, anti early antigen)
-anticorpi anti nucleari (Ebstein Barr nuclear antigen)
*RIF indirecta
anticorpi anti capsidari IgM (anit viral capsid antigen, anti early antigen)
-anticorpi anti nucleari(Ebstein Barr nuclear antigen)

○ DIAGNOSTIC DE LABORATOR IN INFECTIA CU HIV

1. Orientarea diagnostica
2. Recolatarea si transportul produsului patologice
-sange, secretii genitale
3. Directii de diagnosic
• IZOLARE VIRALA
-efect citopatic sincitial
• DIAGNOSTIC DIRECT
• DIAGNOSTIC INDIRECT

TIPURI DE DIAGNOSTICE INITIALE SI DE CONFIRMARE. SENSIBILITATEA

SI SPECIFICITATEA TESTELOR DE DIAGNOSTIC
SENSIBILITATEA-=probabilitatea ca un test sa fie pozitiv daca persoana este infectata
Testul de detectie a anticorpilor antiHIV are o sensibilitate >>99%
Rezultate fals negative:
○ INFECTIE ACUTA
○ TERAPIE ANTIRETROVIRALA
SPECIFICITATE=probabilitatea ca un test sa fie negativ dac pacientul NU este infectat
Testele initiale penrtu detectia anticorpilor (ELISA) au o specificiate>98%
Testele de confirmare(WESTERN BLOT) au o specificitate>>99%
Rezoltate fals pozitive:
○ ALTE INFECTII ACUTE
○ AFECTIUNI HEMATOLOGICE
○ AFECTIUNI HEPATICE
○ VACCINARI
○ BOLI AUTOIMUNE

• Teste initiale/de triaj/de screening

1. CIA(chemiluminescenta)
2. ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)
-ELISA prima generatie-utilizeaza intreaga particula virala
-ELISA a doua generatie-utilizeaza antigene sau peptide recombinate HIV
-ELISA a treia generatie-detecteaza anticorpi de tip IgM si IgG printr-o ELISA de tip
sandwich
-ELLISA a patra generatie-detecteaza anticoprii antii-HIV si antigenul p24

!ELISA de detectie a anticorpilor antivirali HIV este utilizata prin tehnica indirecta=>ELISA
INDIRECTA PENTRU HIV
-aceasta metoda detecteaza anticorpii din serul pacientului
-se bazeaza pe schimbarea de culoare sau imunofluorescenta

Testul initial ELISA pentru detectia anticorpilor antiHIV are o specificitate>98%

• Teste rapide -de screening

• Teste de confirmare
1. Western Blot
COMPONENTELE TESTULUI:
-substrat enzimatic
-enzima, anticorpi antianticorpii umani
-anticorpii anti HIV din serul pacientului
-antigene HIV de pe testul WB

TEHNICA TESTULUI:

INTERPRETARE:

Testul de confirmare WB(cand teste initiale sunt pozitive) are o specificitate >>99%

2. imunofluorescenta indirecta
3. detectie calitativa/cantitativa de ARN viral

ALGORITM DIAGNOSTIC IN LABORATOR

ALGORITM DE DIAGNOSTIC RAPID

ALGORITM DE DIAGNOSTIC IN INFECTIA ACUTA

○ DIAGNOSTICUL DE LABORATOR IN INFECTIA CU VIRUSURILE HEPATITICE

1. Orientarea diagnosticului
-tablou clinic:
• Durere in cadranul drept superior al abdomenului
• Greata si voma
• Pierderea apetitului
• Icter
• Oboseala
• Mancarime
-markeri biochimici
• Markerii nevrozei hepatice(transaminaze, LDH)
• Markeri de colestaza (FAL, GGT, bilirubina)
• Markeri ai incapacitatii de sinteza la nivel hepatic(proteine serice, colesterol,
trigliceride)
2. Recoltarea si transportul produsului patologic
-sange
3. Directii de diagnostic

• DIAGNOSTIC DIRECT
*ELISA de detectie a antigenelor virale
*molecular realizat pentru:
1. Monitorizarea evolutiei naurale/sun tratament a hepatitei virale. Riscul de
ciroza/CHP creste cu nivelul VL(viral load), atat pentru persoanele AgHBe
negative(=infectie cronica inactiva), cat si pentru cele AgHBe pozitice(=infectie acuta sau
infectie cronica activa)
2. Initiera tratamentului pentru hepatita cronica B pe baza VL, transminazelor
serice. La persoanele AgHBe negative >10000/ml=>infectiva activa
3. Criterii de evaluare a raspunsului la terapia cronica VHB
VIRUSOLOGICE:
○ Mentinera detectabila a ADN-VHB plasmatic
○ Seroconversie sustinuta la pacientii AgHbe pozitivi
○ Eliminarea AgHBs seroconversie antHBs
BIOCHIMICE:
○ Normalizarea sustinuta a nivelului transaminazelor
HISTOLOGICE:
○ Reducerea stadiului de fibroza sau absenta porgresiei
○ Reducera activitatii necro-inflamatorii

○ DIAGNOSTIC DE LABORATOR IN INFECTIA CU PAPIPLOMAVIRUSURI

1. Orientarea diagnosticului
-majoritatea papilomavirusurile produc negi sau papiloame care se remit spontan
-infectia cu HPV afecteaza cel putin 50% din persoanele active sexual
-doar anumite tipuri HPV se pot asocia cu diferite tipuri de cancer in sfera genitala
-exista peste 100 de tipuri, dintre care peste 30 sunt implicate in infectii genitale, iar
in functie de capacitatea oncogena se clasifica in
• “low risk”(LR)-HPV6, HPV 11
• “high risk”(HR)-HPV 16, HPV 18
-nu toate infectiile HPV produc cancer, este nevoie de o infectie persistenta

2. Recoltarea si transportul produsului patologic

—celule cervicale
3. Directii de diagnostic
• IZOLARE VIRALA
• DIAGNOSTIC DIRECT
-genotipare-identificarea subtipului HPV (low risk sau high risk)

! PROFILAXIE PRIN VACCINARE

*vaccin tetravalent(Gardasil/Merck)-anti HPV 6, 11, 16, 18
*vaccin nonavalent(Gardasil nonavalent)
*vaccin bivalent(Cervarix/Glaxo)-antiHPV 16,18

○ DIAGNOSTIC DE LABORATOR IN NEUROVIROZA

1. Orientarea diagnosticului
-suspiciune clinica de meningita virala
-simptome: febra, , cefalee severa si persistenta, redoare de ceafa, durere de ceafa,
fotofobie, grata, varsaturi, faringita exudativa, dureri abdominale
-la sugari si copiii mici semnele principale sunt febra mai mare de 38,5grade asociata cu
iritabilitate si pulsare fontanelei

A. MENINGITA produsa de enterovirusuri

B. ENCEFALITA produsa de
-virusul rabic
-arbovirusuri
-herpesvirusuri HSV1, HSV2, VZV, EBV, CMV
-postinfectios cu virusul rujeolos, virusul urlian, virusul varicelo-zosterian, virusul gripale

2. Recoltarea si transportul produsului patologic

Se recolteaza LCR prin punctie lombara fara investigatii imagistica la pacienti cu

varsta mai mica de 60 de ani, pacient imunocompetent, fara APP de boli ale SNC,
fara convulsii recente(<1 saptamana), cu functie senzoriala si cognitite normale, fara
edem papilar(=edemul nervului optic->se recomanda examenul fundului de ochi),
fara deficite neurologice focale.

3. Directii de diagnostic

MENINGITA-poate fi produsa de enterovirusuri

• IZOLARE VIRALA
-culturi de celule=>efect citopatic picnotic litic

-animale de laborator

• DIAGNOSTIC DIRECT
=detectie rapida
*RT-PCR

• DIAGNOSTIC INDIRECT
-serologie

! Identificarea virusului prin neutralizarea efectului citopatogen prin intermediul reactiei

de seroneutralizare, care are urmatoare etape:
1. Titrarea infectivitatii virale-prin metoda plajelor de liza celulara
-particulele infectioase (=capabile de a realiza un ciclu complet de replicare virala) pot fi
titrate/numarate/identificate prin metoda plajelor de liza celulara

2. Blocarea infectivitatii virale

3. Demonstrarea neutralizarii infectivitatii virale

-reptarea etapei 1 cu amestecuri de antigen anticorp

ENCEFALITA poate fi produsa de West Nile virus, virusul Zika, virusul rabic

West Nile virus

• IZOLARE VIRALA-de la tantari Culex capturati in focare epidemice din Romania
• DIAGNOSTIC DIRECT
-de confirmare RT-PCR
• DIAGNOSTIC INDIRECT
-reactia de seroneutralizare-de confirmare

Virusul Zika
• DIAGNOSTIC DIRECT
-RT-PCR=metoda de electie in acest caz
• DIAGNOSTIC INDIRECT
-diagnostic serologic, cu determinare de anticorpi IgM, IgG este imortant in diagnosticul
infectiei cu arbovirusuri

-RSN

Virusul rabic
• IZOLARE VIRALA-culturi celulare=>efect citopatic incluzionar intracitoplasmatic
acidofil(corpi Negri)
• DIAGNOSTIC DIRECT
*RT-PCR
*IF