Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Analiza solicitata
Semnatura, parafa medicului
Direciile diagnosticului virusologic
1. Izolare virala in:
Culturi de celule
Ou de gaina embrionat
Animal de laborator
Detectia directa a :
Particulelor virale EM , IEM
Metode de concentrare:
ultracentrifugare
difuzia in agar
centrifugare directa pe grila de ME
ANIMAL DE LAB
O.G.E.
CULTURI DE CELULE
AVANTAJE
Infectie naturala
Cost
Sensibilitate buna
/ disponibilitate
DEZAVANTAJE
Cost / etica
Susceptibilitate limitata
Susceptibilitate variabila
Culturi de organ
Culturi de celule dispersate
Culturi primare- pot fi mentinute n vitro timp limitat (3-5 pasaje).
Tulpini celulare pot fi mentinute n vitro timp de 50-60 de pasaje. - Cariotipul cromozomial este cel al
tipului de origine - diploid - ceea ce certific netumorigenitatea culturii
Linii celulare - CELULE TRANSFORMATE
CELULE TRANSFORMATE
1. conin gene implicate n imortalizarea n vitro (cultivare nr. infinit pasaje) modificari cromozomiale =>
cariotip heteroploid
2. se multiplic haotic, cerine nutritive foarte sczute (se multiplic la concentraii foarte sczute de
SFV), glicoliza anaerob = sursa principala de energie)
3. membran celular modificat n compoziie (absena fibronectinei => independente de aderarea la un
suport solid
4. nu au inhibitie de contact, se dispun dezordonat diferit de esutul din care deriv
5. telomeraza activa
6. inoculate la animale, pot reproduce tumora de provenienta
7. modificarea morfologiei
8. au antigene de suprafa diferite codificate de virus sau de celulele gazda=> neoantigene
9. aglutineaz uor cu lectinele (antigene vegetale)
10. modificarea mesagerilor secunzi (AMPc)
Echipament de laborator
Hote cu flux laminar pentru obtinerea, si propagarea culturilor de celule si izolarea virala
TIPURI DE EFECTE CITOPATICE
ECHO)
INCLUZII INTRANUCLEARE
Laringo- traheobronsite
VRS, V.
paragripale
V. gripale
V. gripale,
SARS
Bronsite
Pneumonii
DIAGNOSTICUL DE GRIPA
ETIOLOGIE POSIBILA Produs
IZOLARE
Patologic
V GRIPALE
SNF (ENF) ANF OGE
(A, B, C)
ATB
Culturi
celulare
Dg. DIRECT
=detectie directa
DA PCR
si IF
Dg. INDIRECT
=serologie
DA studii
epidemiolog ice
Produse patologice :
a)Spalatura nazo faringiana (SNF) = Exsudat nazo faringian
Recoltare.
N- tampoane sterile cu coada introduse in cornetul nazal inferior,
secretii de la nivelul peretelui posterior al nazofarinxului.
F - tampon prin cavitatea bucala pentru secretii de pe peretele lateral/posterior al orofaringelui si din orice arie
adiacenta cu inflamatie, exudat sau ulceratie. se evita atingerea tamponului de limba, obraji sau buze pentru
evitarea cotaminarii.
Stocare si transport. optim imediat dupa recoltare (cand nu este posibil: -70 C, cu transport pe zapada carbonica)
Prelucrare.
tamponul sau secretiile recoltate sunt dispuse intr-un tub steril cu circa 15 ml mediu minim o ora, timp necesar
elutiei virusului. centrifugare la 2500 - 15 minute, la 4 C. Supernatantul este indepartat si sedimentul este
resuspendat in 3-4 ml TFS sau mediu. In final depozitul de celule reluat in TFS serveste pentru izolare virala
sau pentru efectuarea de frotiuri ce vor fi testate in imunofluorescenta.
Produse patologice :
a) exsudat nazo faringian
b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in
nari cu o seringa atasata la un tub de plastic.
c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie in conditii speciale de catre personal calificat.
Directii de diagnostic
IZOLARE OGE/ c.c.
DETECTIE RAPIDA RIF / Rt PCR
DIAGNOSTIC SEROLOGIC
Izolare virala diagnostic de electie
1.-culturi primare de rinichi de maimuta rhesus. -linia continua epiteliala de rinichi de caine (MDCK).
2. pe OGE- 9-11 zile, inoculat
intraamniotic
intraalantoidian.
V. GRIPAL ESTE NONCITOPATOGEN!!
Tipuri v gripal: A, B, C
Subtipuri: A(H1N1) , A(H3,N2)
Dupa HA si NA:
16 tipuri de HA
9 tipuri de NA
Demonstrarea izolarii v.gripale pe culturi de celule HEMADSORBTIE
Alfa-herpesvirusuri
Beta-herpesvirusuri
Gamma-herpesvirusuri
Subfamilia
Alfaherpesvirinae
Betaherpesvirinae
Gamaherpesvirinae
Herpesvirusuri umane
Herpes simplex 1
(HSV1-facial) -HH1
Herpes simplex 2
(HSV2-genital) - HH2
Virus varicelo- zosterian (VZV) - HH3
Virus citomegalic
(CMV) -HHV5
Virus Herpetic uman 6 - HHV6 Virus
Herpetic uman 7- HHV7
Virus Epstein Barr
(EBV) - HHV4
HHV8 (asociat sarcomului Kaposi)
Sediul latentei
Neuroni senzitivi din rdcina
posterioar a
nervilor spinali
i nucleii senzitivi ai nervilor
cranieni
Limfocitul
T,
monocite,
organe solide
(plamni, rinichi) +/- epiteliul
glandelor salivare
Limfocitul
B,
endoteliu capilar
Anticorpi monoclonali marcati cu ITC fluoreceina sau rhodamina anti epitopi specifici de la nivelul anvelopei
-gp C si ICP35 (HSV1) =110-120kd
-polipeptide (HSV2) =78-82kd
PCR-metoda mai sensibila de confirmare a dg.
de infectie
cu HSV
util mai ales in:
- detectia infectiei in excretia asimptomatica
- evaluarea riscului transmiterii HSV in cupluri discordante
- eficienta supresiei replicarii virale in terapia antivirala (encefalita herpetica)
Serologia singura
nu
este considerata
ca dg de
confirmare ci se
testelor de
dg.
direct.
alatura
Izolare virala pe culturi de fibroblaste diploide umane / Shell vials (24h). Dupa 2 zile se poate observa
ECP / detecta antigene timpurii prin RIF(pp: lavaj bronhoalveolar; LCR, biopsii tisulare; sange pe
anticoagulant, urina
IF direct
pentru detectia atigenelor pp65 din fractia limfocitara
PCR pentru ADN CMV din sange pe anticoagulant, lichid amniotic
ELISA de captur pentru anticorpi anti CMV IgM; ELISA cantitativa pentru evidentierea
seroconversiei in anticorpi anti CMV IgG pe probe pereche de ser.
SINDROM
ETIOLOGIE POSIBILA
MENINGITA
ASEPTICA
80%-90%
Enterovirusuri
Polio
Cocsackie A si B
E.C.H.O.
10 - 20%
alte virusuri:
VZV
V. URLIAN HSV
CMV
V. PARAGRIPALE
V. Poliomielitice
Paralizie flasca
Distala
Asimetrica
Sensibilitate pastrata
Produs
Patolog
MF SNF
LCR
IZOLARE
De electie
Culturi celulare
Animal de laborator
Dg. DIRECT
=detectie directa
NU
Dg. INDIRECT
=serologie
DA
Produse patologice
Materiile fecale(MF)
Recoltare. Materiile fecale pot fi recoltate ca atare in cantitate de 4-8 grame
sau corespunzator
volumului extremitatii falangei distale a indexului de adult. De asemenea, se pot recolta intr-o solutie 1
M de Mg SO4 (stabilizeaza infectivitatea enterovirusurilor)
Precizari. Este important de notat ca enterovirusurile se excreta saptamani la rand, dar sansele de
izolare scad. Se recomanda recoltarea a 2 - 3 probe de la pacient la interval de 24-48 ore.
Stocare si transport. Produsele patologice sunt transportate si
stocate la 2-4 C.
Prelucrare. In vederea izolarii de virus suspensia de materii fecale se prepara amestecand proba
recoltata cu 15 ml de solutie Hanks si bile de sticla sterile intr-un tub de centrifuga inchis. Se agita
puternic, se centrifugheaza , si se recolteaza supernatantul.
Lichid cefalorahidian (LCR)
Recoltare.
Se realizeaza prin punctie la nivelul L4-L5, cat mai rapid posibil de la debutul
simptomatologiei, inainte de inceperea tratamentului antibiotic, respectand strict masurile de asepsie.
1 ml de LCR este suficient pentru investigatii virusologice. Cantitatea recoltata nu trebuie sa depaseasca
5-6 ml in 3 tuburi sterile. Se determina numarul de celule, proteine totale, glicorahia si presiunea LCR.
Sansa de izolare din acest produs creste cnd participarea meningiana este evidenta. Acest lucru se
traduce prin pleiocitoza (cresterea numarului de celule limfo-monocitare in LCR).
Stocarea. Se pastreaza la 2-4 C, fara adaos de mediu de transport viral.
Transportul. Se realizeaza cat mai rapid posibil. Daca se depaseste 1 ora de la recoltare transportul se
face obligatoriu pe gheata sau la
-70 C.
Exsudat faringian/SNF
Identificarea enterovirusurilor:
REACTIA DE SERONEUTRALIZARE IDENTIFICAREA VIRUSURILOR = VIRUS
NEUTRALIZARE
TITRAREA ANTICORPILOR = REACTIA DE SERONEUTRALIZARE
VIRUSNEUTRALIZARE
VIRUS NECUNOSCUT. ANTICORPI CUNOSCUTI=SER IMUN DE REFERINTA
SERONEUTRALIZARE TITRU DE ANTICORPI NECUNOSCUT VIRUS CUNOSCUT =
TULPINA DE REFERINTA
ETAPE RSN
1. TITRAREA INFECTIVITATII VIRALE
2. BLOCAREA INFECTIVITATII VIRALE
3. DEMONSTRAREA NEUTRALIZARII INFECTIVITATII VIRALE
TITRAREA INFECTIVITATII VIRALE
metoda plajelor
3. DEMONSTRAREA NEUTRALIZARII
INFECTIVITATII VIRALE
= Repetarea etapei 1 cu amestecurile antigenanticorp
ENCEFALITE
SINDROM
ETIOLOGIE
POSIBILA
Prod. Patologic
ENCEFALITA
ACUTA
MENINGOENCEFALITA
ENCEFALOMIELITA
HERPES
VIRUSURI:
HSV1 HSV2
VZV,EBV,CMV
V. RABIC
ARBOVIRUSURI
TOGAVIRUSURI
FLAVIVIRUSURI
BUNYAVIRUSURI
Lichid vezicular
LCR
Biopsie cerebrala
IZOLARE
Culturi
celulare
Animal de
laborator
Saliva,
Culturi
Amprente dermice, celulare
corneene, Biopsie Animal de
cerebrala
laborator
LCR
SANGE
POSTINFECTIOASE SALIVA,
Culturi
V. RUJEOLOS
BIOPSIE
celulare
V. URLIAN
CEREBRALA
V. GRIPALE VZV
LCR
Dg.
DIRECT
=detect.
directa
PCR
IF
Dg. INDIRECT
=serologie
PCR
IF
De electie pt.
ARBO
VIRUSURI
PCR IF
NU
NU
TESTE DE CONFIRMARE
WESTERN BLOT
1. SDS-PAGE
2. BLOT (transfer)
3. DETECTIA ANTICORPILOR
WESTERN BLOT detectia Ac serici
2 env
+
1 gag
No. of
Cycles
Target
1
2
3
4
5
6
20
30
No. Amplicon
Copies of
2
4
8
16
32
64
1,048,576
1,073,741,822
Real-time PCR
sonde moleculare legate cu doua tipuri de molecule-semnal: o molecula fluorescenta (reporter) si una de
intarziere (quenching).
capacitatea de a realiza
simultan amplificarea si
detectia acidului nucleic,
permitand astfel
monitorizarea continua a
reactiei PCR
DETECTIA AMPLICONULUI
complementare
infectia
HIV
Fereastra serologica perioada de la contactul infectant pana la sinteza anticorpilor antiHIV; testele
serologice sunt negative
Nou-nascutii din mame seropozitive HIV toti sunt seropozitivi testele serologice sunt pozitive,
anticorpii materni trec bariera feto- placentara;
doar o parte dintre nou-nascuti fac si infectia HIV (transmiterea materno-fetala a infectiei ~25% sau <<
cu profilaxie).
Initierea si monitorizarea terapiei antiretrovirale
Diagnostic V.H.B.
Diagnostic V.H.A.
EVOLUTIA MARKERI DE INFECTIE VHA
HEPATITA A NU CRONICIZEAZA!!